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方法文章

通过整合层状多通道电极、光遗传学与微阵列皮层电图在啮齿类动物中进行皮层处理的多尺度研究

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DOI：

10.3791/67983

⸱

2025年5月23日

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, UC Berkeley, 2Biological Systems and Engineering Division, Lawrence Berkeley National Lab, 3Helen Wills Neuroscience Institute, UC Berkeley, 4Redwood Center for Theoretical Neuroscience, UC Berkeley, 5Scientific Data Division, Lawrence Berkeley National Lab

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了在大鼠和小鼠中进行高密度微电皮层记录（µEcoG）的两种方案，包括手术、植入和记录方法。µEcoG记录分别与大鼠听觉皮层的层状多通道电极记录或小鼠体感皮层的光遗传学神经活动操控相结合进行。

摘要

皮层脑电图（ECoG）是连接基础神经科学与理解人类大脑在健康和疾病状态下功能的方法学桥梁。ECoG能够以毫秒级的时间分辨率和柱状空间分辨率，直接从大脑皮层表面同步记录大范围皮层组织的神经生理信号，因而特别适用于研究局部及分布式的皮层计算过程。本文中，我们描述了定制高密度微电极皮层脑电图（µECoG）装置的设计及其在两种实验操作中的应用。这些电极阵列包含128个低阻抗电极，电极间距为200 µm，制作于带有电极间穿孔的透明聚合物基底上；这些特性使得µECoG记录可与层析多通道电极记录及光遗传学操控同时进行。首先，我们介绍一种在小鼠胡须体感皮层上进行硬膜外µECoG记录，并结合对特定基因定义的皮层细胞类型进行光遗传学操控的联合实验方案。该方法可因果性地解析不同神经元群体在感觉信息处理中的独特作用，同时监测其在µECoG信号中的特异性表征。其次，我们介绍一种在大鼠听觉皮层上使用µECoG阵列和层析多通道电极进行急性神经活动记录的实验方案。该方法可实现对皮层表面感觉诱发神经反应的精细拓扑映射，同时记录分布在皮层不同深度的多个神经元单元的活动。这些实验方案有助于研究分布式皮层活动的特征，并可能为多种神经系统疾病的理解及最终干预提供贡献。

引言

感觉、认知和行为背后的脑功能在广阔的空间和时间尺度上组织并分布，从单个神经元的放电活动，到皮层柱中神经元群体产生的电场，再到不同脑区间皮层柱的拓扑结构（例如体感皮层中的躯体定位、初级听觉皮层中的音调定位）。理解脑功能需要在这些空间尺度上感知电信号1。目前神经科学领域已有多种广泛应用的方法用于监测脑活动。在电生理学方面，层状多通道电极（如Neuropixels）能够以高时间分辨率（≥1 kHz）记录少量（约300个）单个神经元的活动，通常局限于少数几个空间上相距较远的皮层柱。钙离子（Ca2+）成像可在约1–2 mm的空间范围内，以较低的时间分辨率（约10 Hz）监测中等至大量经遗传和解剖学明确识别的单个神经元2。功能性磁共振成像（fMRI）可在全脑范围内以极低的时间分辨率（约0.2 Hz）监测大量神经元（每36 mm3体积内约100万个神经元）的代谢状态。脑电图（EEG）/脑磁图（MEG）则以中等时间分辨率（<100 Hz）和极低空间分辨率（厘米级）监测整个大脑皮层表面或全脑的电活动3。尽管上述每种方法都为理解脑功能提供了基础性且互补的重要见解，但能够在大范围皮层区域中，从精确的解剖位置以高时间分辨率直接感知电生理信号的技术仍处于发展初期。由于神经元功能在皮层表面方向上的变化远比在深度方向上显著，因此对广泛空间覆盖的需求尤为突出4。

皮层电图（Electrocorticography, ECoG）是一种将低阻抗电极阵列植入大脑表面，以记录或刺激皮层活动的方法1,5。ECoG 通常用于人类神经外科临床环境中，作为药物难治性癫痫治疗前评估的一部分。然而，它也能提供关于人类大脑皮层分布式处理的独特见解，例如言语和感觉拓扑映射6,7。这些能力推动了其在动物模型（包括猴子、大鼠和小鼠）中的应用5,8,9,10,11。在啮齿类动物中，最近研究表明，微皮层电图（micro-ECoG, µECoG）能够以高时间分辨率（约 100 Hz）直接电记录神经元群体活动，同时具备柱状空间分辨率（约 200 µm）和广泛的空间覆盖范围（数毫米）。µECoG 使研究人员能够在动物模型中研究与复杂感觉处理、认知功能和运动行为相关的分布式神经动力学12,13。近年来的技术进展已将 µECoG 与光遗传学及层析多通道电极记录相结合14,15,16,17,18,19,20，从而实现对皮层网络的多尺度研究，弥合了微观神经元活动与宏观皮层动力学之间的鸿沟21,22。关键的是，由于 µECoG 信号在人类与非人动物模型中高度相似，使用 µECoG 可使来自动物模型的研究结果向人类的转化更为直接23。因此，整合性研究方法对于深入理解神经环路至关重要，并有望为神经系统疾病的新型治疗干预手段的开发提供支持5,24,25。

