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方法文章

活细胞中的脂质交换实验

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DOI：

10.3791/68008

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2025年3月21日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Stony Brook University, 2Program in Cellular and Molecular Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种利用环糊精介导细胞质膜脂质与外源性脂质进行交换的方法。该技术可与研究跨膜蛋白的实验相结合，因为跨膜蛋白在类似脂筏的环境中和非脂筏样环境中的行为表现不同。

摘要

脂质筏是质膜中动态且有序的微区，常在膜蛋白聚集和信号转导过程中形成。质膜外小叶的脂质组成决定了其形成脂质筏的倾向性。由于脂质筏具有瞬时存在的特性，因此在活细胞中对其进行研究较为困难。因此，能够向细胞中添加或去除成筏脂质的方法在 活细胞质膜外小叶的脂质交换有助于研究脂筏的特性，例如其对膜蛋白的影响。本实验室开发的脂质交换实验利用脂质负载的环糊精去除质膜中的内源性磷脂，并添加外源性磷脂以改变质膜的脂质组成。通过将膜脂替换为可形成脂筏或不能形成脂筏的脂质，有助于研究跨膜蛋白活性的变化。本文介绍一种利用脂质负载环糊精对质膜外小叶进行脂质交换的方法，详细描述交换介质的制备以及对贴壁哺乳动物细胞的处理过程，并展示如何通过高效薄层色谱（HP-TLC）检测交换效率。该方案可实现外小叶脂质几乎完全被外源性脂质替换，同时不损害细胞活力，从而允许对经修饰的完整质膜开展后续实验研究。

引言

细胞质膜由富含多种膜蛋白的脂质双分子层构成，这些膜蛋白包括跨膜受体和离子通道。通过去垢剂抗性膜（DRM）分离实验中鉴定出的去垢剂可溶性和不溶性区域，已阐明膜内存在的脂质结构域1。不溶性组分的特征是富含胆固醇、紧密堆积的鞘磷脂以及饱和磷脂，具有较高的 熔点，而可溶性组分则主要由低熔点且疏松排列的不饱和磷脂组成。这种紧密堆积的区域被称为液态有序（Lo）脂质结构域，或称脂筏；而结构较为松散的液态无序（Ld）脂质结构域则属于质膜中的非脂筏区域2,3。已知脂筏区域有助于信号转导过程，有证据表明活化的胰岛素受体与这些脂筏相关联4,5。然而，由于细胞膜具有动态特性，且结构域通常尺寸较小，直接在活细胞中观察脂筏的存在仍面临重大挑战。在此背景下，我们提出一种利用脂质交换技术研究脂筏对胰岛素受体影响的方法。

环糊精（CDs）是由相互连接的葡萄糖单体形成的环状结构，具有一个中心空腔。该空腔的大小取决于葡萄糖单元的数量：六个单元构成α-环糊精（α-CD），而七个单元则形成β-环糊精（β-CDs）。环糊精是高度水溶性的分子，能够在其空腔内包封脂质，从而促进脂质向细胞膜的转运6。β-环糊精已被广泛用于向膜中添加或去除脂质7；然而，其较大的空腔对胆固醇或磷脂缺乏特异性8。相比之下，α-环糊精由于空腔较小，在结合脂质分子而非甾醇方面表现出更高的选择性。特别是甲基-α-环糊精（methyl-α-CDs）不与甾醇相互作用，已被有效用于交换磷脂和鞘磷脂，同时不改变细胞膜中的胆固醇组成8,9。

本文提供了一种使用甲基-α-环糊精（MαCD）将细胞膜外小叶中的脂质与具有促进或破坏脂筏形成特性的外源性脂质进行交换的详细方案。该交换方法用于研究脂筏对胰岛素受体活性的影响。实验将重点介绍向稳定高表达胰岛素受体（IR）的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的质膜中引入影响液态有序（Lo）结构域形成的磷脂和鞘磷脂的过程10。CHO IR细胞中脂质交换的程度将通过高效薄层色谱法（HP-TLC）进行评估，而脂质交换后经胰岛素刺激的胰岛素受体活性变化则通过蛋白质印迹分析进行定量。

