本方案表明，珠击法结合DNA捕获磁珠纯化可快速、稳定地从结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）样本中提取DNA，是适用于下一代测序应用的有效方法。
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方法文章
使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
结核病是一种致命性疾病，其致病菌Mycobacterium tuberculosis对抗生素产生耐药性，进一步恶化了治疗效果。通过测序技术精确且快速地识别耐药性，有助于制定个体化治疗方案，从而改善结核病患者的预后。DNA提取方法对下游分子检测至关重要，但由于Mycobacterium具有坚韧的细胞壁、许多临床样本中细菌载量较低，以及痰液基质成分复杂，使得提取过程面临挑战。目前已报道多种M. tuberculosis DNA提取方法，但尚无公认的金标准。此外，其中很少有方法被证明具有稳定的重复性，且许多方法不适用于资源有限且结核病负担较高的地区。因此，实验室常自行修改操作流程，导致方法间存在显著差异。本文介绍一种经济、快速且标准化的分枝杆菌DNA提取方案，适用于临床痰液样本及培养物，所提取DNA可用于qPCR检测，建议在临床诊断实验室中推广应用。
引言
提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA对于利用靶向下一代测序（NGS）和全基因组测序（WGS）检测耐药结核病（TB）至关重要，但这一环节常被忽视。我们开发了一种标准化的实验方案，旨在为临床NGS应用提供稳定且高质量的DNA，包括Deeplex-MycTB（GenoScreen）等靶向NGS方法以及全基因组测序。目前，世界卫生组织（WHO）已推荐将这些方法用于耐药结核病的诊断。值得注意的是，尽管WHO推荐了基于NGS的诊断策略，但并未明确规定支持这些策略的具体DNA提取方案。本方法不仅可用于WHO认可的检测技术，也可用于依赖高质量分枝杆菌DNA的新兴技术。
提取的难点源于结核分枝杆菌（M. tuberculosis）独特的细胞壁结构，其由分枝菌酸和脂质组成，使得细胞极难破裂。目前发表的提取方法在裂解方式（如超声处理、化学法、加热法和珠击法）和DNA提取方法（如苯酚-氯仿提取法、乙醇沉淀法、CTAB法以及基于柱和磁珠的方法）方面存在显著差异，导致DNA的得率、纯度和质量各不相同1,2,3,4,5<....
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方案
本研究在加利福尼亚大学旧金山分校（UCSF）进行，经机构生物安全委员会批准（BUA #BU198320-01GBUA/BABB），并遵循UCSF的研究伦理准则。我们获得了由Discovery Life Sciences在经机构审查委员会批准的免除知情同意协议下收集的、来自患有非结核性呼吸道疾病个体的剩余痰液样本。
1. 缓冲液的制备
- 自定义Triton缓冲液（表1）：配制100 mL自定义Triton缓冲液时，先将2 mL 5 M NaCl、1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）、1 mL Triton X-100和0.2 mL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）混合，再加入超纯水定容至100 mL。使用前经滤膜除菌。最终缓冲液含有100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA和1% Triton X-100。
- 低EDTA TE缓冲液（表2）：配制100 mL低EDTA TE缓冲液时，将1 mL 1 M Tris-HCl（pH 8）与0.02 mL 0.5 M EDTA混合，再加入超纯水定容至100 mL。最终缓冲液含有10 mM Tris-HCl和0.1 mM EDTA。
2. 裂解管的制备
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结果
我们对培养的样本和 M. tuberculosis 和 M. tuberculosis 加 spiked 痰液样本（每种条件 n = 3）。使用培养的 M. tuberculosis H37Rv mc² 7901，我们将输入量标准化为 8.4 x 106 每50 µL含细胞数相当于200 GU的1 mL MGIT培养物。对于痰液实验，我们使用来自非结核性呼吸道疾病患者的混合痰液（商业获取），分别加入两种不同浓度的细菌（50,000，约相当于痰涂片1+等级；10,000条杆菌，约相当于痰涂片稀少等级），以评估该方法在不同细菌载量下的检测性能。
我们采用定制的TaqMan qPCR检测单拷贝基因，以评估DNA得率（图2）。在所有样本中均检测到结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，包括纯培养物和加标痰液样本，重复实验之间的差异较小；然而，在仅添加10,000个细胞的加标痰液样本中，其定量结果存在较大变异。
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讨论
本研究中，我们介绍了一种可靠且经过验证的方案，通过珠磨法结合磁珠纯化，提取高质量的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA，适用于后续的分子生物学及高通量测序（NGS）应用。
该方法相较于现有的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）DNA提取方案具有多项优势。传统的苯酚-氯仿提取法通常需要数天时间，且会引入有害化学物质，而本方法可在60分钟内完成，产生的有害废弃物极少。该方法在试剂获取方面具有灵活性——缓冲液可从多家供应商购买，也可由实验室自行配制，从而降低对单一供应商的依赖。即使是磁珠本身，也可在具备中等复杂条件的实验室中合成20。尽管商业化的磁珠可能获得更高的提取得率，但该方法具有高度可适配性，使实验室能够在保持性能的同时优化成本。总体而言，该方法快速、可重复，并在多次实验及不同批次样本中均表现出稳定的一致性。因此，该方法适用于直接从痰液样本进行靶向下一代测序（NGS）检测，以及对培养分离株进行全基因组测序（WGS）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R01AI153213 国家过敏与传染病研究所（NIAID）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 mm 氧化锆-硅酸盐珠 | Biospec Products | 11079101z | 用于珠击步骤以裂解分枝杆菌细胞的珠子 |
| AMPure XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | 裂解后用于DNA纯化的磁珠 |
| EDTA（0.5 M，pH 8.0） | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | 自定义Triton/低EDTA缓冲液组分 |
| Fastprep 24 | MPbio, USA | 116004500 | 以6.5 m/s进行珠击的设备 |
| 正向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制合成 | 引物序列：AATTCCTGGTGTAGCGGTGG |
| H2O（水，分子生物学级） | Thermo Fisher Scientific | BP2819-1 | 自定义Triton/低EDTA缓冲液组分 |
| Luna Universal Probe | New England Biolabs | M3004 | 用于分枝杆菌DNA定量的qPCR试剂 |
| MycoPrep 试剂盒 | BD | SKU/REF 240863 | BD MycoPrep 标本消化试剂，用于NALC-NaOH痰液处理 |
| NaCl（氯化钠，5 M 溶液） | Thermo Fisher Scientific | AM9759 | 自定义Triton/低EDTA缓冲液组分 |
| PBS | Millipore Sigma | P2272 | 痰液处理 |
| 反向引物 | Thermo Fisher Scientific | 定制合成 | 引物序列：GTTTACGGCGTGGACTACCA |
| TaqMan 探针 | Thermo Fisher Scientific | 定制合成 | 探针序列：AGGAGGAACACCGGTGGCGA |
| Tris-HCl（1 M，pH 8.0） | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | 自定义Triton/低EDTA缓冲液组分 |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 28314 | 自定义Triton/低EDTA缓冲液组分 |
参考文献
- Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culture-free prediction of susceptibility or resistance to 13 anti-tuberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
- George, S., et al. DNA Thermo-Protection Facilitates Whole Genome Sequencing of Mycobacteria Direct from Clinical Samples by the Nanopore Platform.
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重印与许可
