方法文章

单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为

1.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68080

⸱

2025年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Horizons and School of Science, University of Wollongong, 2Howard Hughes Medical Institute, Rockefeller University, 3Laboratory of DNA Replication, Rockefeller University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种基于荧光显微镜的单分子DNA复制检测方法，可实现实时观察DNA聚合酶与G-四链体结构等障碍物之间的相互作用。

摘要

参与真核生物DNA复制的蛋白质 克服障碍（如蛋白质和DNA“路障”）的能力 对于确保基因组的精确 复制至关重要。 G-四链体是DNA中富含鸟嘌呤区域形成的高级核酸结构，已被证明可作为障碍物，干扰基因组维持通路。本研究介绍了一种基于实时荧光显微镜的方法，用于观察DNA聚合酶与G-四链体结构的相互作用。将含有G-四链体的短链引物DNA寡核苷酸固定在微流控流动池内经功能化的玻璃盖玻片上，随后引入荧光标记的DNA聚合酶，从而可随时间监测其行为和化学计量关系。该方法实现了对DNA聚合酶在G-四链体处停滞行为的观察。具体而言，利用荧光标记的酵母聚合酶δ发现，当其遇到G-四链体时，会持续进行结合与解离的循环。这种单分子检测方法可被拓展用于研究多种DNA维持蛋白与DNA底物上各类障碍物之间的相互作用。

引言

DNA聚合酶是一类催化脱氧核糖核苷三磷酸掺入以复制DNA的酶1,2,3,4,5。因此，它们在包括DNA复制6,7,8和DNA修复9,10,11,12在内的基本DNA维持过程中发挥关键作用。DNA聚合酶必须准确而高效地复制基因组，以维持基因组完整性，防止基因组中突变的积累。在合成过程中，聚合酶常常会遇到诸如DNA结合蛋白或DNA二级结构等"障碍物"13。这些障碍物可能减缓甚至阻断聚合酶的行进14。克服这些障碍对于确保基因组的忠实复制至关重要，因为若无法克服，可能导致基因组不稳定15,16。

一种主要的障碍是G-四链体（G4），这是一种非经典的DNA二级结构，已被证实可在人类基因组中富含鸟嘌呤的序列内形成17人类基因组中有超过70万个不同的序列能够形成G4结构，包括端粒区域和癌基因启动子区域18这些DNA结构会根据核苷酸序列、长度以及结合的金属阳离子而采取不同的构象。19,20,21这种多样性意味着聚合酶必须克服各种不同的G4拓扑结构，且克服效率可能各不相同。已有研究表明，聚合酶若无法克服或绕过G4结构，将阻碍复制叉的前进 体内，导致基因组不稳定性22. 体外 研究表明，G4 结构能够减缓甚至完全阻断酵母聚合酶的进程23,24,25,26,27G4结构阻滞或阻碍DNA聚合酶的能力完全取决于其动力学和热力学稳定性，某些聚合酶能够解旋特定的G4结构。28尽管这些研究揭示了聚合酶克服G-四链体障碍的能力，但它们无法直接观察聚合酶在遇到G4时的行为。聚合酶的命运——是保持结合、解离脱落，还是动态交换——决定了后续哪些过程可用于解决G4结构。

本研究开发了一种基于荧光的单分子显微镜检测方法，可实时直接观察和监测DNA聚合酶与G4结构的结合过程。该检测方法通过将可形成G4结构的DNA模板固定在微流控流动池中经生物素标记的盖玻片上，随后引入荧光标记的DNA聚合酶以启动DNA合成。通过随时间测量聚合酶的荧光信号，可直接观察其在遇到G4结构时的行为变化。本实验选用存在于c-MYC 癌基因中的G4结构，因其具有高度稳定性。该实验方案现可进一步拓展，用于系统记录多种来源于生命各领域的DNA聚合酶在不同G4拓扑结构和稳定性条件下的行为特征。本方法为揭示DNA聚合酶如何应对DNA结构障碍的分子机制提供了一种创新且高通量的研究手段，是深入理解聚合酶动态行为的有力工具。