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方案

1. 甲基-α-CD 溶液的制备

  1. 在玻璃瓶中加入 20 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）至约 10 g MαCD 粉末中。置于 45 °C 温水浴中孵育，间歇搅拌直至充分溶解。
    注意：由于存在不溶性环糊精组分，溶液可能仍呈浑浊状态。
  2. 将溶液通过 0.22 µm 注射器滤器过滤。溶液将变为澄清。
  3. 使用折光仪测定 MαCD 的准确浓度。
    1. 取 10 µL 样品置于折光仪的样品区，使用白炽灯照明，并记录溶液的折射率。
    2. 使用以下公式计算 MαCD 浓度：
      RI = (1.49 × 10 × C) + 1.33
      其中 RI = 折射率，C = MαCD 浓度（mM）。该公式通过重量分析法获得，即测定已知质量的 MαCD 溶于已知体积后的折射率。
  4. 用瓶盖密封玻璃瓶，并用透明薄膜包裹瓶盖以防止蒸发。于 4 °C 保存。

2. 多层囊泡（MLVs）的制备

  1. 将所需外源性脂质的氯仿溶液配制成 20 mM 至 50 mM 的储存液，并在 -20 °C 或更低温度下保存，以最大限度减少溶剂挥发。
    注意：表 1 中的所有脂质均可完全溶解于氯仿储存液中。然而，某些其他脂质可能需要使用 1:1 的氯仿:甲醇混合溶剂才能完全溶解。
  2. 使用带玻璃吸头的正向置换移液器，将脂质储存液分装至硼硅酸盐试管中。也可使用玻璃微量注射器进行分装。
  3. 在约 50 °C 的低温加热块上，通入 N2 气流，将分装的脂质干燥至氯仿完全蒸发。
  4. 将干燥后的脂质置于真空干燥箱中，在低于 200 mTorr 的高真空条件下继续抽真空 1 小时，以去除残留溶剂。
  5. 向干燥的脂质薄膜中加入无血清的 Ham's F-12 培养基，使终浓度达到 20 mM。盖上盖子或用聚四氟乙烯（Teflon）封口膜密封，于 70 °C 水浴中加热 5 分钟。
  6. 涡旋振荡以悬浮脂质并形成多层脂质体（MLVs）。此时培养基应呈现浑浊状态。
    注意：某些饱和脂质仅通过涡旋可能无法完全悬浮，需反复吹打直至脂质薄膜不可见。
    1. 将全部液体转移至微量离心管中。多层脂质体可在 4 °C 下保存最多 3 天。

3. 脂质交换培养基的制备

  1. 加入MαCD储备液，使其终浓度为40 mM，同时加入制备好的多层囊泡（MLVs），使其终脂质浓度见表1。
    注意：若使用4 °C保存的MLVs，其会沉降至管底。请将其恢复至室温，并通过轻弹或振荡试管确保充分重悬。
    1. 根据表1，将脂质在37 °C或55 °C水浴中与MαCD孵育30分钟，以实现脂质负载。所选温度应高于所用脂质的凝胶-液相相变温度。孵育过程中溶液应由浑浊变为澄清。
    2. 将脂质交换体系在室温下冷却30–60分钟。

4. 细胞脂质交换处理

  1. 在37 °C、5 % CO2条件下，将CHO IR细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、300 µg/mL L-谷氨酰胺、100 µg/mL非必需氨基酸、50 µg/mL G418、2 µM甲氨蝶呤和1×抗生素-抗真菌剂的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L葡萄糖）中。
    1. 在60 mm培养皿中接种1.5 × 106个细胞，培养至细胞融合度达80%–90%。
    2. 用1 mL PBS洗涤细胞3次，每次洗涤后吸除液体。随后在2 mL无血清的Ham's F12培养基中饥饿培养过夜。
  2. 用1 mL PBS洗涤细胞3次。向细胞中加入1 mL预配的交换缓冲液或作为对照的无血清培养基，在室温（25 °C–27 °C）下孵育1小时。每15分钟轻轻摇动培养皿一次，以确保细胞均匀接触交换缓冲液。
    1. 用1 mL PBS洗涤细胞3次。每个培养皿后续可用于步骤5的脂质提取，或用于步骤7的胰岛素受体自磷酸化实验。

