使用定制缓冲液中的微珠打浆，然后进行 NGS 工作流程进行分枝杆菌 DNA 提取

Summary

该方案显示，磁珠打动与 DNA 捕获磁珠纯化相结合，为从 结核分枝杆菌 样品中提取 DNA 提供了一种快速一致的方法，使其成为下一代测序应用的有效选择。

Abstract

结核病是一种致命的疾病，致病菌结核分枝杆菌中出现抗生素耐药 性，使治疗结果恶化。需要通过测序技术精确、快速地鉴定耐药性，以通过量身定制的治疗方案来改善结核病患者的预后。DNA 提取方法对于下游分子检测至关重要，并且由于 分枝杆菌坚韧的细胞壁、许多临床样品的低杆菌载量以及痰基质的复杂性而变得复杂。有许多 结核分枝杆菌 DNA 提取方法报道，但目前没有金标准。此外，这些方法中很少有被证明始终有效，而且许多方法不适用于资源匮乏和高负担的结核病环境。因此，实验室经常引入自己的程序修改，从而导致显著的方法差异。在这里，我们提出了一种经济高效、快速和标准化的方案，用于从临床痰液和培养物中提取分枝杆菌 DNA，该方案可产生适合 qPCR 的 DNA，应考虑在临床诊断实验室中使用。

Introduction

使用靶向下一代测序 （NGS） 和全基因组测序 （WGS） 检测耐药结核病 （TB） 从 结核分 枝杆菌中提取高质量的 DNA 是必要的，但经常被忽视。我们开发了一种标准化方案，为临床 NGS 应用提供一致、高质量的 DNA，包括 Deeplex-MycTB （GenoScreen） 和全基因组测序等靶向 NGS 方法，这些方法现在被世界卫生组织 （WHO） 推荐用于耐药结核病的诊断。值得注意的是，虽然 WHO 推荐了这些基于 NGS 的诊断策略，但它并未指定支持它们的特定 DNA 提取方案。我们的方法可用于 WHO 认可的测试以及需要高质量分枝杆菌 DNA 的新兴技术。

提取挑战源于结核分枝杆菌独特的细胞壁，该细胞壁由分枝杆菌酸和脂质组成，使其极难破裂。目前公布的提取解决方案在裂解（例如超声处理、化学、加热和磁珠打击）和 DNA 提取方法（例如苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀、基于 CTAB 以及基于柱和磁珠的方法）方面存在很大差异，这导致 DNA 产量、纯度和质量存在差异 1,2,3,4,5,6,7,8 ^，9,10,11,12,13,14,15,16。此外，研究小组很少使用相同的 DNA 提取方法，并且经常以不同的方式衡量成功。这使得确定哪种方法效果最好变得困难，因为最佳方法取决于分子应用的类型。例如，与运行仅针对一小部分 rpoB 的付费诊断工具相比，使用长读长测序解析痰液中的结核分枝杆菌结构变异需要更高质量的 DNA 和更准确的聚合酶。有几个因素使 DNA 提取成功进一步复杂化。我们可以提取的 DNA 量因样品类型、存在的细菌数量以及是否存在干扰该过程的物质（共提取的非分枝杆菌 DNA 和 PCR 抑制剂）而异。甚至技术方面，如实验室技术人员的移液精度也会影响结果。在处理细菌载量低或 DNA 污染水平高的样品时，当前的方法往往无法满足要求，这在临床环境中很常见 17,18,19。

在定制缓冲液中打珠，然后进行珠子纯化方案，与其他方法相比具有关键优势。这是一种简单快速的工作流程，可减少作员依赖性变异的机会，并保持下游 NGS 应用的 DNA 完整性。这种标准化方法特别适合使用 WHO 推荐的 NGS 耐药检测和所有 WGS 应用寻求可靠、可重现结果的临床实验室。

