方法文章

使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程

DOI：

10.3791/68037

⸱

2025年6月13日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Experimental Medicine, University of California, San Francisco, 2DSI-NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, SAMRC for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 3Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Zuckerberg San Francisco General Hospital and Trauma Centre, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案表明，珠击法结合DNA捕获磁珠纯化可快速、稳定地从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）样本中提取DNA，是适用于下一代测序应用的有效方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

结核病是一种致命性疾病，其致病菌Mycobacterium tuberculosis对抗生素产生耐药性，进一步恶化了治疗效果。通过测序技术精确且快速地识别耐药性，有助于制定个体化治疗方案，从而改善结核病患者的预后。DNA提取方法对下游分子检测至关重要，但由于Mycobacterium具有坚韧的细胞壁、许多临床样本中细菌载量较低，以及痰液基质成分复杂，使得提取过程面临挑战。目前已报道多种M. tuberculosis DNA提取方法，但尚无公认的金标准。此外，其中很少有方法被证明具有稳定的重复性，且许多方法不适用于资源有限且结核病负担较高的地区。因此，实验室常自行修改操作流程，导致方法间存在显著差异。本文介绍一种经济、快速且标准化的分枝杆菌DNA提取方案，适用于临床痰液样本及培养物，所提取DNA可用于qPCR检测，建议在临床诊断实验室中推广应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA对于利用靶向下一代测序（NGS）和全基因组测序（WGS）检测耐药结核病（TB）至关重要，但这一环节常被忽视。我们开发了一种标准化的实验方案，旨在为临床NGS应用提供稳定且高质量的DNA，包括Deeplex-MycTB（GenoScreen）等靶向NGS方法以及全基因组测序。目前，世界卫生组织（WHO）已推荐将这些方法用于耐药结核病的诊断。值得注意的是，尽管WHO推荐了基于NGS的诊断策略，但并未明确规定支持这些策略的具体DNA提取方案。本方法不仅可用于WHO认可的检测技术，也可用于依赖高质量分枝杆菌DNA的新兴技术。

提取的难点源于结核分枝杆菌（M. tuberculosis）独特的细胞壁结构，其由分枝菌酸和脂质组成，使得细胞极难破裂。目前发表的提取方法在裂解方式（如超声处理、化学法、加热法和珠击法）和DNA提取方法（如苯酚-氯仿提取法、乙醇沉淀法、CTAB法以及基于柱和磁珠的方法）方面存在显著差异，导致DNA的得率、纯度和质量各不相同1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。此外，不同研究团队很少采用相同的DNA提取方法，且对成功标准的衡量方式也各不相同。这使得确定最佳方法变得困难，因为最优方案取决于具体的分子应用类型。例如，利用长读长测序技术分析痰液中结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的结构变异，相较于仅靶向rpoB小片段区域的商业化诊断工具，需要更高品质的DNA和更精确的聚合酶。多个因素进一步增加了DNA提取成功的难度。可提取的DNA量取决于样本类型、细菌数量以及是否存在干扰物质（如共提取的非分枝杆菌DNA和PCR抑制剂）。即使是技术层面的因素，例如实验人员移液操作的精确性，也可能影响结果。在临床环境中常见的低菌量样本或高污染DNA样本中，现有方法往往表现不佳17,18,19。

在定制缓冲液中进行珠击破碎，随后采用珠清洁纯化流程，相比其他方法具有显著优势。该方法操作简便、流程快速，可减少操作者依赖性带来的变异，并保持DNA完整性，适用于下游的高通量测序（NGS）应用。这种标准化方案特别适用于临床实验室，有助于在采用世界卫生组织（WHO）推荐的NGS药物耐药性检测及全基因组测序（WGS）各类应用时，获得可靠且可重复的结果。

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方案

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本研究在加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）进行，经机构生物安全委员会批准（BUA #BU198320-01GBUA/BABB），并遵循UCSF的研究伦理准则。我们获得了由Discovery Life Sciences在经机构审查委员会批准的免除知情同意协议下收集的、来自患有非结核性呼吸道疾病个体的剩余痰液样本。

1. 缓冲液的制备

  1. 自定义Triton缓冲液（表1）：配制100 mL自定义Triton缓冲液时，先将2 mL 5 M NaCl、1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）、1 mL Triton X-100和0.2 mL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）混合，再加入超纯水定容至100 mL。使用前经滤膜除菌。最终缓冲液含有100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA和1% Triton X-100。
  2. 低EDTA TE缓冲液（表2）：配制100 mL低EDTA TE缓冲液时，将1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）与0.02 mL 0.5 M EDTA混合，再加入超纯水定容至100 mL。最终缓冲液含有10 mM Tris-HCl和0.1 mM EDTA。