因此，迫切需要将高密度微皮层脑电图（µECoG）阵列与层析记录及光遗传学工具相结合的实验方案，以实现对皮层信息处理的全面多尺度研究8,26为解决这一技术空白，我们开发了定制的µECoG装置，其特征是在柔性透明聚合物基底（聚对二氯苯和聚酰亚胺）上集成128个低阻抗电极，电极直径为40 µm，电极间距为20 µm，电极之间设有穿孔结构，可实现µECoG与层析多通道电极记录的同时进行，并兼容光遗传学操控13,22本实验方案的关键要素包括：（i）通过高密度 µECoG 阵列实现对皮层活动的柱状空间分辨率和大范围覆盖；（ii）利用穿过 µECoG 网格插入的层状多通道电极，实现对多个皮层层次的同步记录；（iii）结合光遗传学技术，选择性激活或抑制特定神经元群体，从而实现对神经环路的因果性解析。27,28,29高密度配置能够实现高空间分辨率的记录，有效提供一种 "柱状视图" 皮层活动，因为先前的研究表明，µECoG信号能够分辨出空间尺度接近啮齿类动物皮层柱直径（约20 µm）的神经活动11该整合方法可实现对神经活动的同步多尺度监测与调控，有望开展因果性实验，以确定µECoG信号的神经元来源及其在皮层中的分布式信息处理机制。为实现上述目标，本文提供了高密度µECoG阵列在两种组合配置下的详细操作流程。

首先，我们描述了结合操控小鼠初级躯体感觉皮层（S1）中第5层（L5）锥体细胞的µECoG技术。在小鼠中，由于开颅手术难以实施硬脑膜切开，µECoG阵列被置于硬脑膜外。一根光纤被放置在阵列上方，或与透镜组合，以将光遗传学刺激的光聚焦于皮层表面的小范围目标区域。此处所述的光遗传学策略用于抑制第5层兴奋性神经元，但只要具备相应的、特异性表达Cre的转基因小鼠品系，该方法可轻松适配于任意神经元群体。其次，我们描述了将µECoG与硅基层状多通道电极（laminar polytrodes）联合使用，以同时记录大鼠听觉皮层（A1）的皮层表面电位（CSEPs）以及跨皮层层级多个神经元的单细胞放电活动。该阵列在电极之间设有穿孔，允许多通道层状电极穿过网格插入，从而记录不同皮层层级的神经活动。在开颅手术过程中，µECoG阵列被置于听觉皮层的硬脑膜下，而层状电极则通过穿孔插入。来自µECoG和层状探针的神经信号被同时记录，分别以6 kHz和24 kHz的采样率，通过光学连接至数字信号处理器的放大系统进行采集。

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方案

两种方案均遵循相同的关键步骤（麻醉、固定、开颅、µECoG记录），但在细节上存在显著差异。在下文描述中，共用步骤已合并叙述，各方案的特异性部分则予以标注。以下步骤分别对应与光遗传学结合的µECoG记录（小鼠）或与层状探针结合的µECoG记录（大鼠）。此处描述的所有操作均符合当地伦理或法律法规（IACUC或伦理委员会）的要求，所使用的药物可能因获批的伦理方案不同而有所差异。

1. 小鼠和大鼠实验的准备与操作规程

  1. 小鼠与大鼠实验方案之间的显著差异
    1. 手术与电生理记录的装置设置
      1. 对于大鼠，在手术和电生理记录过程中使用相同的装置设置。
      2. 对于小鼠，在第一套装置中进行手术，在第二套装置中进行电生理记录。
    2. 头部固定
      1. 对于大鼠，在手术和电生理记录中使用相同的鼻夹。
      2. 对于小鼠，在手术中使用鼻夹，而在电生理记录装置中使用外部金属头杆，以便在轻度异氟烷麻醉下实现固定。将头杆用牙科水泥粘附于颅骨上进行植入。
    3. 记录装置：为两种物种使用不同的数据采集电子设备、记录软件和感觉刺激软件。
      1. 在小鼠实验方案中，使用 SpikeGadgets 系统（https://spikegadgets.com）和开源的 Trodes 软件（https://spikegadgets.com/trodes/）进行数据采集。
      2. 在大鼠实验方案中，使用记录软件 Synapse - Neurophysiology Suite（https://www.tdt.com/component/synapse-software/）进行数据采集。
    4. 通过注射（大鼠）或吸入（小鼠）诱导麻醉。
    5. 记录位置
      1. 对小鼠，在体感皮层（S1）进行记录。
      2. 对大鼠，在初级听觉皮层（A1）进行记录。
        注意：这种解剖定位的差异要求每种物种采用不同的开颅部位。
  2. 网格的准备与测试
    1. 将网格（不包括连接板）浸泡在稀释的酶性洗涤剂中（50% 洗涤剂，50% 蒸馏水），至少 1 小时。
    2. 将其转移至纯蒸馏水浴中，并在安全、洁净的环境中自然晾干。
    3. 在 µECoG 装置的初始准备阶段进行铂黑电极沉积，而非每次记录前都进行。
      注意：一旦沉积完成，铂黑涂层会形成一层稳定的膜，可在多次记录中保持有效，但应通过定期阻抗测试监测其性能。铂黑电极沉积（目标范围为 1 kHz 时 10–20 kΩ）可降低电极阻抗，并提高神经记录中的信噪比。
    4. 进行电极沉积时，配制氯铂酸溶液（通常为 1–3% 氯铂酸 [H2PtCl6]），并加入少量乙酸铅（约 0.005%）作为沉积调节剂。将 µECoG 电极连接为三电极电化学池中的工作电极，以铂对电极和 Ag/AgCl 参比电极组成系统。
    5. 施加约 -0.5 至 -2 mA/cm² 的恒定电流密度，持续 10–30 秒，同时监测阻抗值。
    6. 测试并记录网格电极的阻抗（例如，使用 Nano-Z）。
    7. 在光源下检查网格，并将其准备用于术后记录。
  3. 参考电极导线焊接
    1. 对于小鼠，将一根银丝（10 mm 长，30 G）的一端焊接到金针上，用于连接记录系统的参考导联。