方案

所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 圆二色光谱法

注意：在开发该检测方法之前，有必要对选定的G4序列进行圆二色光谱（CD）分析，以确保其正确折叠。该22个核苷酸的序列（5′-TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3′）可形成源自c-MYC 癌基因的G4结构。同时对一个对照序列（5′- TGAGTGTGAAGACGATGTAGAA -3′）进行了CD光谱分析，该序列的关键核苷酸已被改变，从而阻止G4结构的形成。

  1. 为准备圆二色光谱（CD）实验的DNA模板，将40 µL浓度为100 µM的22 nt模板加入360 µL含200 mM氯化钾（KCl）的Tris-HCl（pH 8.0）、乙二胺四乙酸（EDTA）（TE）缓冲液中。CD光谱实验所需的终浓度DNA为10 µM。
    注意：K+离子的存在对于稳定模板中的G4结构至关重要。
  2. 将DNA溶液置于数字干浴器中，95 °C加热15分钟。加热完成后，通过将加热块放入聚苯乙烯材料中过夜缓慢冷却。此缓慢冷却过程可促使G4结构的形成。
  3. 使用气密性注射器将400 µL的G4形成序列溶液及对照序列溶液转移至光程为0.1 cm的石英比色皿中。填充时应缓慢操作，避免产生气泡。
  4. 在25 °C条件下，使用圆二色光谱仪测定200 nm至400 nm范围内的CD光谱。该测量所用参数与条件此前已有描述29。结果见补充图1。
    注意：需记录缓冲液本身的CD光谱，作为空白对照。

2. DNA模板的制备

注意：可用于扩增的模板是采用标准分子生物学技术制备的短链100 nt引物线性模板。G4形成模板（5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGAA
CTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGGGGTGGGAGGGGT
GGGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3′）在其序列中心包含一段可形成来源于MYC基因的G-四链体结构（来自步骤1）。对照模板（5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGA
ACTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGATGTAGCAGAACT
GTGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3′）的中心位置也含有相同的对照区域（来自步骤1）。

  1. 将20 µM的引物（5′-Biotin-AF647-TCTTAATGTAAATTTAAAATGTGTC-3′）与20 µM的100 nt模板在含有200 mM KCl的TE缓冲液中混合，以使引物退火至G4形成模板及对照DNA模板上。
  2. 将DNA模板溶液置于数字干浴仪中，95 °C加热15分钟。完成后，将加热模块放入聚苯乙烯中缓慢冷却过夜，以促进G4结构的折叠及双链的退火。

3. 使用 AF647 标记 DNA 聚合酶

  1. 用染料标记聚合酶
    注意：酵母Pol δ的表达与纯化方法如前所述30然后需要使用 Alexa Fluor NHS 酯单反应性染料（AF647）对聚合酶进行标记，以实现单分子水平的可视化。该步骤按先前所述方法完成。5.
    1. 为了标记N端，将过量3倍的AF647染料与320 µL浓度为58.5 µM的Pol δ在以下缓冲液中于4 °C孵育10分钟：30 mM Tris-HCl（pH 7.6）、2 mM二硫苏糖醇（DTT）、300 mM氯化钠（NaCl）、50 mM谷氨酸钾和10%（v/v）甘油。轻轻旋转溶液以确保充分混匀并提高标记效率。
      注意：蛋白质序列中可能含有赖氨酸氨基酸残基上的额外伯胺基团。通过调整反应条件（如pH），可优先将标记物连接至N末端，而非赖氨酸残基。这可能需要进一步优化以提高标记效率。
    2. 为准备0.5 mL离心脱盐柱（7 K分子量截留），首先以1500 x g 离心1分钟以去除保存液。离心后弃去收集管中残留的溶液。
      注意：在离心步骤中务必松开离心柱的盖子。这将确保柱子能够充分洗脱。
    3. 用含有 30 mM Tris-HCl（pH 7.6）、300 mM NaCl、3 mM DTT、50 mM 谷氨酸钾和 5%（v/v）甘油的缓冲液对层析柱进行平衡：向柱顶加入 300 µL 缓冲液。以 1500 x g 1 分钟，弃去滤液。重复此过程两次。
    4. 将每种 Pol δ 样品各 200 µL 加入柱中。以 1500 x g 离心柱子 g 2 分钟后收集纯化的 Pol δ 至 1.5 mL 微量离心管中。
    5. 将纯化的组分在液氮中冷冻2 并将分装样品储存于 -80 °C，以防止蛋白质随时间降解。
  2. 确定标记效率
    1. 将2 µL标记有AF647的Pol δ样品加入紫外-可见分光光度计中31.
      注意：应首先测量Pol δ缓冲液的空白对照。
    2. 使用分光光度计测量AF647染料的激发波长为650 nm，Pol δ的激发波长为280 nm。
    3. 利用比尔-朗伯定律及270,000 cm⁻¹·M⁻¹的摩尔消光系数-1M-1 对于 AF647 染料和 195,960 cm-1M-1 对于聚合酶，计算标记效率。
      注意：本实验所用的AF647标记的酵母Pol δ的标记效率测定值约为67%。

