为了更好地理解软骨细胞对机械性软骨超负荷的损伤反应，本方案描述了一种ex vivo软骨冲击模型的建立方法，该模型在24小时内处于亚致死状态。
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摘要
摘要
创伤后骨关节炎（PTOA）是一种常见、退行性且疼痛进行性加重的关节疾病，通常在严重关节创伤后发生，影响超过600万美国人。冲击引起的软骨损伤会导致软骨细胞损伤反应，最终发展为PTOA。了解与软骨细胞损伤相关的分子事件，对于开发预防PTOA或延缓其进展的治疗方法至关重要。为此，研究人员建立了一种ex vivo软骨冲击模型，该模型在24小时内对组织为亚致死性损伤。从牛的掌指关节获取骨软骨外植体，并使用落锤装置对外植体施加冲击载荷。为确保应力和冲击相对均匀地作用于关节软骨，将外植体的骨面朝上放置，并从上方对骨面进行冲击。通过4.0 cm、4.5 cm和5.0 cm的落锤高度对外植体施加不同的载荷，分别产生平均峰值应力为10.87 ± 1.84 MPa、11.69 ± 0.67 MPa和12.98 ± 0.75 MPa。本研究分析了在冲击后培养期间软骨下骨的存在对软骨的影响，以及使用贴合式或松动式固定装置在冲击过程中的作用，评估了细胞活力和细胞凋亡情况。结果表明，在4.5 cm高度进行冲击，结合使用贴合式固定装置并在冲击后立即去除骨组织，可在冲击后24小时诱导出软骨损伤最显著而细胞死亡最少的最优模型。
引言
创伤后骨关节炎（PTOA）是一种致残性疾病，在美国影响超过500万成年人1。一次单一的软骨创伤性损伤即可引发软骨细胞损伤反应，导致早发性症状以及终身的关节疼痛和功能障碍2。软骨自身几乎不具备内在修复能力，因此目前迫切需要开发能够改变疾病进展的治疗方法3。由于PTOA与一次明确界定的创伤事件相关，因此存在在疾病进展前进行干预的机会。然而，这类治疗方法的开发受到现有知识空白的限制，即调控软骨细胞损伤反应并导致创伤后骨关节炎的分子信号机制尚不明确2,3,4。更深入地理解软骨细胞损伤后的分子事件，有助于设计新的治疗策略，以挽救软骨细胞的损伤反应，从而预防或延缓PTOA的发生和发展2,5,6。
为了更好地理解软骨细胞损伤的分子信号机制，以往的研究利用落塔或类似装置对软骨组织样本施加机械冲击，以启动损伤反应。这些研究试图表征该反应的多个方面，包括力学性能和结构的变化7,8、基质损伤与合成6,9,10,11、线粒体功能障碍12,13,14,15、离子转运通路16,17,18,19 以及基因表达9,11,20,21,22,23。然而，在许多此类研究中，细胞活力要么未被报告，要么已受到损害，部分研究中细胞活力仅为50%或更低24,25,26。低细胞活力的混杂效应可能使损伤反应的研究变得困难。关节创伤后立即发生的软骨细胞死亡是不可逆的，但针对软骨细胞损伤的治疗可减轻继发性创伤后骨关节炎（PTOA）27。为了识别与软骨细胞损伤相关而非活细胞丢失相关的分子变化，有必要建立一种能够在一段时间内维持软骨细胞活力的软骨冲击模型。此外，若软骨冲击能够在整个软骨组织中产生相对均匀的软骨细胞损伤反应，则在分析细胞行为时将获得最为一致的结果。