2. 手术

  1. 材料准备与常规监测（动物护理与记录）
    1. 准备：使用适当的消毒剂彻底清洁和消毒手术区域。确保所有手术器械均已灭菌，通常使用高压灭菌器进行灭菌。
    2. 手术器械摆放：将手术器械放置在无菌手术垫上。在手术区域备好棉签和吸水棉制手术三角巾。将任何生物危害性废弃物丢弃至专用的废弃物处理袋中。
    3. 温度调节：打开手术和电生理记录区域的加热垫。在整个手术和记录过程中控制加热垫的温度。
    4. 手术垫：将蓝色手术垫或毯子铺在温度调节床上。
      注意：该垫子应具有柔软的白色棉质底层，使用时应朝上。
    5. 显微镜定位：将显微镜及其附带的照明装置（如LED环形灯）放置在手术区域一侧。检查其是否正常工作。
    6. 手术钻准备：为开颅手术准备手术钻。
    7. 氧气供应：将氧气瓶流量调节至1.0 L/min（大鼠）或0.5 L/min（小鼠），并将氧气面罩置于调节垫附近。动物在麻醉后需要持续供氧。
    8. 液体补充：手术过程中，应补充任何丢失的液体，补充量至少达到动物体重的1.5%（小鼠）或每小时1 mL（大鼠）。据此配制等渗溶液。
    9. 动物：根据批准的程序，将动物从动物房转移至手术室。使用8至16周龄的C57Bl6背景小鼠，性别不限；同样，使用7周龄的Sprague Dawley品系雄性大鼠。
    10. 药物准备：使用精度为0.1 g的天平称量动物体重。根据手术需要准备适量的药物，必要时使用预先稀释的溶液。
  2. 麻醉诱导
    1. 小鼠麻醉诱导
      1. 将动物放入异氟烷诱导室（0.5 L/min 氧气中含 3-5% 异氟烷）2).
      2. 确认深度麻醉后（尾部或脚趾夹捏无反射），将动物置于手术加热垫上并固定头部。
      3. 皮下注射用于常规镇痛的药物：美洛昔康（Meloxicam）：5 mg/kg，布托啡诺（Buprenorphine）：0.1 mg/kg。
      4. 按照步骤 2.2.1.5-2.2.1.6 固定小鼠头部。
      5. 将动物的吻部放入麻醉面罩中，头部松散地固定在头架内。将小鼠放置于咬合杆上时，首先确保舌头位于杆的下方，且未夹在杆与口腔顶部之间；必要时可用镊子调整舌头位置。
      6. 将动物的门齿插入咬杆上的孔洞中。固定小鼠麻醉面罩（0.5 L/min 氧气中含 1.5–2% 异氟烷）2通过轻轻拧紧固定螺丝来实现。手术期间头部的稳定仅由咬合杆来确保。
      7. 使用石油基眼药膏或润滑剂保护动物的眼睛，以防手术过程中眼睛干涩。
      8. 通过面罩持续输送异氟烷，以在整个手术过程中维持麻醉状态。
    2. 大鼠的麻醉诱导
      1. 最初使用异氟烷使动物镇静，以方便诱导麻醉剂的注射。
      2. 给予麻醉和镇痛药物：
        美洛昔康：剂量为 5 mg/kg，浓度 10 mg/mL，0.4 mL/kg
        氯胺酮：剂量 90 mg/kg，浓度 100 mg/mL，0.9 mL/kg
        ​赛拉嗪：剂量为10 mg/kg，浓度为100 mg/mL，给药体积为0.1 mL/kg
      3. 根据动物的体重和年龄，使其在15-30分钟内达到深度麻醉状态。
    3. 麻醉监测
      1. 在整个操作过程中持续监测动物的生命体征（呼吸频率）。呼吸频率是反映麻醉状态早期变化的特别有用指标，若呼吸频率发生改变，应及时调整麻醉深度。
      2. 足底回缩反射是麻醉状态的关键指标。应定期检测该反射，因其完全消失可确保麻醉深度达到手术要求水平。
  3. 头部固定与生命体征监测
    1. 动物生命体征监测
      1. 在实验记录表上检查并记录动物的生命体征。若动物的反射（如足部回缩）未完全消失，可追加半剂量的补充氯胺酮（大鼠），或以0.5%为增量逐步提高异氟烷浓度（小鼠）。
    2. 大鼠头部固定
      1. 待大鼠完全麻醉（无足底或尾部反射）后，将其门齿插入头部固定杆上的孔洞中。
      2. 将固定臂的尖端小心插入鼻梁处，以在手术过程中固定头部，确保其不与眼睛接触。
      3. 调整臂部角度，直至动物口腔顶部紧压住金属杆。确保颅骨在压力下保持固定不动。
      4. 使用六角扳手拧紧螺丝，固定支架的两个臂。
    3. 大鼠氧气装置设置
      1. 将氧气瓶的塑料管固定在动物的口鼻部，并用医用胶带固定。避免塑料管折叠产生褶皱而阻碍气流。将氧气瓶的流量调节至1 L/min。
        注意：在整个操作过程中，应每隔15-30分钟检查一次动物的生命体征，包括心率和呼吸频率。
  4. 头皮切口
    1. 剃毛与准备
      1. 从鼻梁上方至后脑勺区域进行剃毛，范围从一侧眼睛延伸至另一侧，并环绕耳朵周围。先用剪刀或电动推剪去除大部分毛发，然后涂抹脱毛膏。
    2. 消毒
      1. 使用浸有聚维酮碘的棉签对区域进行消毒，然后用浸有70%乙醇的棉签擦拭冲洗。重复此过程三次，最后再涂抹一次聚维酮碘，以确保该区域无菌。
    3. 局部麻醉注射
      1. 在动物头皮中线处皮下注射局部麻醉剂利多卡因（1%，小鼠每只0.1 mL，大鼠每千克体重0.4 mL）。轻轻按摩头皮以扩散利多卡因，等待5分钟使麻醉起效。
    4. 切口
      1. 对于小鼠，用镊子提起皮肤上的一点，然后使用手术剪切除一小块皮肤（直径约1 cm）。
      2. 对于大鼠，使用手术刀在头皮前侧鼻部上方正中线处做一个精确切口。轻轻向后牵拉皮肤，从两眼之间沿正中线至颅底做一直线切口。小心抬起头皮，剪除结缔组织，充分暴露颅骨。
      3. 按照步骤 2.4.4.4–2.4.4.5 暴露颅骨开窗部位。
      4. 用刮匙清除颅骨顶部的结缔组织和骨膜。用生理盐水冲洗，并使用吸引器或外科海绵清洁术区。
      5. 在皮肤边缘使用外科夹以充分暴露将要进行颅骨开窗的颅骨区域。
  5. 开颅术
    1. 通用钻孔操作流程
      1. 将外科钻的速度设置为低速档，5000 rpm 或有经验的外科医生可使用 7000 rpm。所有钻孔操作均需在显微镜下可视化进行。
      2. 将钻头与颅骨表面保持平行，并轻轻接触表面。
      3. 轻踩踏板，施加轻微压力，在同一位置开始钻孔。以短时间间隔（5-10秒）进行钻孔，并频繁检查骨组织颜色变化。
        注意：骨骼最初呈不透明的白色，随着孔洞加深，会逐渐变得半透明，并显现出粉红色调。