4. 集群引物延伸实验

注意：在进行单分子复制实验之前，必须确认DNA聚合酶会被G-四链体阻断 通过 大规模复制实验

  1. 将数字干浴器中的加热块温度设定为 30 °C，以确保酵母 Pol δ 的最大活性。
  2. 在复制缓冲液（25 mM Tris-HCl (pH 7.6)、10 mM 醋酸镁、50 mM 谷氨酸钾、40 µg/mL 牛血清白蛋白 (BSA)、0.1 mM EDTA、5 mM DTT 和 0.0025% (v/v) Tween-20）中为G4形成模板和对照模板分别配制"主混合液"。每种混合液中添加 1 mM DTT、每种 dNTP（dTTP、dCTP、dATP、dGTP）各 250 µM，以及各自相应的 DNA 模板（G4形成或对照）各 10 nM。将这些混合液置于加热块中，使其温度升至 30 °C。
  3. 取 12 µL 每种主混合液，加入 12 µL 甲酰胺上样缓冲液（80% (w/v) 甲酰胺，10 mM EDTA），作为 T = 0 min 的对照。
  4. 为启动 DNA 合成，向每种主混合液中加入 AF647 标记的酵母 Pol δ（终浓度为 20 nM）。充分混匀，以确保 DNA 聚合酶能够高效复制模板。
    注意：使用过程中应将酵母 Pol δ 置于冰上，以保持酶活性。
  5. 在反应开始后 30 s、60 s 和 180 s 时，分别取出 12 µL 每种主混合液，并用 12 µL 甲酰胺上样缓冲液终止反应。主混合液与甲酰胺上样缓冲液 1:1 的比例可确保反应终止后复制过程不再继续。
  6. 将已终止反应的溶液从 30 °C 加热块中取出，转移至 98 °C 加热块中，以使双链 DNA（dsDNA）变性为单链 DNA（ssDNA）。加热 10 min 后，将整个加热块移至凝胶电泳槽旁，准备将样品加载到变性 15% 三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA（TBE）-尿素聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶中32。
    注意：在上样前需预先加热 PAGE 凝胶，方法是在 1× TBE 缓冲液中以 180 V 恒压电泳 30 min。完成后，冲洗每个加样孔以去除尿素。
  7. 将每种样品各 15 µL 上样至凝胶中，同时设置分子量标记，该标记包含 0.02 µM 的 20 nt、60 nt 和 100 nt 标记寡核苷酸，溶于甲酰胺上样缓冲液中。
  8. 在 1× TBE 缓冲液中以 180 V 恒压电泳 60 min，以确保各片段完全分离。
  9. 使用生物分子成像仪的 Cy5 通道对凝胶进行成像，以便检测带有 AF647 标记的复制 DNA 链。

