全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

摘要

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。

摘要

CRISPR-Cas9 系统已被开发并改造为一种强大的基因组编辑工具。利用该技术，研究人员能够精确地在活细胞内对 DNA 序列进行切割、拼接，甚至重写。然而，CRISPR 筛选技术的应用远不止于基础实验。它在对抗遗传性疾病方面发挥着关键作用，可系统性地解析复杂的遗传图谱，帮助研究人员揭示生物学现象背后的分子机制，并使科学家能够识别和靶向癌症、囊性纤维化及镰状细胞贫血等疾病的根本病因。其中，癌症对医学界构成了严峻挑战，推动着根除疾病的持续努力。放射治疗作为一种传统疗法虽具疗效，但存在局限性：它在清除癌细胞的同时也会损伤健康组织，导致不良反应，降低患者生活质量。此外，并非所有癌细胞都对放疗有反应，部分细胞可能产生耐受性，从而加重病情。为应对这一问题，本研究引入了一种全面的全基因组 CRISPR 筛选技术，该技术可高效鉴定与放射敏感性和放射抗性相关的基因，进而推动癌症研究与治疗领域的发展。根据所述方案，研究人员在经照射处理的肺腺癌细胞中开展了全基因组范围的 CRISPR 筛选，成功鉴定了与放射抗性和放射敏感性相关的一系列基因。

引言

生物现象的研究本质上与细胞行为的研究密切相关，而细胞行为的研究又从根本上关联着基因组的探索。随着现代技术的不断发展，医学研究人员正逐步将注意力转向调控细胞行为 通过 基因编辑旨在提升多种疾病的治疗效果。在此领域，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术因其相对简便的应用而成为基因组编辑的革命性工具¹CRISPR-Cas9 系统由 Cas9 核酸酶和单导向 RNA（sgRNA）组成，sgRNA 可特异性识别并结合靶标 DNA 序列，引导 Cas9 核酸酶在该位置进行切割，从而导致基因组 DNA 产生双链断裂（DSB）。^2,3,4此外，引入其他物质可导致基因组发生特异性的插入、缺失或突变，从而实现靶向基因编辑。

在功能基因组学研究中，RNA干扰（RNAi）筛选曾是用于开展大规模基因功能缺失实验、研究基因在癌症中作用的常用方法。RNAi技术通过特异性沉默目标基因来研究基因功能，帮助研究人员鉴定关键的致癌因子。然而，该技术受限于脱靶效应和基因敲低效率不完全的问题。脱靶效应可能导致非目标基因被意外沉默，从而影响实验结果的准确性和可靠性^1,

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 选择合适的辐射剂量

1. 贴壁细胞的制备与接种
   1. 使用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640完全培养基将细胞密度调整为每毫升5 × 10⁵个细胞，用于传代和细胞生长。将细胞分装至3.5 cm培养皿中，用于接受不同剂量的辐射处理。每皿加入2 mL细胞悬液（含1 × 10⁶个细胞），于37 °C、5% CO₂条件下培养过夜。
2. 施加不同辐射剂量
   1. 将3.5 cm培养皿编号为1至5号。第1组作为对照组，其余4组设为处理组。
   2. 用封口膜密封6孔板边缘，对处理组分别施加2、4、6和8 Gy的辐射剂量。处理完成后，将培养皿放回培养箱中继续培养。
3. 辐射后细胞系的接种
   1. 准备6孔板和96孔板。用PBS洗涤3.5 cm培养皿中的细胞一次，使用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，并用含10% FBS的RPMI 1640完全培养基将细胞密度调整为每毫升1 × 10⁵个细胞。
   2. 按每孔10 µL（即每100 µL含1,000个细胞）接种至6孔板中，每个辐射剂量设3个重复。每孔....