      4. 当钻孔接近脑组织时，应减慢速度并观察是否有液体渗入钻孔。当钻出的孔呈现暗粉色并带有轻微光泽时，停止钻孔。使用短的30 G针头轻轻刺穿残留的骨层，清亮液体应从新形成的孔中流出。
    2. 小鼠钻孔手术操作步骤
      1. 为进行生理记录，将参考电极放置于记录区域同侧大脑半球的额部，钻一个颅骨孔。
      2. 通过在颅骨开窗边缘钻出浅槽来定义开窗轮廓。在内外侧轴向上，以侧方骨嵴为参考，标记一个4 mm的窗口。
      3. 在前后轴向上，从后方骨脊前约1 mm处开始钻一个3 mm的窗孔。最终开放的颅骨窗大小约为4 × 3 mm。
    3. 大鼠钻孔手术操作步骤
      1. 钻两个孔：一个位于左后象限，另一个位于右前象限。
      2. 在预定切口处均匀注射第二剂利多卡因（0.4 mL/kg，10 mg/mL）至咬肌。
      3. 仅切除暴露颅骨切开区域所需的最少肌肉组织。
      4. 使用新的#10手术刀片，在动物下颌上方肌肉束（右侧）做一横向的背腹向切口。用持针钳夹住切口的后缘，在沿颧骨骨嵴切割的同时将肌肉从颅骨上剥离。以此方式可将肌肉从骨面分离，且出血最少。
      5. 以类似方式切除前方肌肉，直至暴露出颅骨上的裂线。该裂线即为颅骨开窗的前界。
      6. 用手术刀和镊子在强光源下清除后缘周围的肌肉组织，避免切到血管丰富的区域。
      7. 使用钻头磨除后部骨嵴，直至其不再高于颅骨表面。
        注意：此步骤对于放置 µECoG 网格以使其与皮层表面直接接触至关重要。
      8. 在切除的肌肉附着处的嵴上方，钻开窗区的背侧边缘。将后缘置于钻除后的后嵴前方，前缘置于靠近眼眶向下延伸的裂线后方。
        注意：清除前部肌肉时，需小心避免损伤眼睛。
  6. 开颅窗钻孔
    1. 开颅窗钻孔（技巧）
      1. 钻孔时，应确保钻头与颅骨表面保持平行。尽量减少施加的力度，像使用画笔一样操作钻头，使其轻轻接触颅骨，并沿预定的开颅线进行短距离、重复性的移动。
        注意：在大鼠中，窗区后缘的骨质最厚。若钻孔位置过于靠后，骨质可能出现片状剥离， "酥脆的" 质量较差，使得评估钻孔进度变得复杂。若位置放置不当，该骨区域可能呈现出带血管的红色，从而造成接近脑组织的假象。
      2. 在开颅窗的两侧进行钻孔，直至骨面呈淡粉色，并可见一条沿其长度延伸的细小白线状裂隙或裂缝。施加轻柔压力，骨质应发出清晰的声响 "晃动" 当完全钻孔后，若裂纹呈现不连续状态，应继续轻柔钻孔，直至形成连续的线条。
    2. 去除颅骨开窗内变薄的颅骨
      1. 当颅骨被磨薄至施加极轻微压力即可使整个窗区明显晃动时，移除已磨薄的颅骨。
      2. 用一滴生理盐水冲洗开颅部位，静置至少1分钟。这会削弱变薄的颅骨，有助于颅骨与硬脑膜分离。用吸水棉签或真空装置吸除多余的生理盐水。
      3. 使用镊子小心抬起变薄的颅骨，避免损伤下方组织。
      4. 使用止血海绵保持脑组织湿润。
      5. 用有齿镊子紧紧夹住颅骨窗的背侧和腹侧，直接向外拉离颅骨。如果难以将骨窗从原位拔出，应停止操作，继续进行轻度钻孔，直至骨质充分变薄。
      6. 对于小鼠 µECoG 记录，保持硬脑膜完整。
  7. 小鼠骨水泥与头固定装置植入
    1. 插入并固定参考电极。
      1. 将银丝末端插入钻孔约1毫米，使其接触脑表面但不引起出血。
      2. 在施加第一层时，将牙科水泥准确放置到位。
    2. 牙科水泥的制备
      1. 使用冷却的陶瓷调拌皿制备牙科水泥混合物。该水泥凝固迅速，需定期重新配制新混合物。每次配制新混合物前，应将调拌皿擦拭干净。
        注意：骨水泥绝不能与脑组织直接接触。
    3. 第一层的应用
      1. 使用微型涂抹器在颅骨开孔周围及整个颅骨表面涂抹第一层水泥。该层可作为颅骨与金属头杆之间的电绝缘层。
      2. 用牙科水泥完全包绕颅骨开窗区域，包括侧向覆盖，以充分保护开放的颅骨开窗区域及µECoG网格。
    4. 金属头夹的定位
      1. 将头杆的长段部分安装到其固定座上，但不要完全拧紧。
      2. 将头杆按所需位置放置，使薄片沿颅骨中线并与水泥表面接触。
    5. 固定植入物
      1. 用牙科水泥覆盖头杆，并将其连接到水泥表面。
    6. 取下支架
      1. 等待几分钟，使牙科水泥充分固化。
      2. 头部固定杆完全固定后，先将固定座上的螺丝取下，再将固定座向后撤出，注意不要对头部固定杆施加任何外力。
  8. 大鼠手术中的硬脑膜切开术
    注意：此为一项具有挑战性的手术步骤。
    1. 抬起硬脑膜
      1. 使用5号镊子，尽可能与脑表面平行，将一小部分硬脑膜从脑组织上轻轻提起。
      2. 使用新的30 G针头（尽可能短）小心撕开已抬起的硬脑膜。
        注意：硬脑膜是一层薄而透明的组织，直接位于大脑表面。在大鼠的µECoG记录中需要将其去除。进行硬脑膜切开时，必须避免扰动大脑表面的血管系统。推荐的硬脑膜切开方法包括使用镊子和注射器针头刺破硬脑膜，然后将其向后牵拉；或使用固定在颅骨附近的硬脑膜切开刀具，小心地牵开硬脑膜。
    2. 硬脑膜切除术
      1. 继续用镊子夹住硬脑膜并将其从脑组织上提起。在提起的同时，用针头制造一个斜向的撕裂口。
      2. 使用镊子小心地将硬脑膜从颅骨开窗的边缘向两侧剥离，确保脑表面不受干扰。
  9. 将小鼠转移至电生理记录装置
    1. 将动物从手术装置上取下，轻轻抬起其吻部和门齿，使其脱离门齿杆，然后向后拉出动物。注射氯丙噻嗪（1 mg/kg，腹腔注射[IP]），该镇静剂可使动物在较低异氟烷浓度下维持持续麻醉状态。
    2. 将小鼠放置于电生理记录装置中。
      1. 确保加热垫已正确放置并正常工作。
      2. 使用电生理装置中的固定架，通过头杆将动物头部固定。
      3. 将异氟烷面罩靠近，完全覆盖动物的吻部。
    3. 麻醉调节
      1. 逐步将麻醉水平降低至0.7-1%异氟烷（每5分钟最多降低0.5%）。
      2. 监测动物的呼吸频率和呼吸运动。
        注意：与手术状态相比，呼吸频率应略有增加，但动物不应出现活动。
      3. 如果动物出现活动，应立即把异氟烷浓度提高至2%，然后以0.5%为增量逐步降低至较低水平。
    4. 插入胡须以进行感觉刺激
      1. 将小鼠的触须连接到触须刺激装置。在本方案中，将九根触须插入连接至压电驱动器的短型10 µL移液器吸头中，由压电驱动器提供触须的快速偏转。

