使用 In-Cloning 工具包对具有模块化克隆的多顺反子纵子（MoClo）进行标准化模块化组装

Summary

本文提出了一个分步协议，演示了模块化克隆（MoClo）如何适用于多顺反子纵子的克隆。

Abstract

模块化克隆 （MoClo） 工具包能够快速组装多基因构建体。它们基于金门克隆，该克隆使用在其识别位点之外切割的 IIS 型限制性内切酶。由于识别和切割序列是解偶联的，因此可以故意选择由 IIS 型限制性内切酶产生的突出端，并且克隆策略通常会阻止切割正确连接的 DNA 片段。这允许在单个反应中高效组装多个 DNA 片段。在 MoClo 中，单个功能性 DNA 部分（例如启动子、核糖体结合位点、编码序列和终止子）以及高阶组件都被分配了标准化的突出端，以便可以创建可重复使用的部分库。大多数细菌MoClo工具包设计用于克隆单顺反子转录单元，不为多顺反子纵子的组装提供结构化路径。该协议演示了使用 In-和Out-Cloning 工具包组装多顺反子转录单元。同样的方法也可以转移到其他 MoClo 工具包。

Introduction

分子克隆，即将重组 DNA 引入质粒等复制子中，是分子生物学的基本方法。近几十年来，DNA 的构建和组装方法变得越来越复杂。到目前为止，研究人员可以从合成的 DNA¹ 中构建完整的合成染色体甚至基因组。传统的分子克隆通常依赖于临时克隆策略，对于大型多基因构建体来说可能既费力又昂贵²。近年来，金门（GG）克隆和衍生的分层模块化克隆（MoClo）工具包^2,3已成为流行的解决方案，以实现时间和经济高效的DNA组装。

IIS 型限制性内切酶是核酸内切酶，可识别定向（非回文）序列并在该识别序列之外切割⁴。因此，由切割产生的突出序列不依赖于识别位点，但可以选择⁴。此外，可以设计功能性 DNA 片段，此处称为“部分”，以便切割从待连接部分² 的末端去除识别位点。GG克隆策略利用这一点在一^锅反应中实现高效的多组分DNA组装5。MoClo 工具包基于 GG 克隆，旨在为多基因构建体的组装提供一种模块化和分层的方式。用于组装零件的悬垂是标准化的，允许创建可重复使用和可互换的零件库。MoClo 工具包依赖于受体质粒，这些质粒被设计为接受多个 DNA 序列并释放组装产物。每个受体质粒包含两种不同IIS型酶的两个识别位点，一个用于接受DNA货物，另一个用于释放组装的DNA ^3,6。该原理的图示如图 1 所示，用于将单个部分（终止子）克隆到 MoClo 受体质粒（0 级）中。受体质粒和插入片段都被限制性内切酶 BbsI 切割，从而留下相容的突出端并去除 BbsI 识别位点。因此，正确连接的质粒不再被 BbsI 切割。用IIS型酶SapI切割所得质粒，在下一个组装步骤（1级）中释放先前插入的片段。

在该协议中，使用了内克隆和克隆外 MoClo 工具箱⁷。在这里，0 级质粒包含定义的基本遗传部分，例如具有 5' 非翻译区 （UTR） 的启动子、编码序列和具有 3'UTR 的终止子，图 1 显示了 0 级的示意图。在 1 级上，多个部分被组装成转录单元 （TU），图 2 显示了 1 级部分和克隆的示意图。内克隆和外克隆MoClo 设计用于通过使用 IIS 型酶在 1 级中无疤痕组装转录单元，该酶可产生 3 核苷酸突出端。这允许突出端完全位于编码序列的密码子栅格内，使用 ATG 起始密码子和 TGA 终止密码子进行组装。M 和 P 级用于组装从 1 级质粒 ^3,8 释放的多个转录单元。图3显示了克隆到M级和P级的部件的示意图，以及M级中双顺反子纵子的组装（双顺反子纵子是表达多个编码序列（CDS）的转录单元）。P级和M级被设计为允许从一个到另一个的迭代循环，因此理论上可以组装的部件数量没有限制，然而，本协议中没有描述这一点，因为该协议的主要重点是显示双顺反子纵子的组装。虽然可以组装的零件数量没有限制，但可以组装的构造的尺寸是有限制的;使用 MoClo 套件^组装了高达 100,000 bp 9。此外，大型构建体或含有有毒基因的构建体可能会对细胞造成负担;对于这些实例，已经发布了修改后的协议¹⁰.