5. 单分子荧光显微镜技术

  1. 盖玻片功能化
    注意：为了将DNA模板固定在玻璃盖玻片上，必须先用氨基硅烷对盖玻片进行功能化处理，随后连接生物素化PEG分子。该过程可最大限度减少DNA和/或蛋白质与表面之间的非特异性相互作用。
    1. 将盖玻片（24 × 24 mm）插入染色缸中，加入乙醇进行清洗。超声处理30分钟，然后用纯水冲洗盖玻片。用1 M氢氧化钾（KOH）重复此过程，再次冲洗。重复上述清洗步骤一次。
    2. 用丙酮冲洗并装满一个新的玻璃瓶，将盖玻片放入其中。向瓶中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，使其形成2%（v/v）的溶液。振荡3分钟后，加入大量过量的水终止反应。
    3. 用 N 吹干盖玻片2 并将它们分别放置于装有水的湿盒中，以防止盖玻片干燥。
    4. 配制1:25的Biotin-PEG-SVA与mPEG-SVA酯混合物，溶于100 mM NaHCO₃中3 （pH 8.2）。涡旋振荡该混合物20秒，以确保充分混匀。
    5. 将40 µL PEG溶液移液至干燥的盖玻片上。将另一张盖玻片覆盖在上方以 "三明治" 在两张盖玻片之间加入溶液。这将使盖玻片内表面发生功能化。对所有盖玻片重复此步骤。
    6. 在避光条件下孵育盖玻片 3 h。孵育结束后，将成对的盖玻片分开，用大量水冲洗，并用压缩 N₂ 吹干2 气体
    7. 重复步骤 4.1.4–4.1.5，以在盖玻片上施加第二层 PEG。确保将先前已功能化的表面相互贴合，因此在洗涤过程中需小心，避免意外翻转盖玻片。将样品避光孵育过夜，随后进行冲洗和干燥。
    8. 将盖玻片置于真空环境中保存，以维持其功能活性。经功能化处理的盖玻片若保存得当，可保持稳定长达一个月。
  2. 微流控流动池的制备
    注意：一种微流控流动池33 用于单分子实验（参见 补充图2这将使缓冲液、DNA模板和蛋白质与功能化盖玻片接触（见步骤5.1）。
    1. 从真空环境中取出一块功能化盖玻片，放入盛有部分水的微量离心管架中（作为保湿盒）。将100 µL封闭缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.6)，50 mM KCl，2% (v/v) Tween-20）与25 µL 1 mg/mL NeutrAvidin溶液（10% PBS）混合，均匀铺加于盖玻片表面。在室温下于保湿盒中孵育15分钟。
    2. 用水清洗盖玻片，并在 N 中干燥2请记住，盖玻片只有一侧经过功能化处理，因此需记清是哪一侧。
    3. 放置定制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）块34 将盖玻片置于流动池支架内，形成一个高100 µm、宽1 mm的流动通道。随后可将聚乙烯管（PE-60：入口内径0.76 mm，外径1.22 mm）插入流动池的孔中，以引入缓冲液和底物。
  3. 单分子荧光成像
    注意：这些实验需同时使用G4形成模板和对照模板进行，以便通过全内反射（TIRF）显微镜在单分子水平上观察两种条件（Pol δ被G4结构阻断与未被阻断）的情况。
    1. 将1 mL的Tween封闭缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 7.6）、50 mM KCl、2%（v/v）Tween-20）和500 µL洗涤缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 7.6）、10 mM乙酸镁、250 mM谷氨酸钾、40 µg/mL BSA、0.1 mM EDTA、5 mM DTT、0.0025%（v/v）Tween-20）以及复制缓冲液于40 °C加热15分钟，以释放溶液中的气体。随后在真空腔中于低于大气压800 mbar的条件下继续脱气15分钟。
    2. 将构建好的流动池（见步骤4.2）放置在显微镜载物台上。在物镜上滴加一滴镜油后，升起物镜使其与盖玻片接触。
      注意：确保物镜和流动池有足够时间达到31 °C。这将提高酵母Pol δ的活性，并有助于确保数据的可重复性。
    3. 将进样管插入已脱气的Tween封闭缓冲液中，并将出样管连接至注射泵。回拉注射器，使Tween封闭缓冲液流经管路并进入通道。让该缓冲液孵育至少30分钟，以最大限度减少非特异性相互作用。
    4. 以 100 µL/min 的流速将 200 µL 脱气洗涤缓冲液注入通道，以冲洗掉 Tween 封闭缓冲液。
    5. 将DNA模板溶液用500 µL复制缓冲液稀释至0.5 pM。以10 µL/min的流速将150 µL溶液注入通道。使用647 nm激光以约900 mW/cm²的功率照射样品。-2 在样品平面处对单个DNA模板进行可视化观察。
      注意：如果样品的视野（FOV）未能完全聚焦，可能是盖玻片未与所构建的流动池底部完全贴合。若发生此情况，应使用新的盖玻片重新构建流动池。
    6. 当斑点密度达到足够水平时（约每10 µm一个斑点）2可见时，将新鲜的复制缓冲液（添加1 mM DTT）流入通道，以洗去多余的DNA。250 µL的体积足以完全去除所有未结合的DNA。
    7. 移动到新的视野，拍摄DNA图像，以确定标记的聚合酶与DNA底物之间的共定位程度。完成后，提高激光功率，对剩余的荧光点进行光漂白。
    8. 配制200 µL复制缓冲液，其中含有1 mM DTT、250 µM dNTPs和20 nM AF647标记的Pol δ，制成聚合酶溶液。以5 µL/min的流速将100 µL该聚合酶溶液注入通道中。
    9. 当样品处于焦点且TIRF角度调整完毕后，将647 nm激光器的激光功率设为约900 mW/cm²-2 在样品平面处开始对视野进行所需时长的成像。以每秒1-5帧的速度采集10-20分钟，以捕获所有复制事件。
  4. 数据分析
    注意：所有分析均使用 Python（v. 3.11.7）完成。用于数据分析的自定义代码可在此处获取： https://github.com/Single-molecule-Biophysics-UOW/G-quadruplex_binding_analysis
    1. 首先，将DNA模板斑点与标记的酵母Pol δ荧光斑点进行共定位分析。若两个峰在漂移校正后的距离≤3个像素，则判定为共定位。仅对与DNA模板共定位的Pol δ斑点进行结合动力学及整体行为趋势的分析。
    2. 为确定结合事件数据，需测量各点随时间变化的强度 "开/关" 通过整部影片持续观察其行为，可确定Pol δ在单个DNA模板上结合的次数。
      注意：为了比较结合动力学，该分析同时针对G4形成模板和对照模板实验进行。
      注意：已进行对照实验，以排除与G-四链体或模板本身发生的非特异性结合事件（23.2 s ± 4.9 s），确保其不被纳入结合事件的分析中。