3. 记录

  1. 安装网格
    1. 初步步骤
      1. 打开记录系统和放大器。
      2. 检查动物的生命体征。
    2. 步骤
      1. 为放置动物和工具，请遵循步骤 3.1.2.2-3.1.2.4。
      2. 将动物放置于记录装置中，并通过定期滴加生理盐水保持开颅部位湿润。
      3. 对于大鼠，将显微操作仪置于固定装置的横杆上，位置应远在颅骨开窗区域后方，以避免干扰。
      4. 对于小鼠，将显微操作仪置于动物颅骨开窗部位的侧方。
      5. 为将网格固定并定位在小鼠上，执行步骤 3.1.2.6–3.1.2.12。
      6. 使用ZIF-夹连接器（头级连接器）将µECoG网格连接至头级。通过固定在显微操作器上的机械臂固定头级的电子板。
      7. 将µECoG网格沿前后轴水平下放，使其平整地覆盖在颅骨开窗区域。
        注意：沿外侧-内侧轴，网格的边缘应靠近颅骨开窗内侧边界。
      8. 当网格电极接近脑部但尚未接触时，将网格的参考导线连接到已植入的银丝-金针上。如有需要，将接地导线连接至动物体（例如暴露的肌肉）以减少电噪声。
      9. 进一步将网格降低至与脑组织接触。
      10. 横向移动网格 "滑行" 在湿润的硬脑膜表面继续调整，直至网格沿中线-外侧轴居中。
      11. 使用抽吸装置或手术海绵在颅骨切口边缘清除多余的生理盐水溶液。
      12. 当制备物稍干燥后，确保网格更牢固地贴附于硬脑膜，不会在其表面滑动。干燥后，将柔性网格从外侧向内侧移动，确保最外侧的电极与组织充分接触。网格的柔性电缆将自然弯曲，以贴合脑组织的轮廓。
      13. 将网格放置于大鼠身上时，遵循步骤 3.1.2.14–3.1.2.18。
      14. 将持针叉的柄固定在显微操作器上，确保当其下降时，网格的连接板将位于颅窗后侧上方。
      15. 调整显微操作仪在导轨上的位置，使网格大致位于颅骨开窗部位上方。降低网格直至其悬停在脑表面附近。用少量生理盐水润湿脑表面。
      16. 使用显微镜进行以下步骤。利用显微操作仪的调节旋钮，调整网格位置，使其在颅骨开窗的中心区域与脑表面完全贴合。
      17. 使用吸水棉三角轻轻吸去多余水分，注意不要触碰到网格本身。确保网格的每一行均与脑表面接触。
        注意：去除水分可防止电信号通过大脑皮层表面与电极网格之间的液体发生被动扩散，从而避免电极所记录信号在空间上的弥散。
      18. 使用2号或5号镊子，将网格接地线插入同一钻孔中，或将参考电极插入钻孔，接地线插入邻近肌肉组织。
        注意：导线插入深度应仅为约1 mm，足以接触脑组织，但不会引起脑出血或损伤。
  2. 检查网格的定位
    1. 监测电生理活动
      1. 使用记录软件观察电生理活动。在浅度麻醉状态下，脑信号具有变异性，可表现出多种模式。
      2. 正确连接网格线、参考线和地线后，应获得较高的信噪比，信号幅度应在毫伏（mV）范围内。使用Trodes进行带通滤波（例如100–6000 Hz）监测高频范围内的噪声，并确保其不超过数十微伏（µV）。
    2. 使用声音（例如拍手或弹响手指）诱发可观察的事件相关皮层表面电位（CSEPs），以评估感觉反应性。
      注意：单根胡须刺激应仅在少数通道中诱发出清晰、尖锐的事件相关皮层诱发电位（CSEP）（小鼠）。
    3. 网格位置验证
      1. 对于大鼠，需确认电极网格已正确放置于听觉皮层上方。首次记录的脑电信号通常应为持续60秒的白噪声刺激，以验证电极网格能否从大脑接收到适当的反应信号。在插入多通道电极（polytrode）之前，应仅使用电极网格进行白噪声和音调诊断性记录，以帮助判断电极网格是否定位准确以及是否存在信号响应。
      2. 对于小鼠，为验证网格定位，使用350 ms间隔的20-30次胡须偏转进行一次快速映射记录。利用Trodes系统记录局部场电位（LFP）频段的活动，并通过自定义的MATLAB代码离线分析，以可视化胡须诱发活动的空间范围。
    4. 重新定位
      1. 如果需要调整网格位置，可在网格上方滴加数滴生理盐水以湿润皮层表面。
      2. 在尝试提起载网前，将载网置于生理盐水中静置30秒至1分钟。
      3. 小心且缓慢地提起载网。
      4. 使用步骤 3.1 中描述的步骤重新定位。
  3. 用于大鼠的层流式多通道电极
    1. 多通道电极阵列装置
      1. 首先，将头端适配器连接到多通道电极的背面。将连接器的第三组通道夹在适配器板上，确保夹子上的黑标记朝向多通道电极工作端的右侧。
    2. 多通道电极插入