本研究的目的是开发并表征一种经济高效的 离体 一种可保留急性软骨损伤应答中固有信号通路研究能力的冲击损伤模型。此外，该模型还可用于评估潜在的干预措施对损伤应答的挽救效果。为实现这一目标，我们首先建立了一种无菌技术，利用安装在钻床设备上的金刚石钻头，从骨骼成熟牛的掌指关节获取软骨组织外植体。掌指关节在动物屠宰加工为食品时通常被屠宰场丢弃，因此该关节是一种易于获取且成本低廉的组织来源。随后，我们建立了一种冲击损伤模型，将骨软骨样本置于落锤装置下方的固定夹具中。在此模型中，骨软骨样本以其关节面朝下放置于8号镜面抛光不锈钢表面，从上方对骨组织施加冲击，从而使软骨组织受到相对均匀的载荷。我们确定了在冲击后24小时内维持软骨细胞活力的同时，仍能触发细胞凋亡分子损伤应答的冲击参数。我们评估了在冲击过程中允许样本产生不同程度侧向移动的夹具对细胞活力和凋亡的影响；最后，还评估了冲击后将软骨从软骨下骨分离对损伤应答的影响。
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方案
使用从当地屠宰场获取的牛肢无需伦理审批，因为这些组织是在动物被屠宰用于食物消费后采集的。
1. 骨软骨组织块的获取
- 在取材前，使用高压灭菌器对以下材料进行灭菌：磷酸盐缓冲液（PBS；每个关节约 1 L）、取芯钻头、水旋转接头、一个可高压灭菌的冲洗瓶、一个手术刀柄、两把镊子和一把解剖锯片。
- 在组织培养超净台内放置钻机和台钳，并在台下放置接液盆以容纳 PBS。将取芯钻头和旋转接头安装到钻机上，并通过软管将旋转接头喷嘴连接至装有灭菌 PBS 的大瓶。组装解剖锯并置于超净台内（图 1A-B）。
- 在组织培养超净台内叠放一次性垫巾，每个关节使用一张。
注意：垫巾用于吸收打开关节时可能滴落的 PBS 和滑膜液。叠放多层垫巾可在表层过湿时方便更换，从而在整个操作过程中保持工作区清洁干燥。 - 准备一个含有 70% 乙醇的 50 mL 离心管和另一个含有 0.13% v/v 聚维酮碘（betadine）PBS 溶液的 50 mL 离心管，并将其放入超净台内。将镊子和手术刀柄放入乙醇管中以维持无菌状态，在超净台后部放置一个无菌的 6 孔细胞培养板。
- 为每个预期样本准备 3 mL 细胞培养基。培养基成分为含 0.9 mM 丙酮酸钠的改良伊格尔培养基（DMEM）、胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、50 mg/mL L-抗坏血酸、最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、青霉素、链霉素和两性霉素 B。L-抗坏血酸和 ITS 需在使用当天添加28。
- 从当地屠宰场获取骨骼成熟牛的前肢，动物宰杀后 6 小时内取材。运输过程中将组织置于冰上保存。
- 使用肉类带锯切除蹄部 ，分离掌指关节 ，注意不要切开关节囊。使用 #22 手术刀片去除皮肤，避免穿刺关节囊。
- 在生物安全柜外用冷水彻底冲洗每条腿，去除污物，并涂抹聚维酮碘进行消毒。
- 在组织培养超净台内，使用新的 #22 手术刀片切开关节囊。分离远端关节，并用冲洗瓶中的 PBS 保持关节软骨湿润（图 1C）。用浸有 PBS 的无菌纱布覆盖关节软骨，以维持其水分。
- 使用解剖锯切断跖骨，进一步分离远端掌指关节（图 1D）。将远端关节放入台钳中，使覆盖软骨的一面朝上，并夹紧固定。在整个过程中，定期用 PBS 润湿软骨表面的纱布。
- 将纱布从一侧髁部移开，并调整台钳位置，使取芯钻头对准关节面最平坦的区域（图 1E）。
- 打开大瓶阀门，使 PBS 流经取芯钻头。使用冲洗瓶持续用 PBS 润湿组织，并在钻孔过程中冷却样品。
注意：大瓶和冲洗瓶中的 PBS 在取芯过程中具有冷却作用。 - 缓慢向下压钻头进入髁部表面，进行取芯操作。频繁释放压力，使热量得以散发。持续操作直至取芯深度达到软骨下骨约 2 mm 处。两侧均重复此步骤（图 1E）。