2. 裂解管的制备

  1. 使用手术刀片，在1.5 mL螺口管的拐点稍下方小心地将其底部切下。
  2. 将P1000吸头的尖端剪去，在末端附近切出一个V形缺口，然后将已制备好的螺口管底部嵌入该缺口内。参见图1以查看刮勺的示意图。
  3. 在无菌容器（例如储液槽或培养皿）中装入0.1 mm氧化锆-硅酸盐珠，使用制备好的刮勺将一勺珠子（约200 mg）分装至1.5 mL螺口管中。

使用移液器和P1000吸头进行培养皿实验设置的示意图，用于实验室液体操作。
图1：自制珠子分配勺。 该勺子设计用于将约200 mg的0.1 mm氧化锆珠轻松转移至处理管中。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 输入样本的制备

注意：所有样品制备操作均应根据您所在机构的生物安全规程进行。我们强烈建议在II级生物安全柜（BSC）内操作传染性材料，以最大限度降低气溶胶暴露风险。

  1. 细菌细胞培养
    1. 将约 5 mL 的 M. tuberculosis 培养物（MGIT 培养或浑浊的液体培养物）加入 15 mL 圆锥形离心管中，在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。
    2. 使用 10 mL 血清移液管，小心吸除上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。
    3. 用移液器反复吹打，将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。如需（例如将样本转移至 BSL-3 实验室外处理），应按照标准操作程序对样本进行灭活。
  2. 痰液样本制备
    1. 将 1–5 mL 痰液样本（自发或诱导咳痰）转移至无菌的 50 mL 离心管中。
  3. DTT 液化
    1. 向痰液样本中加入四倍体积的 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）（体积可根据实际情况调整）。若使用商用试剂，请遵循生产商提供的稀释说明。
    2. 充分涡旋振荡 30 秒，在室温（20–25 °C）孵育 7 分钟，再次涡旋振荡 30 秒。
    3. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2 一次；对于黏稠度极高的样本，可进行最多 5 次孵育-涡旋循环。
    4. 在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。使用 10 mL 血清移液管小心弃去上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。
    5. 将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。
  4. NALC-NaOH 液化
    1. 按照生产商提供的说明配制和稀释 NALC-NaOH 溶液。
    2. 向痰液样本（自发或诱导咳痰，体积可变）中加入四倍体积的 NALC-NaOH 溶液。
    3. 涡旋振荡 30 秒，在室温（20–25 °C）孵育 7 分钟。重复步骤 3.4.1 和 3.4.2 一次。对于黏稠度极高的样本，可进行最多 5 次孵育-涡旋循环。
    4. 加入 PBS 至 50 mL 刻度线，短暂涡旋混匀。在最大速度（≥ 3,000 x g）下离心 10 分钟。
    5. 使用 50 mL 血清移液管，小心弃去上清液，仅保留约 500 µL，注意不要扰动沉淀。再用 P1000 移液器吸除剩余上清液，避免扰动沉淀。
    6. 将沉淀重悬于 350 µL 自制 Triton 缓冲液中。如需（例如将样本转移至 BSL-3 实验室外处理），应按照标准操作程序对样本进行灭活。

4. DNA 的提取

  1. 将灭活的细菌悬液（来自步骤3的350 µL）转移至一个新的、标记清楚的1.5 mL螺旋盖离心管中，管内含有约250 µL的0.1 mm氧化锆-硅酸盐珠。
  2. 以6.5 m/s的速度进行珠磨裂解，每次45秒，两次运行之间休息2分钟。共重复三次，完成三个珠磨循环。
  3. 以最大速度（≥ 12,000 x g）离心2分钟，然后将150 µL上清液转移至另一个标记清楚的新离心管中。注意避免转移珠子或细胞碎片。
  4. 将纯化磁珠在室温下平衡30分钟，并充分涡旋振荡，以确保使用前完全重悬。
  5. 加入180 µL（1.2倍体积）的纯化磁珠，通过移液器上下吹打10次进行混合。室温孵育2分钟。
  6. 将离心管置于磁力架上，静置约2分钟直至溶液澄清。使用P200移液器小心弃去上清液，避免扰动磁珠。
  7. 保持离心管仍在磁力架上，沿与磁珠相对的管壁加入500 µL新鲜配制的70%（v/v）乙醇。静置30秒。
  8. 重复步骤4.5至4.7，共进行两次洗涤。最后一次洗涤结束后，用P10移液器吸除残留乙醇，并短暂干燥磁珠约2分钟。
  9. 当磁珠沉淀变为不透明后，立即从磁力架上取下离心管，加入20 µL低EDTA Tris缓冲液重悬。切勿让磁珠完全干燥开裂。
  10. 通过移液或涡旋振荡混合，确保所有磁珠均处于溶液中。室温孵育5分钟。
  11. 将离心管放回磁力架，静置约2分钟直至溶液澄清。将洗脱的DNA转移至一个新的、标记清楚的离心管中，用于后续分析。吸取时避免带入磁珠，提取的DNA体积应< <20 µL。