结果

在本实验中，设计了两种带有荧光标记的20-nt引物的DNA底物：一种包含可形成G-四链体（G4）的序列（图1A，左侧），另一种则缺乏该序列（图1A，右侧）。为验证G-四链体是否有效阻碍聚合酶活性，通过变性PAGE凝胶监测了Pol δ的DNA合成情况。利用凝胶电泳检测纯化的标记Pol δ在两种DNA底物上的活性。图1B（左侧）显示，荧光标记的Pol δ无法越过G-四链体进行合成。在合成起始前（t = 0 min），出现一条对应于20 nt的条带，代表从模板链上解离的标记引物。反应3 min后，该20-nt条带转变为60-nt条带，表明DNA上发生了合成反应，并证实聚合酶完全被G-四链体结构所阻断。此阻断效应说明聚合酶既不能解旋也不能绕过该结构。相比之下，在不含G-四链体形成序列的对照模板上（图1A，右侧），3 min后已产生100-nt条带（图1B，右侧）。

在确认模板上的合成以及G-四链体对合成的有效阻断后，这些测量在单分子荧光显微镜上重复进行，以监测聚合酶的行为。DNA模板被固定在功能化的盖玻片上图 2A) 在微流控流动池中，通过可视化荧光标记的引物确定每个底物的位置。随后，在存在dNTPs的条件下加入标记的Pol δ以启动合成。在典型的视野范围内，追踪单个荧光点以定量分析Pol δ与DNA结合和解离的频率图2B，C）。通过测量每种DNA底物随时间变化的荧光强度，可生成单分子轨迹（图2C, 补充图3）。可通过实验测定Pol δ在模板上停留的特征“停留时间”，即Pol δ与模板保持结合状态的平均持续时间。对于G4底物，测得的停留时间为6 s ± 2 s，而对照底物的停留时间为10 s ± 3 s（图 2D, 补充图4）。此外，对于每条轨迹，可量化Pol δ与模板结合的次数。与对照模板相比，Pol δ在G4底物上的结合事件次数显著更高（图 2E）。尽管在对照模板中由于学术性的结合与解离而出现多次结合事件，但G4形成模板上的结合事件数量平均而言明显增加。这表明，在G-四链体导致合成停滞后，结合的聚合酶会从DNA上解离，随后溶液中的新聚合酶不断进行结合与解离的循环。因此，该单分子检测方法为研究DNA聚合酶如何响应DNA障碍提供了无与伦比的洞察。