Protocol

这项研究是在机构生物安全委员会批准 （BUA #BU198320-01GBUA/BABB） 下在加州大学旧金山分校 （UCSF） 进行的，并遵循 UCSF 研究伦理指南。我们根据 IRB 批准的同意弃权协议从 IRB 批准的非结核病呼吸系统疾病个体中获得了 Discovery Life Sciences 收集的残余痰液样本。

1. 缓冲液的制备

1. 定制 Triton 缓冲液（表 1）：要制备 100 mL 定制 Triton 缓冲液，首先混合 2 mL 5 M NaCl、1 mL 1 M Tris-HCl （pH 8）、1 mL Triton X-100 和 0.2 mL 0.5 M 乙二胺四乙酸 （EDTA）。加入超纯水，使总体积达到 100 mL。过滤器 使用前消毒。最终缓冲液含有 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 和 1% Triton X-100。
2. 低 EDTA TE（表 2）：要制备 100 mL 低 EDTA TE 缓冲液，请混合 1 mL 1M Tris-HCl （pH 8） 和 0.02 mL 0.5 M EDTA。加入超纯水，使总体积达到 100 mL。最终缓冲液含有 10 mM Tris-HCl 和 0.1 mM EDTA。

2. 裂解管的制备

1. 使用手术刀刀片小心地切下拐点正下方的 1.5 mL 螺帽管底部。
2. 从 P1000 尖端上切下尖端，在末端附近切出一个 V 形楔形，然后将准备好的螺帽管底部楔入其中。有关勺子的示意图，请参阅 图 1 。
3. 用 0.1 mm 氧化锆-硅酸盐珠子填充无菌容器（例如，储液槽或培养皿），并使用准备好的勺子将一勺珠子 （~200 mg） 分配到 1.5 mL 螺旋盖管中。

图 1：内部微珠分布勺。 该勺设计用于将 ~200 mg 0.1 mm 锆珠轻松转移到处理管中。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 准备输入

注意：所有样品制备均应根据您设施的生物安全方案进行。我们强烈建议在 II 类生物安全柜 （BSC） 内处理传染性材料，以最大限度地降低气溶胶暴露的风险。

1. 细菌细胞培养
   1. 在 15 mL 锥形离心管中以最大速度 （≥ 3,000 x g） 将 ~ 5 mL 结核分枝杆菌培养物（MGIT 或浑浊液体培养物）离心 10 分钟。
   2. 使用 10 mL 血清移液管，小心去除除 ~ 500 μL 外的所有上清液，不要干扰沉淀。用 P1000 移液器去除剩余的上清液，不要干扰沉淀。
   3. 通过上下吹打，将沉淀重悬于 350 μL 定制 Triton 缓冲液中。如果需要（即，取出样品以在 BSL-3 之外进行处理），根据标准作程序灭活样品。
2. 痰液制备
   1. 将 1-5 mL 痰液样品（自然或诱导）转移到无菌 50 mL 离心管中。
3. DTT 液化
   1. 向痰液样品中加入四体积的 100 mM 二硫苏糖醇（体积可能会有所不同）。如果使用商业试剂，请遵循制造商的稀释说明。
   2. 彻底涡旋 30 秒。在室温 （20-25 °C） 下孵育 7 分钟。再次涡旋 30 秒。
   3. 重复步骤 3.3.1。和 3.3.2.1x，对于非常粘稠的样品，最多可执行 5 次孵育涡旋循环。
   4. 以最大速度 （≥ 3,000 x g） 离心 10 分钟。使用 10 mL 血清移液管，小心丢弃除 ~ 500 μL 以上清液外的所有上清液。用 P1000 移液器去除剩余的上清液，不要干扰沉淀。
   5. 将沉淀重悬于 350 μL 定制 Triton 缓冲液中。
4. NALC-NaOH 液化
   1. 要制备 NALC-NaOH 溶液，请按照制造商的说明进行制备和稀释。
   2. 向痰液样品中加入四体积的 NALC-NaOH 溶液（自发或诱导，体积可能会有所不同）。
   3. 涡旋 30 秒。在室温 （20-25 °C） 下孵育 7 分钟。重复步骤 3.4.1 和 3.4.2。1 倍。对于非常粘稠的样品，最多可执行 5 次孵育涡旋循环。
   4. 将 PBS 添加到 50 mL 标记处。短暂涡旋混合。以最大速度 （≥ 3,000 x g） 离心 10 分钟。
   5. 使用 50 mL 血清移液管，小心丢弃除 ~ 500 μL 外的所有上清液。用 P1000 移液器去除剩余的上清液，不要干扰沉淀。
   6. 将沉淀重悬于 350 μL 定制 Triton 缓冲液中。如果需要（即，取出样品以在 BSL-3 之外进行处理），根据标准作程序灭活样品。