In-和Out-Cloning最初没有描述多顺反子转录单元组装的方案。多顺反子纵子是细菌中非常常见的基因组织模式 11,12,13，^因此，它们以模块化方式自下而上的组装引起了显着的兴趣¹⁴。在这里，描述了使用In-Cloning和Out-Cloning组装多顺反子纵子的结构化方案。所提出的方案允许在多顺反子转录单元以及由单顺反子和多顺反子转录组成的组件内轻松交换编码序列的位置。

以下分步方案显示了使用 In-Cloning和Out-Cloning设计和克隆多顺反子纵子。所提出的克隆多顺反子转录单元的策略可以很容易地适应其他MoClo工具包。

Protocol

注意：该协议描述了通过 克隆标准 的三个级别（0、1 和 M）设计和组装多顺反子纵子。这里组装的多顺反子纵子从启动子开始，然后是核糖体结合位点（RBS）、编码序列（CDS）、第二个RBS、第二个CDS，最后是终止子（图S1）。强烈建议使用分子克隆软件在 计算机中模拟克隆，以确保设计的克隆策略正确。这里描述了将启动子组装为0级部件，将具有编码序列和终止子的RBS组装成1级转录单元，以及M级双顺反子纵子的组装示例，整个组件的示意图如 图S1所示。

1. 0级：零件驯化

注意：“驯化”一词用于表示分子部分已集成到 MoClo 部件库中，并且可以在 MoClo 试剂盒的整个水平中组装。通常，试剂盒中使用的IIS型限制性内切酶的所有识别位点都从待驯化部分中去除，例如，通过同义重编码。