带有标记引物的qDNA底物示意图；电泳结果展示G-四链体形成。
图1：群体引物延伸实验。（A）DNA底物的示意图。G4底物（左侧）包含一个可形成G-四链体的序列，而对照底物（右侧）则不含该序列。（B）对带有引物的G4 DNA底物和对照DNA底物进行的群体DNA引物延伸实验，结果显示荧光标记的酵母Pol δ在G-四链体处完全受阻。PAGE凝胶显示了随时间推移DNA模板的复制过程，G4底物（左侧）中20 nt的标记引物延伸为60 nt产物，而对照模板（右侧）则延伸为100 nt产物。M代表含有标记的20 nt、60 nt和100 nt寡核苷酸的分子量标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

G-四链体合成示意图；标记的聚合酶；概率密度图（D，E）；数据分析。
图 2：单分子荧光显微镜。（A）使用AF647标记的酵母Pol δ进行单分子引物延伸实验的示意图。（B）单分子实验中获得的典型视野图像。每个光点代表一个荧光标记的Pol δ结合到DNA模板上。比例尺：10 µm。（C）（上图）来自单分子实验的一个典型分子，显示Pol δ在交换过程中的结合/解离动态。（下图）同一分子的单分子轨迹，显示实验时间过程中荧光强度的变化。黑色线条表示对数据进行的隐马尔可夫模型（HMM）拟合。（D）Pol δ在G4底物（紫色）和对照底物（灰色）上的停留时间。曲线为指数拟合结果，在G4底物上的寿命为6 s ± 2 s，在对照底物上的寿命为10 s ± 3 s。（E）Pol δ在单个DNA底物上的结合事件数量。G4底物（紫色）上的结合事件中位数为3.5，而对照底物1（灰色）上的中位数为1。 请点击此处查看该图的高清版本。

补充图1：圆二色光谱。 在含有200 mM KCl的TE缓冲液中，G4形成序列（紫色）与对照序列（灰色）在25 °C下的圆二色光谱。在260 nm处的特征性正峰，后随240 nm处的负峰，是平行的单分子G-四链体（GQ）的典型特征。请点击此处下载该文件。

补充图2：流动池构建. (A) 流动池各部件的示意图。方形PDMS块位于显微镜盖玻片上方。这些部件随后被组装在流动池支架的盖子和底部内。B完整的流动池。可将管路插入PDMS块的两侧，形成通道，缓冲液可通过这些通道流经装置 通过 微流控技术 请点击此处下载该文件。

补充图3：单分子轨迹。（A）在实验10分钟时间范围内发生一次结合事件的分子轨迹示例。（B）在实验10分钟时间范围内未发生结合事件的分子轨迹示例。（A）和（B）中的黑线表示隐马尔可夫模型（HMM）对数据的拟合结果。请点击此处下载该文件。

补充图 4：停留时间。（A）Pol δ 在 G4 底物上的停留时间。曲线表示指数拟合结果，得到的寿命为 6 s ± 2 s。（B）Pol δ 在对照底物上的停留时间。指数拟合得到的寿命为 10 s ± 3 s。请点击此处下载该文件。

补充图5：光漂白对照。 该图显示了单个AF647标记的酵母Pol δ酶被647 nm激光光漂白的平均时间。曲线为指数拟合结果，得到的寿命为39 ± 6 s。请点击此处下载该文件。

讨论

本文描述了一种基于单分子荧光的检测方法，可用于研究DNA聚合酶在遇到G-四链体时的行为。尽管DNA模板制备、Pol δ标记以及群体DNA复制实验的方案均较为简单，但单分子显微成像实验的技术难度较高。由于单分子技术的特性，实验过程中必须格外小心，避免引入灰尘、污染或气泡，因为这些因素会遮蔽视野并干扰数据采集。