      1. 将多通道电极插入脑组织，直至最末端（最上方）的电极刚好露出皮层表面。以缓慢速度下降（低至1 µm/s）可提高信号质量。等待15分钟，使脑组织适应多通道电极的存在。
      2. 15分钟后，检查最末的电极是否已进入皮层表面。若尚未进入，可再轻微下调多通道电极，并额外等待10分钟，然后继续后续操作。
  4. 在小鼠上定位光遗传学光源
    1. 使用安装在铰接臂上的三维微调螺丝系统或显微操作器来固定光纤夹持器。
    2. 打开光遗传光源并调至低强度，以引导光源并辅助光纤定位。使用可调节臂粗略地将光遗传光源对准目标区域。
    3. 使用显微操作器或微调螺丝精细调节光纤的位置。
  5. 记录信号
    1. 准备
      1. 拔掉手术装置中所有不必要的灯具、延长线和电涌保护器，以减少电干扰。关闭手术装置的顶灯。
      2. 在开始实验之前，关闭隔离记录室和手术室的门。
    2. 开始采集
      1. 对于大鼠，首先在记录平台/计算机上启动 Synapse 软件，并通过预览信号确认采集功能正常。通过在动物附近施加刺激（例如拍手）来诱发 µECoG 信号中明显且尖锐的电压瞬变。
      2. 对于小鼠，在 Trodes 中启动记录会话。
    3. 水合
      1. 每1-2小时，分别向大鼠或小鼠皮下注射1 mL或0.1 mL生理盐水，以防止脱水。对大鼠而言，在给予生理盐水后需等待5-10分钟，再开始新的记录区块。
    4. 刺激集
      1. 对于大鼠，在确认记录位点后，开始记录所需的刺激集。一个示例刺激集可能包括
        白噪声（60 秒）
        音调诊断（5 分钟）
        纯音（23 分钟）
        动态移动光栅
        150音调（15分钟）
        ​TIMIT（38 分钟）
      2. 对于大鼠，每次重新定位网格时，均需重新呈现白噪声和音调诊断刺激。
      3. 小鼠的触觉刺激：以试验结构提供触觉刺激，每次试验包含一系列每隔350 ms出现的随机胡须偏转刺激。在提供的示例中，每次试验在4500 ms内呈现14次偏转刺激。
      4. 小鼠的光遗传学刺激：在部分试验中，在整个试验持续时间（5 s）内施加方波脉冲的光遗传学光照。根据所使用的视蛋白类型以及目标组织深度，结合光穿透能力的估算值（https://web.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php）确定所需的光照强度。
  6. 纯化
    1. 提升并清洗载网
      1. 记录完成后，关闭记录软件，并重新插上实验装置中的光源。
      2. 若脑组织较干，可使用注射器在脑表面滴加一滴生理盐水，静置30秒至1分钟后，再尝试抬起网格。
      3. 在显微镜下操作，使用显微操作器轻轻将网格从脑表面抬起。
      4. 若在抬起网格时需要额外施力，可使用带碳尖的镊子（闭合状态）轻轻从脑组织上抬起网格。确保显微操作仪的移动方向略偏向前方，以轻柔地将网格从脑表面剥离。
      5. 网格完全移除后，将其从夹持叉上取下，并按照步骤 3.6.1.6–3.6.1.7 进行清洗。
      6. 将网格（不包括连接板）浸泡在稀释的酶洗涤剂（50% Enzol，50%蒸馏水）中至少1小时。随后将其转移至第二浴纯蒸馏水中，并置于安全、洁净处自然晾干。
      7. 若网格的某些区域有血液或组织沉积，使用浸有酶溶液的棉签轻轻擦拭干净。
      8. 干燥后，将载网放回其盒中。
    2. 安乐死处死动物
      1. 将小鼠从头部固定装置中取出，放入安乐死舱内。加入浸有5 mL异氟烷的纱布，待呼吸停止后等待60秒。确认无退缩反射后，使用锋利剪刀进行断头处死。
      2. 对大鼠腹腔注射 0.2 mL 戊巴比妥钠。呼吸停止后等待 60 秒，将动物仰卧位固定，使用 #11 手术刀进行双侧开胸术。
    3. 清洁设备
      1. 将所有手术器械移至实验室水槽处，放置在手术毛巾上。用10%次氯酸钠溶液喷洒器械，并在水槽中彻底清洗。对于较脏的器械，先将其浸泡在次氯酸钠溶液中，再进行清洗。
      2. 或者，可使用粉状洗涤剂（如 Contrex AP）与水混合，用刷子在水槽中刷洗器械。
      3. 工具清洁并冲洗后，用酒精擦拭布擦拭，然后放回其存放处。
    4. 消毒工作区
      1. 将所有使用过的针头和刀片丢弃至锐器容器中。
      2. 将受污染的棉签、三角瓶和酒精擦拭巾丢弃至生物危害废物袋中。
      3. 用酒精擦拭装置室内的所有工作台面，并在关闭工作区前清洁所有仪器。