1. 刀片的设计
   1. 选择分子部分，例如启动子、CDS 和终止子，以组装在一起。
      注意：在该协议中，纵子以启动子P LuxB起始，在诱导化合物N-（β-酮己酰基）-L-高丝氨酸内酯（OC6）¹⁷存在下，启动子_PLuxB可以被蛋白LuxR激活。GFP是纵子的第一个CDS;其苏格兰皇家银行是 iGEM BBa_B0064。GFP 后面是一个非终端链接器，即“终止器桥”。第二个 CDS 是 mTurquoise。其RBS由RBS计算器¹⁸设计。最后，纵子以终止子^{L3S2P21 19} 终止。
   2. 选择零件的组装位置，概述如 图 1 所示。根据位置，选择要在GG中使用的受体质粒。
      注意：零件可以驯化以供以后在各种位置使用。例如，启动子可以在以后与 5'UTR 部件 （pSL252） 连接时组装为单个部件，也可以在已经包含 5'UTR （pSL099） 的情况下驯化。CDS 可以组装在四个受体质粒中，无需标签即可组装 （pSL102），可与 N 端标签 （pSL104） 组装，可与 C 端标签 （pSL101） 组装，或与 N 端标签和 C 端标签 （pSL103） 组装。在给定的示例中，启动子被驯化为pSL252，第一个RBS被驯化为pSL253，第一个CDS被驯化为pSL102，终止子桥被驯化为pSL106，第二个RBS被驯化为pSL099，第二个CDS被驯化为pSL102，终止子被驯化为pSL106。
   3. 根据所选的受体质粒向设计的插入片段添加延伸。 表 1 概述了每个受体质粒的 GG 组装所需的延伸。这些延伸应在PCR引物的设计、在退火两个寡核苷酸以构建部分的情况下的寡核苷酸设计或基因合成过程中添加。
      注意：为了使部件被驯化，必须确保部件本身不包含试剂盒中使用的IIS型酶的识别位点，SapI（5'-GCTCTTC-3'），BbsI（5'-GAAGAC-3'）和BsaI（5'-GGTCTC-3'）。零件中识别位点的存在大大降低了正确组装的效率，因为最终产品可以通过使用的 IIS 型酶进行切割（见 图 1）。
2. GG反应
   1. 对于 GG 反应，加入 50 fmol 所需插入片段、50 fmol 受体质粒、1 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 μL T4 连接酶和 1 μL BbsI。加入无核酸酶水至总体积为 10 μL。此外，包括具有相同反应的阴性对照，但没有所需的插入片段。
   2. 在热循环仪中运行以下程序：37°C循环25次，持续3分钟（37°C是限制性内切酶的最佳温度）和16°C持续4分钟（16°C是T4连接酶的最佳温度），然后在50°C下最终消化20分钟（在50°C下，T4连接酶显示出很少或没有活性， 而限制性内切酶仍然能够发挥作用，从而限制最终产物中未切割受体质粒的量）并在80°C下热灭活酶20分钟（在80°C下，所有酶被热灭活并终止反应）⁶。
   3. 通过在50μL化学感受态大 肠杆菌 细胞中加入5μL的GG反应来转化GG反应，并按照先前发表的方案¹⁵中所述进行具有恢复步骤的热休克转化。
   4. 将 100 μL 转化生长物铺在含有 100 μg/mL 大观霉素的 Luria-Bertani （LB） 琼脂平板上。将板在37°C下孵育过夜。
   5. 通过计算两个板上的白色菌落数量，将阴性对照的转化效率与完整组装的转化效率进行比较。如果组件的白色菌落是阴性对照的大约 10 倍（或更多），请继续下一步。
      注意：大多数产生的菌落应该是白色的，只有一小部分红色菌落。 In-Cloning 工具包中的受体质粒具有双选择盒，包含 mCherry （0 级和 1 级）或 LacZα （M 级和 P 级），以及编码旋转酶抑制剂的 ccdB 基因。GG反应的转化是在 ccdB 敏感的大 肠杆菌 细胞中进行的，因此，只有具有组装质粒的细胞才能生长，而原始受体质粒不能繁殖。 ccdB 敏感菌株的例子包括 DH5α 和 TOP10。 mCherry/LacZα 允许视觉识别逃脱 ccdB 机制的细胞¹⁶。
   6. 对于每个组装，通过用移液器吸头拾取菌落的一些材料并将其重悬于含有100μg/mL大观霉素的5mL LB培养基中，并在37°C下以250rpm的摇动培养箱中孵育过夜，从而培养两个白色菌落。根据制造商的说明进行基于柱的质粒提取。通过Sanger测序验证提取的质粒是否具有预期的序列。

2. 第一级：确定位置

注意：1级是驯化部件和组装多顺反子纵子之间的水平（图2）。在这里，确定了中间装配体在最终构造中的位置。纵子内 1 级组装体的位置可以通过使用不同的 1 级受体质粒来改变。给定的示例描述了双顺反子单元的组装，但给定的方案可以轻松适应多达六个编码序列（每个编码序列有一个 RBS）的组装。组装更多编码序列还需要在 P 级和 M 级之间循环。通过 P 级和 M 级之间的迭代循环，可以组装成单个纵子的编码序列数量没有固定的上限。