注意：过热的迹象包括液体迅速蒸发或出现烧焦气味。 - 使用解剖锯平行于关节软骨表面切割骨骼，释放骨软骨芯体；切割时持续从冲洗瓶向解剖锯与骨软骨交界面挤出 PBS。此步骤中应保持关节软骨表面覆盖湿润纱布，防止脱水。
- 将骨软骨芯体（图 1F）储存于稀释的聚维酮碘溶液中（见步骤 1.3），直至所有关节处理完毕。
- 用 PBS 冲洗骨软骨芯体，然后将样品转移至含有 3 mL 预热培养基（含 0.9 mM 丙酮酸钠的 DMEM，胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、50 mg/mL L-抗坏血酸、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和两性霉素 B）的无菌 6 孔板的各个孔中28。将样品置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中，直至次日进行冲击实验。
2. 骨软骨组织外植体冲击
- 制备具有镜面抛光冲击面的不锈钢冲击架（补充图1 和 补充图2）并在落塔底板上钻出相应的孔（补充图3).
- 使用高压灭菌器在冲击实验前对以下材料进行灭菌：直径15 mm的不锈钢球形冲击头、带有镜面抛光冲击表面的不锈钢固定夹具、4个6/32螺丝、4个垫圈、镊子。
- 放置一个先前已设计并制造好的落塔29 进入生物安全柜。使用带有下落塔的装置，其上安装有直径为15 mm的球形冲击头，该冲击头固定在配备有载荷传感器和加速度计的滑车上（图2A，本研究中总载荷质量为358.4 g。
- 用四颗经高压灭菌的螺丝将固定夹具安装至落塔的底板上（图2B在此研究中，测试了具有直径为8.7 mm和9.1 mm圆形开口的持样架。
- 将骨软骨芯放入持针器中（补充图1，补充图2，补充图3) 置于落塔撞击头下方，骨组织面向上。
注意：将骨软骨芯放置时，骨面朝上，关节面朝下30 选择该条件以实现更均匀的上样。 - 将落塔载物台调整至相对于骨组织顶部的所需高度。根据预实验确定落塔的大致高度。本研究中评估了4.0、4.5和5.0 cm的高度。
- 点击 开始 数据采集软件上的按钮（补充编码文件 1）在通过松开主轴停止装置释放落塔载物台之前图2A）并让冲击头在重力作用下自由下落撞击样品。立即抬起载物台，并将其放置在主轴止动销上。
注意：在冲击过程中，将使用连接至数据采集模块的数据采集软件以100 kHz的频率采集数据，该模块记录来自冲击头与滑车之间负载传感器以及加速度计的信号。尽管我们在冲击后会尽快提升滑车，但设备不具备防反弹功能或其他防止二次冲击的机制。 - 将数据采集软件生成的 .txt 文件与 Matlab 数据分析代码放在同一文件夹中（补充编码文件 2，也可在以下网址获取 https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis）并运行数据分析代码，以过滤原始数据并计算冲击参数。
注意：数据分析代码采用0.563 mm的软骨厚度来计算冲击能量。该数值是根据测得的软骨厚度取平均值得出的 > 在另一项研究中，使用针刺法对五个样本的各50个位置进行检测31 以及Biomomentum Mach-1力学测试仪。冲击参数的计算方法如前所述32. - 使用#11手术刀片根据需要从骨组织上切除软骨。将样本放回培养基中，并置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱内2 直至次日进行成像。
