本视频和实验方案演示了如何在啮齿类动物中植入玻璃覆盖的颅窗。此类制备可用于长期活体双光子成像，对新皮层进行数月时间尺度的观察。该方法也可用于其他类型的成像，包括光学内在信号成像。
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摘要
摘要
成像技术在脑功能研究中正变得愈发重要。其中，双光子激光扫描显微镜已成为一种极为有用的方法，因为它能够用于研究活体完整大脑。通过适当的准备，该技术可实现对同一皮层区域从数分钟至数月的长期观察。在本视频中，我们展示了一种利用双光子显微镜进行脑部长期活体成像的制备方法。该技术最初由现任职于珍利亚农场研究园区的霍华德·休斯医学研究所研究员Karel Svoboda博士率先建立。类似本视频所示的制备方法可用于新皮层结构的成像（例如树突和轴突动态）、利用钙敏感性染料记录神经元活动、皮层血流动力学成像，或用于内在光学成像研究。通过优化的颅窗手术，可实现对新皮层的深层成像。为避免感染，手术应尽可能在无菌条件下进行，同时需格外小心以避免损伤硬脑膜，从而成功制备可长期维持的玻璃覆盖颅窗。
方案
- 麻醉小鼠 使用经IACUC批准的操作程序，以异氟烷（诱导浓度4%，手术维持浓度1.5-2%）进行麻醉。必须通过尾部和/或脚趾夹捏反应来确认动物已完全进入镇静状态。
- 使用啮齿类动物修剪器，将从颈部背部至眼睛区域的毛发剃除。
- 放置 将小鼠固定于立体定位架中，置于手术用水循环加热毯上。用耳杆牢固固定头部。
- 涂抹眼药膏，以防止动物眼睛干涩。
- 皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）以预防脑肿胀，以及卡洛芬（5 mg/kg）以预防炎症反应。
- 手术开始前，使用70%酒精和碘伏交替擦拭皮肤三次，对术区进行消毒。
- 所有手术器械均已使用玻璃珠灭菌器预先灭菌。用经乙醇灭菌的剪刀去除颅骨顶部的皮肤，首先沿头部基底做一水平切口，接着向头侧方向做两个切口，几乎到达眼睑处，然后做两个在中线处汇合的斜向切口。
- 一滴利多卡因+肾上腺素溶液 此时应施加于骨膜上，以避免过度出血或疼痛。使用手术刀将骨膜剥离至颅骨边缘。 同时，轻轻牵拉颈部后方的肌肉组织。
- 用手术刀轻轻刮擦颅骨的整个暴露区域，以形成干燥的表面。此步骤非常关键，因为这将有助于后续涂抹的胶水更好地粘附。
- 选定成像位置后，即可开始制备颅窗。首先，轻柔地“勾画”出 使用气动牙科钻头钻出直径约4 mm的圆形区域。
- 轻微钻孔后，再次将利多卡因+肾上腺素溶液涂抹于颅骨表面。当仅剩极薄一层骨质时，停止钻孔。通过轻压颅骨开....
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讨论
正如我们在视频和补充图中所示，结合双光子显微镜使用的颅窗制备技术是一种在活体中研究新皮层结构与功能的强有力工具。该技术需要经过严格训练，以熟悉相关的解剖结构以及制备过程中所需的精细外科操作与技能。只有手术质量极佳的样本才可用于慢性成像。如果硬脑膜被过度操作或穿破，则不应将其用于成像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 卡洛芬（Rimadyl） | 药物 | Pfizer Pharma GmbH | ||
| 异氟烷（Aerrane） | 手术 | Baxter Internationl Inc. | ||
| 地塞米松 | 药物 | Baxter Internationl Inc. | ||
| Ortho-Jet 粉剂 | 试剂 | LANG | 需与丙烯酸混合使用 | |
| Jet-Acrylic 液体 | 试剂 | LANG | 需与 Ortho-Jet 粉剂混合使用 | |
| 圆形玻璃盖玻片 | 工具 | Electron Microscopy Sciences | 72195-05 | 直径 5 mm |
| 明胶海绵（Gelfoam） | 手术 | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| 钛棒为定制产品 |
参考文献
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 85, 161-165 (1997).
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing....
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重印与许可