1. 部件和受体质粒的选择
   1. 选择要组装成转录单元的 0 级部分。这些至少需要包括一个启动子、一个 CDS 和一个终止器。
   2. 选择转录单元应在纵子中组装的位置。根据该位置，选择合适的受体质粒。概述如 图 2 所示。
      注意：作为示例显示的用于构建双顺反子纵子的 7 个 DNA 片段组装成两个 1 级构建体。将启动子、第一RBS、第一CDS和终结器桥组装成pSL68;第二个RBS、第二个CDS和终结器组装成pSL69。
2. GG反应
   1. 对于GG反应，加入50 fmol的每个所需插入片段，50 fmol的受体质粒，1μL 10x T4 DNA连接酶缓冲液，1 μL T4连接酶和1 μL SapI。加入无核酸酶水至总体积为 10 μL。
   2. 在热循环仪中运行以下程序：37°C循环3分钟和16°C循环4分钟25次，然后在50°C下最终消化20分钟，并在80°C下加热灭活酶20^分钟6。
   3. 可选：向GG反应中加入0.5μL SapI，并在37°C下孵育1小时。
      注意：SapI不如其他使用的IIS型限制性内切酶稳定。已经发现，GG 反应后使用 SapI 进行消化步骤会减少携带重新连接的受体质粒的菌落数量。SapI 具有同裂殖异构体 BspQI，可能不需要最后的消化步骤。
   4. 在50μL化学感受态大 肠杆菌 细胞中转化5μLGG反应，并进行热休克转化，优选采用步骤1.2.3中执行的恢复步骤。
   5. 将 100 μL 转化生长物与 100 μg/mL 氨苄青霉素接种在 LB 琼脂平板上。将板在37°C下孵育过夜。
   6. 对于每个，通过用移液器吸头拾取菌落的一些材料并将其重悬于5mL的LB培养基中，每个培养基中含有100μg/ mL氨苄青霉素，从而培养两个白色菌落。在37°C下以250rpm的摇动培养箱中孵育过夜。根据制造商的说明进行基于柱的质粒提取。
   7. 通过使用 BbsI 的限制性摘要确认装配正确，检查切口的尺寸是否与刀片的预期尺寸相匹配。通过加入 1 μL 适当的 10x 酶解缓冲液和 1 μL BbsI 来酶解 1000 ng 质粒 DNA。加入无核酸酶水至总体积为 10 μL。将反应在 37°C 下孵育 15 分钟。
   8. 通过将消化的质粒加载到1%琼脂糖凝胶上来进行凝胶电泳，在100 V下运行凝胶35分钟。
      注意：可以对预期的质粒进行 计算机 消化以模拟琼脂糖凝胶以预测结果。

3. M级：多顺反子纵子的组装

注意：在此步骤中，正在组装多顺反子纵子。在所提出的双顺反子纵子的情况下，两个 1 级插入物组装在位置 1 和 2。因此，选择受体质粒pMA60。此外，还需要末端连接器。所有水平M和P受体质粒都具有突出端GGGA作为第二个突出端。末端接头在插入片段和受体质粒之间桥接，并能够将 P 级构建体组装到水平 M 中，反之亦然。对于两个 1 级刀片的 P 级组件，使用末端连接器 pMA668，并将占据第三个也是最后一个位置。M 级和 P 级的概述以及克隆步骤的可视化如 图 3 所示。仅在 M 级（或 P）上组装，可以克隆多达 6 个编码序列的纵子（位置 1-6）。位置 7 由末端连接器占据。在纵子中组装更多数量的编码序列是可能的，但需要循环到水平 M（或 P），这在本协议中没有描述。