5. 细胞培养板上的脂质提取

  1. 完全吸除 PBS，将培养板置于 45° 角静置 10 分钟，或直至完全干燥，去除可能在底部积聚的缓冲液。
  2. 向干燥的细胞中加入 1 mL 体积比为 3:2 的正己烷:异丙醇溶液，在室温下振荡孵育 10 分钟。
  3. 将溶液转移至硼硅酸盐玻璃管中，用聚四氟乙烯（Teflon）膜封口，并于 -20 °C 保存。
  4. 加入 500 µL 1 N NaOH，室温下振荡 10 分钟，以溶解残留的细胞碎片。
    1. 使用该溶液进行蛋白质定量分析（如 Bradford 法），以测定各样品的蛋白浓度。这些浓度值可用于标准化脂质提取物在高效薄层色谱（HP-TLC）板上的上样体积，确保所有样品的脂质上样量相等。

6. 使用高效薄层色谱法检测交换效率

  1. 配制 100 mL 体积比为 65:25:5 的氯仿:甲醇:30% (v/v) 氢氧化铵溶液，倒入玻璃薄层色谱槽中。盖紧盖子，使蒸气平衡至少 1 小时。
  2. 在加热块上以低档温度，通入氮气流干燥脂质提取样品2 气体直至所有明显的有机溶剂蒸发完毕。
  3. 将脂质膜溶于50 µL体积比为1:1的氯仿:甲醇溶液中。
  4. 使用10 µL Hamilton微量注射器将1-10 µL样品以1 cm宽的条带形式点样于硅胶HP-TLC板上。在20 cm的薄层板上最多点样10条带。采用归一化数值确定各样品中脂质等量点样所需的体积。
    注意：每次加样前，应将酶标板置于中高温度的加热板上进行活化。
  5. 将薄层色谱板垂直放入展开缸中，使溶剂前沿迁移8 cm，以确保磷脂种类的分离。
  6. 让培养板干燥10分钟。喷洒含3%（w/v）醋酸铜和8%（v/v）磷酸的水溶液。
    1. 让板在室温下或使用热风枪干燥30分钟。板的颜色应由半透明蓝色变为不透明白色。
  7. 在180 °C–200 °C的烘箱中炭化平板5–10分钟，或直至黑色脂质条带可被检测到。

7. 通过自磷酸化实验和蛋白质印迹法检测受体激活

  1. 在室温下，用 500 µL 含 100 nM 胰岛素的无血清培养基孵育细胞 5 分钟。
  2. 用预冷的 PBS 洗涤细胞，并将细胞置于冰上以终止刺激。立即向细胞中加入 1 mL 预冷的 PBS，用细胞刮刀收集细胞，并在 4 °C 下以 3000 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
  3. 在冰上向细胞沉淀中加入 100–200 µL 完全 RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8，200 mM NaCl，1 mM EDTA，1% (v/v) Triton X-100，1% (w/v) 脱氧胆酸钠，1 mM 活化正钒酸钠，10 µg/mL 抑肽酶，10 µg/mL 亮抑酶肽），上下吹打 30–40 次以裂解细胞。
  4. 将裂解液在冰上孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 10 分钟，去除细胞碎片，收集上清液。保留约 20 µL 裂解液用于 Bradford 法测定蛋白浓度。
  5. 将裂解液与 5× Laemmli 缓冲液（350 mM Tris HCl pH 6.8，30% v/v 甘油，10% w/v SDS，25% v/v β-巯基乙醇，0.002 g 溴酚蓝）混合，于 95 °C 煮沸 5 分钟。加入的缓冲液体积应足以使最终浓度达到 1× Laemmli 缓冲液。
  6. 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
    1. 将等量蛋白样品及分子量标记物加入 SDS-PAGE 凝胶，在电泳缓冲液（2.5 mM Tris pH 8，19.2 mM 甘氨酸，0.01% (w/v) SDS）中以 100 V–150 V 电压电泳，直至 100–250 kDa 范围内的条带清晰分离。
  7. 在转移缓冲液（2.5 mM Tris pH 8，19.2 mM 甘氨酸）中，于 4 °C、100 V 条件下将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 1 小时。
  8. 将 PVDF 膜置于含 5% BSA 的 TBST 溶液（50 mM Tris pH 8，150 mM NaCl，0.1% (v/v) Tween 20）中，在室温下封闭 30 分钟。
  9. 在含 5% BSA 的 TBST 溶液中，以 1:1000 的稀释比例加入 pYpY IR 抗体或 IR-β 抗体，在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
    注：pYpY IR 抗体特异性识别第 1162 和 1163 位磷酸化酪氨酸，用于指示受体的自磷酸化状态；IR-β 抗体则非特异性识别受体的 β 亚基，无论其磷酸化状态如何，用于反映受体的总体表达水平。
  10. 在室温下用 TBST 洗涤 3 次，每次洗涤后在含 1% BSA 的 TBST 溶液中，以 1:3000 的稀释比例加入 α 兔 HRP 抗体，在室温下孵育 30 分钟。
  11. 在室温下用 TBST 洗涤 3 次，加入增强型化学发光（ECL）底物孵育 1 分钟，随后进行胶片成像。