结果

肺癌是病死率最高的恶性肿瘤，是一种高度侵袭性且高发的疾病。以肺癌细胞系 A549 为例，在放射照射作为筛选条件的情况下开展全基因组 CRISPR 筛选，其示意图流程见图1。首先，通过克隆形成实验和 CCK8 实验检测 A549 细胞对不同剂量辐射的敏感性（图2）。在克隆形成实验中，2 Gy 组的克隆数为 140 ± 5.35，而 0 Gy 组为 303 ± 31.63；在 CCK-8 实验中，2 Gy 组的光密度（OD）值为 0.65 ± 0.05，而 0 Gy 组为 1.35 ± 0.08。为研究辐射敏感性和抗辐射相关的候选基因，选择 2 Gy（IC50）作为后续的照射剂量。对 A549 细胞使用不同浓度的嘌呤霉素处理，并在 72 小时后进行计数。检测发现 A549 细胞的嘌呤霉素最低致死浓度为 1 µM（图3）。以不同梯度的 MOI 值感染 A549 细胞，感染 72 小时后通过荧光显微镜观察感染效率，并在嘌呤霉素处理前后分别计数，获得感染效率约为 0.3.......

讨论

作为一种前沿的基因编辑技术，CRISPR 筛选已在科学研究领域引发深刻变革⁵。该技术源于 CRISPR-Cas9 系统，因其高效性和精确性，已成为研究基因功能不可或缺的工具⁹。CRISPR/Cas9 的工程化原理是设计并引入约含 20 个核苷酸的特异性 sgRNA，引导 Cas9 核酸酶精确定位并切割目标 DNA 序列，从而实现基因敲除、激活或抑制等基因编辑操作⁶。这一原理推动了高通量、可定制的 CRISPR 筛选技术的发展。通过构建包含大量 sgRNA 的文库，研究人员可同时对多个基因进行编辑和筛选，快速鉴定出与特定表型或疾病状态相关的基因。此外，CRISPR 筛选可在多种细胞类型、组织乃至完整生物体中开展实验，有助于更全面地理解基因功能及其作用机制。

随着技术的快速发展，CRISPR 筛选在多个领域展现出巨大的应用潜力。例如，CRISPR 筛选可帮助科学家发现新的药物靶点，从而加速药物研发进程。在疾病研究中，该技术揭示了疾病发病机制，为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
150 mm 细胞和组织培养皿	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	715011	细胞培养
35 mm 细胞和组织培养皿	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	706011	细胞培养
A549 细胞系	ATCC	-	-
细胞计数试剂盒-8	上海碧云天生物技术股份有限公司	C0041	用于细胞活力检测
CO2-非依赖性培养基	PHCbi	MCO-50AIC	细胞培养
Countess 3 FL 全自动细胞计数仪	Thermo Scientific	AMQAF2001	用于细胞计数
EDTA	Gibco	25200056	细胞培养
胎牛血清	Gibco	10099141	细胞培养
荧光显微镜	LEICA	ebq 100-04	用于荧光显微观察
全基因组CRISPR慢病毒文库	上海欧易生物科技股份有限公司	H5070	用于慢病毒感染
MiniAmp plus PCR仪	Thermo Scientific	C37835	用于PCR扩增
NEST 细胞培养板，12孔	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	712002	细胞培养
NEST 细胞培养板，6孔	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	703002	细胞培养
NEST 细胞培养板，96孔	Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.	701001	细胞培养
PBS	Gibco	C10010500BT	细胞培养
PCR 正向引物 (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)	北京奥科鼎盛生物科技有限公司	-	用于PCR扩增
PCR 反向引物 (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)	北京奥科鼎盛生物科技有限公司	-	用于PCR扩增
Polybrene	上海碧云天生物技术股份有限公司	C0351	用于慢病毒感染
嘌呤霉素	MCE	HY-K1057	用于慢病毒感染后筛选
RPMI 1640 细胞培养基	Gibco	23400-021	细胞培养
天根基因组DNA提取试剂盒	北京天根生化科技有限公司	DP304	用于基因组DNA提取
X射线粉末衍射仪	PerkinElmer		用于放射治疗