1. 对于 GG 反应，加入每个所需插入片段 50 fmol、受体质粒 50 fmol、1 μL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 μL T4 连接酶和 1 μL BbsI。加入无核酸酶水至总体积为 10 μL。
2. 在热循环仪中运行以下程序：37°C循环50次，持续3分钟，16°C循环4分钟，然后在50°C下进行最终消解20分钟，并在80°C下热灭活酶20^分钟6。
3. 在50μL化学感受态大 肠杆菌 细胞中转化5μLGG反应，并按照步骤1.2.3中执行的恢复步骤进行热休克转化。
4. 将 100 μL 转化生长物铺在含有 100 μg/mL 大观霉素的 LB 琼脂平板上。将板在 37 °C 下孵育过夜，如果预计会产生代谢负担或组件毒性，则在 30 °C 下孵育。
5. 对于每个组装，从两个白色菌落中培养一种培养物。为此，将移液器吸头浸入菌落中，并用它用 100 μg/mL 大观霉素接种 5 mL LB。在 37 °C 或 30 °C 下以 250 rpm 的摇动培养箱孵育过夜。根据制造商的说明进行基于柱的质粒提取。
6. 通过使用 BsaI 的限制性摘要确认组装正确，检查切口的尺寸是否与插入件的预期尺寸相匹配，如步骤 2.2.7 中执行的那样。
   注意：该构建体可能太长，无法被桑格测序覆盖以进行确认。然后可以通过全质粒测序来确认，该测序可作为商业服务从多家测序服务提供商处获得。

Results

在这里，显示了从0级到M级的自下而上的多顺反子纵子组装的结果（图S1）。纵子以启动子P LuxB起始，在诱导化合物N-（β-酮己酰基）-L-高丝氨酸内酯（OC6）¹⁷存在下，启动子_PLuxB可以被蛋白LuxR激活。GFP是纵子的第一个CDS，其RBS是iGEM BBa_B0064。GFP 后面是一个非终端链接器，即“终止器桥”。第二个RBS由RBS计算器¹⁸设计，第二个CDS是mTurquoise。最后，纵子以终止子^{L3S2P21 19} 终止。

终结者的驯化
为了组装设计的多顺反子纵子，所有分子部分都需要在相关的受体质粒中驯化。终止子L3S2P21是通过退火两个寡核苷酸来构建用于驯化的（见 表S2）。寡核苷酸设计有 4 核苷酸突出端，用于插入 p...

Discussion

分子克隆可能既耗时又麻烦，尤其是使用临时克隆策略。MoClo 工具包可以通过其模块化、分层组装和高效的一锅反应来改进分子克隆。它们依赖于通过金门反应进行 DNA 组装。由于标准化的悬垂，分子部分库可以重复使用并与他人共享 ^3,6。部分的可重用性允许创建多基因构建体的池化或阵列组合文库。例如，这有助于优化异源途径，以寻找理想的启动子强度或酶特性。该方法的标准化性使其易于自动化，允许 DNA 的高通量组装。此外，In- and Out-Cloning MoClo 工具包的 Out-Cloning 方案支持简化具有其他复制起源和选择性标记的受体质粒的生成，使研究人员能够组装适合其选择的生物体的质粒⁷。

这里使用了 In- and Out-Cloning MoClo 工具箱。克隆内...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氨苄青霉素	默克生命科学	A9518
细菌琼脂	费舍尔科学公司;	P0011B
BbsI-HF	新英格兰生物实验室	R3539
BsaI-HF V2	新英格兰生物实验室	R3733
<大肠杆菌>DH5α合格细胞
埃彭多夫 Mastercycler Nexus 热循环器	埃彭多夫	6333000014
EzDrop 1000微体积分光光度计	蓝光生物技术	BRED-1000
GeneJET质粒迷你制备套件	热力科学	K0503
<> 和克隆工具包
利加斯缓冲器	新英格兰生物实验室	B0216
氯化钠	费舍尔科学公司;	BP358
新不伦瑞克创新公司; 42/42R - 可堆叠孵化器摇床	埃彭多夫	M1335-0080
PhenoBooth+	歌手乐器	玩家手册-007
萨普伊	新英格兰生物实验室	R0569
斯佩替诺霉素	默克生命科学	S4014
标准实验室用具
T4 DNA 连接酶	新英格兰生物实验室	M0202
Thermomix MM	B. Braun 生物技术国际
特氨酸	费舍尔科学公司;	LP0042B
酵母提取物	费舍尔科学公司;	LP0021B