注意：本研究评估了在冲击后立即或冲击后24小时去除骨组织中软骨的影响。
3. 软骨样本中细胞活力的表征
- 必要时从骨组织上剥离软骨。使用锋利的手术刀将软骨样本切成两半。避免多次切割，应尽量做到一次切开，以确保切口平滑。
- 将每半个待测样本浸入含有5 µM碘化丙啶同型二聚体（ethidium homodimer）和2.5 µM钙黄绿素AM（calcein AM）的PBS溶液中。避光条件下于室温孵育30分钟，完成活死细胞染色。
- 用PBS冲洗样本两次，并将样本保存在PBS中直至成像。染色完成后应尽快进行图像采集。
- 将软骨样本直立放置于共聚焦培养皿中的数滴PBS液滴上，使软骨的完整半圆形结构能从显微镜前方清晰可见。使用倒置共聚焦显微镜进行成像。若样本无法自行直立，可用镊子轻微弯曲使其保持直立状态。
- 使用FIJI（ImageJ集成插件版本）33，首先点击图像 > 类型 > 8位，将图像转换为8位图像。 然后在图像 > 调整 > 阈值中设置阈值，并点击应用。 接着在处理 > 二值化中执行分水岭功能，并在分析中对绿色和红色通道分别运行分析颗粒…。为确保组间比较的准确性，应分析每个样本在相同z轴高度下采集的图像。
- 通过将活细胞数量除以样本中的总细胞数，计算细胞活力。
4. 软骨标本中细胞凋亡的表征
- 将每个感兴趣的半份样本浸入含8 µM Caspase-3/7 Green Detection Reagent的PBS溶液中。避光，37 °C孵育30分钟。
- 用PBS洗涤样本3次。将染色后的样本在4%多聚甲醛（PFA）中孵育15分钟以进行固定。再次用PBS洗涤，并将样本保存在PBS中直至成像。染色后24小时内完成成像。
- 使用共聚焦显微镜成像（参见上述步骤3.4）。为在不同组间进行有效的荧光强度比较，所有样本的成像参数必须保持一致，包括物镜、激发激光功率、光电倍增管检测器增益、针孔大小、光学切片厚度、扫描速度、线平均次数和图像分辨率。
- 在ImageJ的FIJI扩展程序中，于分析 > 设置测量值… 菜单下选择平均灰度值。
- 使用多边形选区工具勾勒图像中样本的整个区域。在分析菜单下执行“测量”功能，并记录平均灰度值，各组之间使用相同的处理参数。
- 使用多边形选区工具选择图像中不含样本的区域，再次执行“测量”功能。将此值记录为背景平均灰度值。
- 通过从样本的平均灰度值中减去背景平均灰度值，计算荧光强度。
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结果
使用落塔对骨软骨离体组织施加机械冲击载荷，落塔的载物台高度分别为距组织上方4.0 cm、4.5 cm和5.0 cm（n = 3或4）。增加载物台释放前的高度会导致更高的冲击力、平均峰值应力、加载速率和冲击能量（表1）。
我们旨在建立一种在冲击后24小时内对软骨细胞非致死性的ex vivo软骨损伤模型。通过在不同落塔高度下冲击后24小时进行活/死细胞染色表征，结果显示，取材过程所获得的软骨组织块在样本中心区域具有高达98.4% ± 0.05的细胞活力。在冲击后24小时，4.0 cm和4.5 cm冲击组的细胞活力与未冲击对照组相比无显著差异，但在5.0 cm高度冲击组中观察到显著下降（图3A）。此外，荧光强度显示凋亡信号在4.0 cm冲击组中较未冲击对照组显著升高，在4.5 cm和5.0 cm冲击组中进一步增强（图3B）。基于这些数据，我们选择4.5 cm的落锤高度用于后续研究，因其可在不导致活细胞丢失的情况下引发显...