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结果

我们已描述了记录皮层脑电图信号并结合光遗传学方法和层状记录的技术方案。此处展示了从小鼠体感皮层（图1、图2 和 图3）以及大鼠听觉皮层在感觉刺激下（图4、图5 和 图6）所获得的典型信号。

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图 1：在小鼠胡须体感皮层上记录 µECoG 信号。（A）实验...

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讨论

本文所述的实验方案能够将高密度微电皮层电图（µECoG）阵列与层状探针及光遗传学技术相结合。该方案在啮齿类动物模型中操作简便，是研究皮层动态活动的有力工具，且易于扩大样本量。高密度 µECoG 网格可在小鼠和大鼠多个脑区实现高效、空间精确的皮层拓扑图谱绘制，充分利用了拓扑表征在脑组织中的关键作用33。加入层状记录技术后，可对皮层动态活动在多个空间和时间尺度上进行分析。结合光遗传学技术，则可实现因果性操控，以明确特定神经元群体与其在皮层表面诱发电位（CSEPs）及皮层信息处理中所起作用之间的关系34。

光遗传学技术能够选择性地调控特定的神经元群体，从而研究这些神经元在产生皮层活动模式以及参与可由µECoG检测到的神经计算过程中的因果作用。例如，我们的研究表明，靶向特定类型的细胞可以改变皮层表面电位（CSEPs）。该方法可用于解析µECoG信号的神经细胞类型基础，帮助我们识别哪些神经元类型参与了特征性的感觉诱发活动，例如在高伽马频段中观察到的活动。其他大规模皮层现象，如不同频段的皮层节律

