本文介绍了一种逐步操作方案，演示如何将模块化克隆（MoClo）技术应用于多顺反子操纵子的克隆。
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本文内容
摘要
摘要
模块化克隆（MoClo）工具包能够实现多基因结构的快速组装。该技术基于Golden Gate克隆方法，利用IIS型限制性内切酶，这类酶在其识别位点之外进行切割。由于识别序列与切割序列相互分离，因此可人为设计由IIS型限制性内切酶产生的黏性末端，且克隆策略通常可防止正确连接的DNA片段被再次切割，从而实现在单个反应中高效组装多个DNA片段。在MoClo系统中，启动子、核糖体结合位点、编码序列和终止子等独立的功能性DNA元件，以及更高层级的组装单元，均被分配标准化的黏性末端，从而可构建可重复使用的元件文库。目前大多数用于细菌的MoClo工具包主要用于单顺反子转录单元的克隆，缺乏针对多顺反子操纵子系统化组装的有效方案。本实验方案展示了利用In- & Out-Cloning工具包组装多顺反子转录单元的方法，该策略同样可适用于其他MoClo工具包。
引言
分子克隆，即将重组DNA导入质粒等复制子中，是分子生物学的一项基础技术。近几十年来，DNA的构建与组装方法日益精密。如今，研究人员已能够利用合成的DNA构建完整的合成染色体，甚至合成基因组。1传统的分子克隆通常依赖于 特设的 克隆策略，且对于大型多基因构建体而言，可能耗时且成本高昂2近年来，Golden Gate（GG）克隆及其衍生的层级化模块化克隆（MoClo）工具包2,3 已成为实现高效、低成本DNA组装的流行解决方案。
IIS型限制性内切酶是一类识别定向（非回文）序列并在识别序列外进行切割的内切核酸酶4。因此，由切割产生的黏性末端序列不依赖于识别位点，而是可以人为设计选择4。此外，可将功能性的DNA片段（此处称为“元件”）设计为在切割后从待连接元件的末端去除识别位点2。Golden Gate（GG）克隆策略利用这一特性，实现了一步反应中高效地多片段DNA组装5。MoClo工具包基于GG克隆技术，旨在提供一种模块化且具有层级结构的多基因构建体组装方法。用于....
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方案
注意：本实验方案通过三个层级描述了多顺反子操纵子的设计与组装方法 体内克隆 标准（0、1 和 M）。此处组装的多顺反子操纵子以启动子开始，随后是核糖体结合位点（RBS）、编码序列（CDS）、第二个 RBS、第二个 CDS，最后是终止子图 S1强烈建议使用分子克隆软件模拟克隆过程 计算机模拟，以确保设计的克隆策略正确。本文描述了将启动子组装为 Level 0 模块、将核糖体结合位点（RBS）与编码序列及终止子组装成 Level 1 转录单元，以及将双顺反子操纵子组装为 Level M 的示例，整个组装过程的示意图如下所示 图 S1.
1. 0级：元件的驯化
注意：术语 "驯化" 用于表示一个分子元件已被整合到 MoClo 元件文库中，从而可在 MoClo 试剂盒的各个层级中进行组装。通常，通过同义编码等方法，将待驯化元件中存在于试剂盒内的所有 IIS 型限制性内切酶识别位点予以去除。
- 插入片段的设计
- 选择拟在操纵子中组装的分子元件，如启动子、编码序列（CDS）和终止子。
注：本方案中，操纵子以启动子 PLuxB 起始，该启动子可在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存....
- 选择拟在操纵子中组装的分子元件，如启动子、编码序列（CDS）和终止子。
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结果
此处展示了从 Level 0 到 Level M 自下而上组装一个多顺反子操纵子的结果（图 S1）。该操纵子以启动子 PLuxB 起始，在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存在的情况下，可被蛋白 LuxR 激活17。操纵子的第一个编码序列（CDS）为绿色荧光蛋白（GFP），其核糖体结合位点（RBS）为 iGEM BBa_B0064。GFP 后接一个非终止型连接序列，即“终止子桥”。第二个 RBS 由 RBS 计算器设计18，第二个编码序列为 mTurquoise。最后，操纵子以终止子 L3S2P21 结束19。
终结者装置的驯化
为了组装设计的多顺反子操纵子，所有分子元件都需要在相应的受体质粒中进行驯化。通过退火两条寡核苷酸（见 表 S2）。寡核苷酸设计时包含4个核苷酸的突出端，以便插入p.......
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讨论
分子克隆可能耗时且繁琐，尤其是采用临时设计的克隆策略时。MoClo 工具包通过其模块化设计、分级组装以及高效的一锅法反应，可显著提升分子克隆效率。该方法依赖于Golden Gate连接反应实现DNA组装。由于采用标准化的黏性末端，分子元件文库可被重复使用并共享给其他研究者3,6。元件的可重用性使得构建混合或阵列化的多基因组合文库成为可能。例如，这有助于优化异源表达通路，以确定理想的启动子强度或酶的种类。该方法的标准化特性使其易于实现自动化，从而支持DNA的高通量组装。此外，In- & Out-Cloning MoClo 工具包中的Out-Cloning方案支持高效构建含有不同复制起点和筛选标记的受体质粒，使研究人员能够组装适用于其目标生物的质粒7。
此处使用了In- & Out-Cloning MoClo工具箱。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
TAL、STdV 和 DS 在 MaxGENESYS 项目框架内得到了马普学会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨苄青霉素 | Merck Life Science | A9518 | |
| 细菌琼脂 | Fisher Scientific | P0011B | |
| BbsI-HF | New England Biolabs | R3539 | |
| BsaI-HF V2 | New England Biolabs | R3733 | |
| E. coli DH5α 感受态细胞 | |||
| Eppendorf Mastercycler Nexus 热循环仪 | Eppendorf | 6333000014 | |
| EzDrop 1000 微量分光光度计 | Blue-Ray Biotech | BRED-1000 | |
| GeneJET 质粒小提试剂盒 | Thermo Scientific | K0503 | |
| In- & Out- Cloning Toolkit | |||
| 连接酶缓冲液 | New England Biolabs | B0216 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358 | |
| New Brunswick Innova® 42/42R - 可堆叠培养摇床 | Eppendorf | M1335-0080 | |
| PhenoBooth+ | Singer Instruments | PHB-007 | |
| SapI | New England Biolabs | R0569 | |
| 壮观霉素 | Merck Life Science | S4014 | |
| 标准实验耗材 | |||
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202 | |
| Thermomix MM | B. Braun Biotech International | ||
| 胰蛋白胨 | Fisher Scientific | LP0042B | |
| 酵母提取物 | Fisher Scientific | LP0021B |
参考文献
- James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
- Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6<....
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