4. 提取 DNA

1. 将灭活的细菌悬浮液（步骤 3 中的 350 μL）转移到新的标记良好的 1.5 mL 螺口管中，该管含有 ~250 μL 0.1 mm 氧化锆硅酸盐珠。
2. 珠子以 6.5 m/s 的速度敲打裂解物 45 秒，两次运行之间休息 2 分钟。重复总共三个打珠循环。
3. 以最大速度 （≥ 12,000 x g） 离心 2 分钟，然后将 150 μL 上清液转移到新的标记良好的试管中。注意不要转移微珠或细胞碎片。
4. 让净化磁珠平衡至室温 30 分钟，并彻底涡旋以确保在使用前完全重悬。
5. 加入 180 μL（1.2 倍体积）的纯化磁珠，并通过上下吹打 10 倍混匀。在室温下孵育 2 分钟。
6. 放在磁力架上，等待溶液澄清 ~ 2 分钟。使用 P200 移液器，小心丢弃上清液，不要干扰磁珠。
7. 在试管仍在磁力架上的情况下，加入 500 μL 新鲜制备的 70 % （v/v） 乙醇，沿对面的试管壁分配到磁珠上。等待 30 秒。
8. 重复步骤 4.5。- 4.7.总共两次洗涤。在最后一次洗涤结束时，用 P10 移液器去除残留的乙醇。短暂干燥珠子 ~ 2 分钟。
9. 磁珠沉淀变得不透明后，立即从磁力架上取下试管，并重悬于 20 μL 低 EDTA Tris 缓冲液中。不要让珠子变干和开裂。
10. 通过移液或涡旋混合，以确保所有珠子都在溶液中。在室温下孵育 5 分钟。
11. 放在磁力架上，等待溶液澄清 ~ 2 分钟。将洗脱的 DNA 转移到新的标记良好的试管中进行下游分析。吸出 <20 μL 提取的 DNA，以避免磁珠残留。

5. 分枝杆菌 DNA 的 qPCR 计数

1. 要使用靶向分枝杆菌 atpE （Rv1305） 的 99 个核苷酸的定量 PCR 定量分枝杆菌 DNA，每个样品在冰上组装 10 μL 反应混合物，其中含有 5 μL 通用探针预混液 （2x）、0.4 μL 正向引物（5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3'，10 μM）和反向引物（5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3'，10 μM），0.2 μL TaqMan 探针（5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3'， 10 μM）、2 μL DNA 模板和 2 μL 无核酸酶水（表 3）。
2. 使用以下热循环条件运行反应：在 95 °C 下初始变性 60 秒，然后在 95 °C 下 10 秒和 60 °C 下 30 秒的 35 个循环（此处捕获，使用 2.11 °C/s 的升温速率; 表 4）。
   注：在本例中，在 QuantStudio 3 实时荧光定量 PCR 系统上使用带有 VIC 标记探针的 TaqMan 检测进行 qPCR，
3. 一式三份运行所有样品、标准品和对照品。使用纯化的 结核分枝杆菌 DNA 的梯度稀释液生成标准曲线。使用分析软件进行相对定量分析。
4. 将得到的相对定量值导出为 CSV 格式，并使用 R Studio（版本 2024.09.1+394）进行可视化，以生成比较不同提取方法的 DNA 产量的箱形图。