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讨论
本研究的目的是表征并优化一种不影响细胞活力的软骨冲击模型，用于研究软骨细胞损伤后的分子事件，最终目标是开发出能够挽救受损细胞以防止创伤后骨关节炎（PTOA）进展的治疗方法。为实现这一目标，机械载荷被施加到骨软骨核心的骨部，从而将载荷传递至软骨组织。此外，我们考察了不同的冲击高度、冲击过程中不同固定板的影响，以及冲击后软骨组织培养中骨组织存在的影响。这些参数的综合分析为该模型提供了重要见解，表明在使用贴合良好的固定板条件下，以4.5 cm的冲击高度进行冲击，并在冲击后立即去除软骨中的骨组织，是诱导显著软骨细胞损伤反应同时维持细胞活力的最佳方案。
选择4.5 cm冲击高度的原因是其产生的平均峰值应力（11.69 ± 0.67 MPa）不会导致细胞死亡，但可诱导显著的软骨细胞损伤。从4 cm高度冲击的样本（平均峰值应力：10.87 ± 1.84 MPa）也未表现出显著的细胞死亡，但较低的caspase激活表明其损伤程度不如4.5 cm冲击样本显著。此外，尽管从5 cm高度冲击的样本在最大平均应力达12.98 ± 0.75 MPa时可诱导显著的软骨细胞凋亡，但其细胞活力相较于4 cm和4....
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助项目R21 AR080255支持。作者感谢Kevin Carr为本项目提供的机械加工与制造方面的专业知识。作者感谢印第安纳州穆尔斯维尔的穆尔斯维尔肉铺（Mooresville Butcher Shop）为本研究提供组织样本。作者感谢印第安纳大学生物显微镜核心设施工作人员在共聚焦显微镜实验中的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #11 无菌手术刀片 | 赛默飞世尔科技 | 10-001-823 | 去除骨骼中的软骨 |
| #22 无菌手术刀片 | 赛默飞世尔科技 | 10-001-833 | 去除牛组织的皮肤，并通过切断韧带打开关节 |
| 10-1000 微升移液器吸头 | 赛默飞世尔科技 | 02-707-411 | 测量并转移 PBS、培养基及其他溶液 |
| 200 proof 乙醇 | 赛默飞世尔科技 | 03-007-647 | 用于配制70%乙醇作为消毒剂，以对手术器械进行消毒，并在组织制备与处理过程中维持无菌环境。 |
| 50 mL 离心管（无菌） | 赛默飞世尔科技 | 339652 | 用于储存培养基和样品 |
| 5加仑大瓶 | 赛默飞世尔科技 | 04-355-233 | 连接软管与旋转接头的无菌 PBS 容器。 |
| 6孔板（无菌） | 赛默飞世尔科技 | 140685 | 用于在收集、冲击研究前的孵育及成像过程中，将骨软骨芯暂时储存在含有预热培养基的无菌环境中 |
| 加速度计 | 基斯特勒 | 8743A5 | 用于测量冲击过程中产生的加速度 |
| 细胞凋亡染色试剂盒（CellEvent） | 赛默飞世尔科技 | C10423 | 用于检测和可视化凋亡细胞 |
| 可高压灭菌的洗瓶 | Nalgene | 2405-0500 | 用无菌 PBS 浸润软骨，以在组织取材过程中保持其水合状态。 |
| 解剖锯 | Mopec | BD 810 | 在打开关节或提取骨软骨芯后，去除任何多余的骨骼 |
| 尸检锯片 | Mopec | BD 101 | 用于切割骨骼，以分离和获取骨软骨组织 explants。 |
| 聚维酮碘 | Avrio Health L.P. | n/a | 用于在将牛样本转移至超净台前对其外部进行消毒，并稀释后用于最终骨软骨样本的消毒。 |
| 透明 4 英尺软管 | n/a | n/a | 用于连接盛有 PBS 的 5 升试剂瓶与台钻的旋转接头 以运输 PBS。 |
| 取芯钻头 | UKAM工业超硬工具 | 3EDCD7160 | 用于通过钻取关节软骨和软骨下骨来提取骨软骨组织块。 钻头直径：7/16" （电镀金刚石取芯钻头） |
| 活动扳手 | McMaster Carr | 5362A1 | 用于拧紧夹具（固定关节位置）并紧固空心钻头 |
| 一次性血清移液管 | 赛默飞世尔科技 | 13-678-11 | 测量并转移 PBS 和培养基 |