5. 分枝杆菌DNA的qPCR定量

  1. 为了使用定量PCR检测分枝杆菌atpE（Rv1305）基因中99个核苷酸来定量分枝杆菌DNA，请在冰上为每个样本配制10 µL反应体系，其中包含5 µL通用探针预混液（2x）、0.4 µL正向引物（5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3'，10 µM）、0.4 µL反向引物（5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3'，10 µM）、0.2 µL TaqMan探针（5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3'，10 µM）、2 µL DNA模板以及2 µL无核酸酶水（表3）。
  2. 按照以下热循环条件运行反应：95 °C初始变性60 s，随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性10 s和60 °C退火延伸30 s（在此处采集信号，升温速率为2.11 °C/s；表4）。
    注意：本实验采用VIC标记的TaqMan探针，在QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统上进行qPCR检测。
  3. 所有样本、标准品和对照均需设置技术重复三次。使用纯化的M. tuberculosis DNA系列稀释液生成标准曲线，并利用分析软件进行相对定量分析。
  4. 将获得的相对定量结果导出为CSV格式，并使用R Studio（版本2024.09.1+394）进行可视化处理，绘制箱线图以比较不同DNA提取方法的得率。

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结果

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我们对培养的样本和 M. tuberculosis 和 M. tuberculosis 加 spiked 痰液样本（每种条件 n = 3）。使用培养的 M. tuberculosis H37Rv mc² 7901，我们将输入量标准化为 8.4 x 106 每50 µL含细胞数相当于200 GU的1 mL MGIT培养物。对于痰液实验，我们使用来自非结核性呼吸道疾病患者的混合痰液（商业获取），分别加入两种不同浓度的细菌（50,000，约相当于痰涂片1+等级；10,000条杆菌，约相当于痰涂片稀少等级），以评估该方法在不同细菌载量下的检测性能。

我们采用定制的TaqMan qPCR检测单拷贝基因，以评估DNA得率（图2）。在所有样本中均检测到结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，包括纯培养物和加标痰液样本，重复实验之间的差异较小；然而，在仅添加10,000个细胞的加标痰液样本中，其定量结果存在较大变异。

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讨论

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本研究中，我们介绍了一种可靠且经过验证的方案，通过珠磨法结合磁珠纯化，提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，适用于后续的分子生物学及高通量测序（NGS）应用。

该方法相较于现有的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA提取方案具有多项优势。传统的苯酚-氯仿提取法通常需要数天时间，且会引入有害化学物质，而本方法可在60分钟内完成，产生的有害废弃物极少。该方法在试剂获取方面具有灵活性——缓冲液可从多家供应商购买，也可由实验室自行配制，从而降低对单一供应商的依赖。即使是磁珠本身，也可在具备中等复杂条件的实验室中合成20。尽管商业化的磁珠可能获得更高的提取得率，但该方法具有高度可适配性，使实验室能够在保持性能的同时优化成本。总体而言，该方法快速、可重复，并在多次实验及不同批次样本中均表现出稳定的一致性。因此，该方法适用于直接从痰液样本进行靶向下一代测序（NGS）检测，以及对培养分离株进行全基因组测序（WGS）。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R01AI153213 国家过敏与传染病研究所（NIAID）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 mm 氧化锆-硅酸盐珠Biospec Products11079101z用于珠击步骤以裂解分枝杆菌细胞的珠子
AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63880裂解后用于DNA纯化的磁珠
EDTA（0.5 M，pH 8.0） Thermo Fisher ScientificAM9260G自定义Triton/低EDTA缓冲液组分
Fastprep 24MPbio, USA116004500以6.5 m/s进行珠击的设备
正向引物Thermo Fisher Scientific定制合成引物序列：AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O（水，分子生物学级）Thermo Fisher ScientificBP2819-1自定义Triton/低EDTA缓冲液组分
Luna Universal ProbeNew England BiolabsM3004用于分枝杆菌DNA定量的qPCR试剂
MycoPrep 试剂盒BDSKU/REF 240863BD MycoPrep 标本消化试剂，用于NALC-NaOH痰液处理
NaCl（氯化钠，5 M 溶液）Thermo Fisher ScientificAM9759自定义Triton/低EDTA缓冲液组分
PBSMillipore SigmaP2272痰液处理
反向引物Thermo Fisher Scientific定制合成引物序列：GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan 探针Thermo Fisher Scientific定制合成探针序列：AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl（1 M，pH 8.0）Thermo Fisher ScientificAM9855G自定义Triton/低EDTA缓冲液组分
Triton X-100Thermo Fisher Scientific28314自定义Triton/低EDTA缓冲液组分

参考文献

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PCR

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