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作由劳伦斯伯克利国家实验室LDRD项目资助，支持神经系统与机器学习实验室（K.E.B.），NINDS R01 NS118648A（K.E.B. & D.E.F.），以及NINDS R01 NS092367（D.E.F.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 把一次性 #11 刀片Swann Morton303用于外科手术
2 把一次性 #10 刀片Swann Morton3901用于外科手术
30 mm 笼杆ThorlabsER笼式组件
30 mm 笼板ThorlabsCP33T用于固定透镜
70% 乙醇Decon LabsV1016清洁/消毒剂（稀释至 70%）
Amalgambond PLUS 可调节精密涂布刷 青绿色 200/盒Henry Schein1869563用于粘合剂的精密涂布
Amalgambond PLUS 催化剂 0.7 mL 注射器 每支Henry Schein1861119粘合剂组分
放大器（Tucker-Davis Technologies）Tucker-Davis TechnologiesPZ5M-512用于听觉刺激和记录软件
万向臂NogaDG60103用于固定微调螺钉系统
用于聚光的非球面透镜（另有一片用于聚焦光线）ThorlabsACL25416U-B用于收集 LED 光线
听觉设备Tucker-Davis Technologies, Sony, CorteraRP2.1 增强型实时处理器/HB7 耳机驱动器用于听觉刺激和记录软件
布托啡诺Sterile Products LLC#42023017905通用镇痛剂
C&B Metabond 基质粘合剂 每支Henry Schein1864477粘合剂组分
C&B Metabond L-粉末粘合剂 透明 3 g Henry Schein1861068粘合剂组分
盐酸氯丙噻嗪（小鼠用）Sigma Aldrich货号 C1671用于镇静，必须在当天配制并保存于 4°C
定制设计的 128 通道微皮层脑电图（μECoG）电极阵列NeuronexusE128-200-8-40-HZ64用于神经生理学记录，放置于皮层表面
Dengofoam 明胶海绵Dengen dental600034 (SKU)可干用或湿用，用无菌氯化钠溶液浸润
钻头，尺寸 5 至 9（小鼠用）Fine Science Tools19007-XXXX 为钻头尺寸，例如 05 或 09，用于小鼠手术
钢制圆柱形牙科钻头（5.5 mm/7.5 mm）LZQ ToolsDental Bar Drill Bit Stainless Steel Bur用于大鼠手术
Dumont No. 5 镊子Fine Science Tools11251-10用于外科手术
Dumont 镊子 #5 弯头 45°World precision instruments14101用于移除颅骨开窗
DVD 播放器（Sony）SonyCDP-C345用于接收和播放刺激序列
静电扬声器SonyXS-162ES用于听觉刺激和记录软件，位于实验装置内部，向镇静啮齿类动物播放声音
酶清洁剂（Enzol）Advanced sterilization products2252清洁/消毒剂
EverEdge 2.0 刮治器 镰形双头 H6/H7 #9Henry Schein6011862用于刮擦颅骨
三维微调螺钉系统NarishigeU-3C用于精确调节光纤末端位置
金针Harwin IncG125-1020005用于小鼠参考电极接触点，焊接至银丝
持针钳Fine Science Tools00632-11用于外科手术
异氟烷Covetrus11695067772需使用蒸发器
氯胺酮（盐酸盐注射液）（大鼠用）Dechra17033-101-10麻醉/镇痛剂
LEDNew EnergyLED XLAMP XPE2 BLUE STARBOARD蓝色 LED 光源
LED 驱动器ThorlabsLEDD1BLED 驱动器
利多卡因CovetrusVINB-0024-6800需用生理盐水稀释至 1%
美洛昔康Covetrus6451603845抗炎药，用于通用镇痛
显微操作器Narishige（立体定位仪）SR-6R + SR-10R-HT 组件用于精细操控 ECoG 和啮齿类动物
No. 2 镊子Fine Science Tools91117-10用于外科手术
No. 55 镊子Fine Science Tools1129551用于外科手术
眼用润滑剂（人工泪液）Akorn17478-062-35用于在手术过程中保护眼睛免于干燥
光纤 200µm 芯径ThorlabsM133L02FC/PC 接头，长度 2 米
戊巴比妥（大鼠用）Covetrus / DechraVINV-C0II-0008麻醉/镇痛剂
铂黑Sigma205915-250MG用于神经生理学记录（用于在 μECoG 电极阵列上电镀电极接触点）
聚维酮碘 10%Betadinehttps://betadine.com/medical-professionals/betadine-solution/无目录编号（非零售）
粉状清洁剂（Contrex AP）Decon Labs5204清洁/消毒剂
预切氧管固定胶带ULINE（多家供应商）S-14726用于将氧管固定在啮齿类动物立体定位仪的鼻罩上
手术刀柄 #3World precision instruments500236-G适配 #10、#11 和 #15 刀片
刮刀Fine Science Tools1007516用于外科手术
短型 30 G 针头ExelInt26437用于外科手术和注射
银丝Warner Instruments63-1319用于神经生理学记录（用于接地和作为参考电极）
无菌生理盐水（0.9% 注射用氯化钠）Hospira00409-7101-67 (NDC)用于稀释注射液及补充体液
Stoelting Hopkins 蛙嘴钳Fine Science Tools10-000-481用于外科手术
表面消毒剂（Coverage Plus NDP 消毒剂）Steris life science638708清洁/消毒剂
TDT ZIF-夹连接器（用于信号采集）Tucker-Davis TechnologiesZIF-Clip Analog Headstages连接 ECoG 与外部采集设备
双叉固定叉Tucker-Davis TechnologiesZ-ROD128用于连接 TDT 夹与显微操作器
赛拉嗪（大鼠用）Covetrus1XYL006麻醉/镇痛剂

参考文献

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