单分子TIRF显微镜实验的一个局限性在于，与目标生物分子共价连接的荧光染料会发生光漂白。光漂白是一种不可逆的过程，会导致荧光信号永久性丧失35。为了在实验过程中减轻这一问题，必须限制激光照射时间、调节激光强度，并优化成像时机。这些策略有助于保持荧光信号，从而确保更可靠且更长时间的观测。通过精细调节这些参数，Pol δ信号可在整个测量期间持续存在。为了优化单分子荧光显微镜合成实验中的激光功率，建议通过在洁净的玻璃盖玻片上对标记的聚合酶进行成像来测定光漂白速率。通过系统性地改变激光功率并评估整个视场范围内的光漂白速率，可以确定最佳的激光强度，使荧光染料的信号强度与抗光漂白能力之间达到平衡（见补充图5）。

与传统的基于群体的方法相比，这种单分子方法的关键优势在于能够直接观察单个DNA聚合酶何时遇到并相互作用于G4结构。传统的基于群体的方法（如凝胶电泳）已证明G4结构具有阻断DNA聚合酶的能力23,36,37。然而，这些技术无法提供该相互作用的实时动力学和机制信息，而这些信息对于解析不同的分子动力学步骤和结果至关重要。单分子技术能够以前所未有的深度揭示生物分子的动力学、机制和行为，这些信息通常被群体平均效应所掩盖38。现在，我们能够实时观察DNA聚合酶的行为——例如它们是否发生交换、停滞、解离或绕过DNA障碍物39。通过建立本实验方案，可轻松将G4的种类从选定的平行c-MYC结构更换为任何平行、反平行或杂合拓扑结构。应用此单分子检测方法将揭示相同的DNA聚合酶在遇到不同G4拓扑结构时是否表现出不同的行为。因此，单分子方法对于回答有关机体蛋白质与DNA如何相互作用的具体问题至关重要。

通过直接观察DNA聚合酶与G-四链体的相互作用，研究人员鉴定出一种此前未被表征的酵母Pol δ交换途径。该发现表明，聚合酶在遇到G-四链体时会解离，等待其他蛋白介入并解开该结构后，才能重新启动DNA合成。本实验方案可被改造用于研究多种基因组维持蛋白与DNA障碍物之间的相互作用，从而以前所未有的视角揭示细胞酶如何应对基因组中的阻碍。例如，该检测中的障碍物可从G4结构替换为蛋白质-DNA交联物，后者是一类蛋白质不可逆共价结合于DNA的DNA损伤，可在DNA复制过程中形成复制障碍40。此类研究对于理解DNA复制、修复和重组等基本生物学过程至关重要。该检测方法通过在分子水平上实现对DNA-蛋白动态相互作用的研究，为阐明基因组完整性的分子机制提供了强有力的工具。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