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结果

为了展示交换后细胞脂质组成中可观察到的变化，我们在CHO IR细胞中进行了脑鞘磷脂（bSM）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）交换后的高效薄层色谱分析（HP-TLC）（图1）。当使用如bSM之类的鞘磷脂进行交换时，与未处理对照组相比，SM条带的强度明显增加，而PC条带的强度则降低。相反，在交换如DOPC等磷脂酰胆碱时，PC条带强度增强，而SM条带强度减弱。交换效率可通过ImageJ软件测量交换后脂质类别的条带强度，并计算未处理样品与处理样品的强度比值来确定。加载标准品由一种市售脂质的多个稀释浓度制备而成，可用于估算交换前后某一类脂质的含量。通过测量SM标准品条带的强度并绘制标准曲线，可将所有样品的SM强度拟合至该曲线上，从而实现脂质的定量分析。

接下来，我们展示如何通过蛋白质印迹法（Western blot）检测脂质交换后的受体自磷酸化（图2）。以胰岛素受体为例，可在未处理的细胞与经筏状结构形成脂质（bSM）或非筏状结构形成脂质（DOPC）交...

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讨论

自从提出细胞膜中存在脂筏的概念以来，已有大量研究尝试在细胞中对其进行可视化，并探究脂质与受体的相互作用。涉及细胞显微成像的实验11通常使用荧光标记的生物标志物——一般是已知能与脂筏结合的蛋白质和脂质——以直观研究细胞中有序脂质结构域的定位12。然而，细胞膜存在大量褶皱13,14、小窝（caveolae）凹陷1,13以及蛋白质聚集现象2,，这些因素阻碍了对脂筏生物标志物动态行为的清晰观察。另一种研究策略是在模型膜系统中构建囊泡，通过使用特定脂质来模拟脂筏15。尽管这类囊泡易于制备和操作，但其在细胞双分子层的生物物理特性和化学组成方面并不能准确反映真实细胞膜的特性。一种更接近天然状态的膜系统是巨型质...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM 122493 提供经费支持。CHO IR 细胞系由凯斯西储大学 Jonathan Whittaker 博士惠赠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DLPC）Avanti Polar Lipids850335
1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC）Avanti Polar Lipids850345
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）Avanti Polar Lipids850375
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC）Avanti Polar Lipids850355
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）Avanti Polar Lipids850365
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）Avanti Polar Lipids850457
抗胰岛素受体 β 抗体Cell Signaling TechnologyCST3025
抗-pYpY1162/1163 胰岛素受体抗体R&D Systems Inc.AF2507
抗兔 IgG，HRP 标记抗体Cell Signaling Technology7074
硼硅酸盐玻璃试管（12 x 75 mm）Thermo Fisher Scientific14-961-26
脑鞘磷脂（bSM）Avanti Polar Lipids860062
蛋黄鞘磷脂（eSM）Avanti Polar Lipids860061
胎牛血清（FBS）Corning35-016-CV
G418 硫酸盐Sigma AldrichA1720
Gibco 抗生素-抗真菌溶液（100x）Thermo Fisher Scientific15240062
Gibco Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖，L-谷氨酰胺，丙酮酸钠）Thermo Fisher Scientific11965092
Gibco Ham’s F12 培养基Thermo Fisher Scientific11765054
Gibco L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030032
Gibco MEM 非必需氨基酸溶液（100X）Thermo Fisher Scientific11140050
Gibco 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）（0.144 g/L KH2PO4，9 g/L NaCl，0.795 g/L Na2-HPO4（无水））Thermo Fisher Scientific10010023
Gibco 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红Thermo Fisher Scientific25300054
高效薄层色谱（HP-TLC）MerckHP-TLC Silica Gel 60 plates
Immobilon-P PVDF 膜MilliporeIPVH00010
甲氨蝶呤Sigma Aldrich454126
甲基-α-环糊精（MαCD）AraChemCDexA076/BR
Pierce ECL 蛋白质印迹底物Thermo Fisher Scientific32106
正钒酸钠，活化型Sigma Aldrich5.08605

参考文献

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