Results

我们在培养的 结核分 枝杆菌和 结核分 枝杆菌加标痰液样本上测试了 DNA 提取方案 （每种情况 n = 3）。使用培养的 结核分 枝杆菌 H37Rv mc² 7901，我们将输入标准化为每 50 μL 8.4 x 10⁶ 个细胞，相当于 1 mL 的 200 GU MGIT 培养物。对于痰液实验，我们加标了 1 mL 来自非结核病呼吸系统疾病个体（市售）的痰液，这些痰液具有两种不同的细菌浓度（50,000 个，大约是 1+ 痰涂片等级，和 10,000 个杆菌，大约是稀疏的痰涂片等级），以评估该方法在不同细菌载量下的性能。

我们使用靶向单拷贝基因的定制 TaqMan qPCR 评估了 DNA 产量（图 2）。我们在所有样品中检测到结 核分 枝杆菌 DNA，包括纯培养物和加标痰液，重复之间几乎没有差异;然而，我们观察到仅用 10,000 个细胞加标的痰液的定量存在很大差异。

...

Discussion

在这项工作中，我们提出了一种稳健的、经过验证的方案，用于使用磁珠敲击和磁珠纯化提取高质量的结 核分 枝杆菌 DNA，用于下游分子和 NGS 应用。

与现有的 结核分枝杆菌 DNA 提取方案相比，该方法具有多项优势。传统的苯酚-氯仿萃取通常需要几天时间并引入危险化学品，而这种方法可在 60 分钟内完成，且危险废物最少。这种方法为试剂采购提供了灵活性 - 缓冲液可以从多个供应商处购买或内部制备，从而减少对单个供应商的依赖。甚至磁珠本身也可以在中等复杂度的实验室中合成²⁰。尽管市售微珠可能提供更高的产量，但该方法具有很强的适应性，使实验室能够在保持性能的同时优化成本。总体而言，这种方法快速、可重现，并且在多个实验和不同批次的样品中表现一致。因此，应考虑将其用于直接从痰液中靶向 NGS 测定和培养分离株的 WGS。

关键步骤和故障排除需要仔细注意。二氧化锆珠的均匀分布至关重要 - 我们...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 毫米氧化锆硅酸盐珠	Biospec 产品	11079101z	用于裂解分枝杆菌细胞的珠子跳动步骤的珠子
AMPure XP 磁珠	贝克曼库尔特	A63880	用于裂解后 DNA 纯化的磁珠
EDTA（0.5M，pH 8.0）	赛默飞世尔科技	AM9260G	定制 Triton/低 EDTA 缓冲液组分
快速准备 24	MPbio， 美国	116004500	6.5 m/s 的珠子敲打设备
正向引物	赛默飞世尔科技	自定义合成	引物序列：AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O（水，分子生物学级）	赛默飞世尔科技	BP2819-1型	定制 Triton/低 EDTA 缓冲液组分
Luna 通用探头	新英格兰生物实验室	型号M3004	用于分枝杆菌 DNA 计数的 qPCR 试剂
MycoPrep 试剂盒	屋宇 署	SKU/REF 240863	用于 NALC-NaOH 痰液处理的 BD MycoPrep 标本消解
NaCl（氯化钠，5M 溶液）	赛默飞世尔科技	AM9759	定制 Triton/低 EDTA 缓冲液组分
公共广播公司	米利波尔西格玛	第 2272 页	痰液处理
反向底漆	赛默飞世尔科技	自定义合成	引物序列：GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan探头	赛默飞世尔科技	自定义合成	探针序列：AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl （1M，pH 8.0）	赛默飞世尔科技	AM9855G	定制 Triton/低 EDTA 缓冲液组分
海卫一 X-100	赛默飞世尔科技	28314	定制 Triton/低 EDTA 缓冲液组分