N.K.-A. 感谢澳大利亚政府研究培训计划奖学金提供的资助。L.M.S. 感谢她从国家健康与医学研究理事会（研究者资助 2007778）获得的资金支持。J.S.L. 感谢获得澳大利亚政府资助的发现计划早期职业研究员奖（DE240100780）以及 NHMRC 研究者 EL1（2025412）。S.H.M. 感谢获得布鲁斯·沃伦分子前沿早期职业研究员奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 nt 对照 DNA 模板Integrated DNA Technologies引物延伸实验中的主要对照模板
100 nt G4形成DNA模板Integrated DNA Technologies引物延伸实验中的主要G4形成模板
15% Mini-PROTEAN TBE-尿素凝胶，12孔，20 µLBio-Rad4566055凝胶电泳
20 nt 标记/生物素化引物寡核苷酸Integrated DNA Technologies用于100 nt模板的引物延伸
22 nt 对照 DNA 模板Integrated DNA Technologies圆二色光谱实验中的主要对照模板
22 nt G4形成DNA模板Integrated DNA Technologies圆二色光谱实验中的主要G4形成模板
24 × 24 mm 盖玻片Marienfeld Superior100062全内反射荧光显微镜所需
3-氨基丙基三乙氧基硅烷Thermo Fisher ScientificA10668.22盖玻片功能化
647 nm 激光器Coherent1196627选择与所用染料/染色剂匹配的波长
670 nm 发射滤光片Chroma Technology CorpET655lp确保仅有相关波长通过至检测器
Amersham Typhoon 5 生物分子成像仪Cytiva29187191凝胶分析
生物素-PEG-SVA（分子量 5000）Laysan BioBIO-PEG-SVA-5K-100MG盖玻片功能化
脱氧核苷三磷酸溶液混合物Jena BioscienceNU-1005L复制反应的基本单元
数字干浴器（115 V）Bio-Rad1660571加热溶液
二硫苏糖醇Sigma-Aldrich646563还原二硫键
EM-CCD 相机AndoriXon 897捕获单分子动态影像
甲酰胺Sigma-AldrichF9037在群体DNA复制实验中用于DNA变性
气密式注射器，1 mLSGE21964用于圆二色光谱实验中比色皿的加样
配备CFI Apo TIRF 100倍油浸物镜的倒置显微镜Nikon Eclipse Ti-E实现单分子全内反射荧光显微镜观察
J-810 分光光度计JascoJ-810进行圆二色光谱测量
mPEG-SVA（分子量 5000）Laysan BioMPEG-SVA-5K-100MG盖玻片功能化
NanoDrop One 分光光度计Thermofisher ScientificND-ONE测定蛋白质和标记物浓度
NeutrAvidinThermo Fisher Scientific31000在单分子实验中将DNA模板固定于功能化盖玻片上
聚乙烯管InstechBTPE-60用于构建流动池
石英比色皿，10 mmStarna Scientific1/Q/10/CD用于圆二色光谱实验的样品盛放
注射泵Adelab ScientificNE-1002X用于将缓冲液和底物泵入微流控流动池
Tris-EDTA 缓冲液Thermofisher Scientific93283DNA溶液缓冲液
酵母DNA聚合酶 δMichael O'Donnell 实验室用于DNA模板的复制
Zeba 脱盐离心柱，7 K 分子量截留，0.5 mLThermo Fisher Scientific89882聚合酶纯化

参考文献

  1. Sutton, M. D., Walker, G. C. Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination. Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).
  2. Burgers Garg, P., J, P. M. DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork. Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).
  3. Burgers, P. M. J. Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair. Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).
  4. Tsai, M. -D. How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation. Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).
  5. Lewis, J. S., et al. Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication. Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).
  6. Chilkova, O., et al. The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA. Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).
  7. Sugino Kawasaki, Y., A, Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork. Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).
  8. Stillman, B. DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes. Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).
  9. Shivji Wood, R. D., K, M. Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes. Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).
  10. Campbell Budd, M. E., L, J. The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis. Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).
  11. Gao Yang, W., Y, Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  12. Bridges, B. A. DNA repair: Polymerases for passing lesions. Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).
  13. Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome. Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).
  14. Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome. Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).
  15. Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. G4-quadruplexes, and genome instability. Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).
  16. Monnat Loeb, L. A., J, R. DNA polymerases and human disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).
  17. Bryan Oganesian, L., M, T. Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target. Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).
  18. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).
  19. Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy. Biomol. 11 (11), (2021).
  20. Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).
  21. Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques. J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).
  22. Obi, I., et al. Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication. Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).
  23. Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence. J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).
  24. Clayton Kaguni, L. S., A, D. Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).
  25. Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication. Sci Adv. 7 (39), (2021).
  26. Castillo Bosch,, P,, et al. FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures. EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).
  27. Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase. Cell. 145 (5), 678-691 (2011).
  28. Guo, L., et al. Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex. Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).
  29. Pham, S. Q. T., et al. A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes). Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).
  30. Georgescu, R. E., et al. Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork. Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).
  31. Hansen, J. B., Au, Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, (2009).
  32. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). J Vis Exp. 32, (2009).
  33. Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).
  34. Lewis, J. S., et al. Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome. eLife. 6, 23932(2017).
  35. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).
  36. Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase. Methods. , 207-214 (2022).
  37. Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change. PLoS One. 9 (1), 80664(2014).
  38. Mueller, S. H., et al. Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism. Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).
  39. Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines. Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).
  40. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).

重印与许可

标签

G-四链体结构荧光显微镜聚合酶结合DNA复制障碍聚合酶δ流动池检测DNA路障实时可视化
单分子荧光成像观察DNA聚合酶在G-四链体上的动态行为
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。