| 一次性护理垫 | 赛默飞世尔科技 | 23-666-062 | 用于覆盖操作台面，以便在采收过程中吸收水分和液体，提高便利性与卫生程度 |
| 一次性真空滤器单元 | 赛默飞世尔科技 | SCGP00525 | 过滤 PBS 及其他溶液 |
| 台式钻床 | WEN | 433TV 3.25英寸 | 对骨软骨样本进行钻孔并施加作用力——WEN 433TV 3.25英寸工业级台式钻机 |
| 钻床倾斜角虎钳 | WEN | TV434 | 在取芯过程中，将骨软骨样本固定在所需角度的预定位置。 |
| 落塔 | 定制 | n/a | 用于对样品施加冲击 |
| FIJI（ImageJ 扩展） | n/a | n/a | 用于处理和分析显微镜图像的软件，包括细胞活力和细胞凋亡定量 |
| 镊子 | Fisherbrand | 12-000-163 | 用于在通风橱内切割组织、打开关节并转移样本 |
| 纱布（无菌） | Dukal | 6412 | 用于关节囊打开后水化关节软骨 |
| 1 升玻璃培养基瓶 | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | 用于储存无菌 PBS |
| 手套 | 赛默飞世尔科技 | 19-130-1597D | 用于保护采集团队 |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin-Transferrin-Selenium, ITS） | Gibco | 41400-045 | 培养基添加剂 |
| LabVIEW 数据采集软件 | 国家仪器公司 | n/a | 在冲击测试期间采集来自载荷传感器和加速度计的数据，以供后续分析。 |
| L-抗坏血酸 | 默克 | A4403 | 培养基添加剂 |
| 激光共聚焦扫描显微镜 | 奥林巴斯 | FV1000D | 用于获取染色组织样本的高分辨率三维图像。 |
| 活细胞与死细胞染色检测试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | L3224 | 用于区分组织样本中活细胞与死细胞，以评估细胞活力 |
| 加载细胞 | 基斯特勒 | 9712B5000 | 用于测量冲击过程中施加的力。 |
| MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | |
| 肉类带锯 | Skymsen | MSKLE | 从牛样本中移除腕部蹄部组织 |
| 10-100 μL 微量移液器 | 赛默飞世尔科技 | FBE00100 | 测量与转移 PBS 和培养基 |
| 最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140-050 | 培养基添加剂 |
| 改良型伊格尔培养基’DMEM培养基 | Gibco | 10566-016 | 骨软骨组织块培养 |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15-140-148 | 培养基添加剂 |
| 磷酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | BP399-20 | 用于冲洗、水合和冷却组织，以维持生理条件、防止脱水，并用于配制染色溶液 |
| 落塔上的样品支架 | 定制 | n/a | 在冲击过程中固定骨软骨核心。 |
| 手术刀柄 | 赛默飞世尔科技 | 16-100-107 | 用于精确切割、组织解剖和打开关节。 |
| 螺钉（添加到 CAD） | 6-32螺纹规格 18-8不锈钢内六角螺钉 | ||
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | 培养基添加剂 |
| 球形冲击头 | McMaster Carr | 9292K52 | 在冲击程序前进行高压灭菌 |
| 外科口罩 | 过滤口罩 | 375101 | 用于保护采集团队 |
| 水转接头 | UKAM工业超硬工具 | 7035812 | 连接至取芯钻头，以提供持续的PBS流动进行冷却 钻孔过程中。 |
参考文献
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