使用 In-Cloning 工具包通过模块化克隆（MoClo）标准化组装多顺反子操纵子

摘要

本文介绍了一种逐步操作方案，演示如何将模块化克隆（MoClo）技术应用于多顺反子操纵子的克隆。

摘要

模块化克隆（MoClo）工具包能够实现多基因结构的快速组装。该技术基于Golden Gate克隆方法，利用IIS型限制性内切酶，这类酶在其识别位点之外进行切割。由于识别序列与切割序列相互分离，因此可人为设计由IIS型限制性内切酶产生的黏性末端，且克隆策略通常可防止正确连接的DNA片段被再次切割，从而实现在单个反应中高效组装多个DNA片段。在MoClo系统中，启动子、核糖体结合位点、编码序列和终止子等独立的功能性DNA元件，以及更高层级的组装单元，均被分配标准化的黏性末端，从而可构建可重复使用的元件文库。目前大多数用于细菌的MoClo工具包主要用于单顺反子转录单元的克隆，缺乏针对多顺反子操纵子系统化组装的有效方案。本实验方案展示了利用In- & Out-Cloning工具包组装多顺反子转录单元的方法，该策略同样可适用于其他MoClo工具包。

引言

分子克隆，即将重组DNA导入质粒等复制子中，是分子生物学的一项基础技术。近几十年来，DNA的构建与组装方法日益精密。如今，研究人员已能够利用合成的DNA构建完整的合成染色体，甚至合成基因组。¹传统的分子克隆通常依赖于 特设的 克隆策略，且对于大型多基因构建体而言，可能耗时且成本高昂²近年来，Golden Gate（GG）克隆及其衍生的层级化模块化克隆（MoClo）工具包^2,3 已成为实现高效、低成本DNA组装的流行解决方案。

IIS型限制性内切酶是一类识别定向（非回文）序列并在识别序列外进行切割的内切核酸酶⁴。因此，由切割产生的黏性末端序列不依赖于识别位点，而是可以人为设计选择⁴。此外，可将功能性的DNA片段（此处称为“元件”）设计为在切割后从待连接元件的末端去除识别位点²。Golden Gate（GG）克隆策略利用这一特性，实现了一步反应中高效地多片段DNA组装⁵。MoClo工具包基于GG克隆技术，旨在提供一种模块化且具有层级结构的多基因构建体组装方法。用于组装元件的黏性末端是标准化的，从而能够建立可重复使用且可互换的元件文库。MoClo工具包依赖于受体质粒，这类质粒经过工程化改造，可接受多个DNA序列，并释放最终组装产物。每个受体质粒包含两种不同IIS型酶的两个识别位点，其中一个用于接受DNA载荷，另一个用于释放组装好的DNA^3,6。该原理的示意图见图1，展示的是将一个单独元件——终止子——克隆到MoClo受体质粒（0级）中的过程。受体质粒和插入片段均被限制性内切酶BbsI切割，产生互补的黏性末端，同时去除BbsI识别位点。正确连接后的质粒不再被BbsI切割。在后续组装步骤（1级）中，用IIS型酶SapI切割所获得的质粒，即可释放先前插入的片段。

在本实验方案中，使用了In- and Out-Cloning MoClo工具箱⁷。Level 0质粒包含定义好的基本遗传元件，例如带有5'非翻译区（UTRs）的启动子、编码序列以及带有3'UTR的终止子，图1展示了Level 0的示意图。在Level 1中，多个元件被组装成一个转录单元（TU），图2展示了Level 1元件及其克隆过程的示意图。In- and Out-Cloning MoClo利用IIS型限制性内切酶产生3个核苷酸的黏性末端，从而实现Level 1中无痕组装转录单元。这种方法使得黏性末端完全位于编码序列的密码子框架内，并利用ATG起始密码子和TGA终止密码子进行组装。Level M和Level P用于将来自Level 1质粒的多个转录单元进一步组装^3,8。图3展示了克隆至Level M和P的元件示意图，以及在Level M中组装双顺反子操纵子的过程（双顺反子操纵子是一种可表达多个编码序列（CDSs）的转录单元）。Level P和Level M的设计允许两者之间进行迭代循环，因此理论上可组装的元件数量没有限制；但本方案未描述该迭代过程，因为本方案的主要目的是展示双顺反子操纵子的组装。尽管可组装的元件数量没有限制，但所构建载体的大小存在实际限制；已有研究使用MoClo试剂盒成功组装了长达100,000 bp的序列⁹。此外，过大的构建体或含有毒性基因的构建体可能对细胞造成负担；针对这些情况，已有改进的实验方案发表¹⁰。

内克隆与外克隆最初并未描述多顺反子转录单元的组装方案。多顺反子操纵子是细菌中非常常见的基因组织形式^11,12,13，因此以模块化方式从头组装这类结构具有重要意义¹⁴。本文描述了一种利用内克隆与外克隆技术组装多顺反子操纵子的系统化方案。该方案可轻松交换多顺反子转录单元中编码序列的位置，也可用于包含单顺反子和多顺反子转录单元的复合组装。

以下分步方案展示了利用In-和 Out-克隆技术设计和克隆多顺反子操纵子的方法。文中介绍的多顺反子转录单元克隆策略可轻松适用于其他MoClo工具包。

方案

注意：本实验方案通过三个层级描述了多顺反子操纵子的设计与组装方法 体内克隆 标准（0、1 和 M）。此处组装的多顺反子操纵子以启动子开始，随后是核糖体结合位点（RBS）、编码序列（CDS）、第二个 RBS、第二个 CDS，最后是终止子图 S1强烈建议使用分子克隆软件模拟克隆过程 计算机模拟，以确保设计的克隆策略正确。本文描述了将启动子组装为 Level 0 模块、将核糖体结合位点（RBS）与编码序列及终止子组装成 Level 1 转录单元，以及将双顺反子操纵子组装为 Level M 的示例，整个组装过程的示意图如下所示 图 S1.

1. 0级：元件的驯化

注意：术语 "驯化" 用于表示一个分子元件已被整合到 MoClo 元件文库中，从而可在 MoClo 试剂盒的各个层级中进行组装。通常，通过同义编码等方法，将待驯化元件中存在于试剂盒内的所有 IIS 型限制性内切酶识别位点予以去除。

1. 插入片段的设计
   1. 选择拟在操纵子中组装的分子元件，如启动子、编码序列（CDS）和终止子。
      注：本方案中，操纵子以启动子 P_LuxB 起始，该启动子可在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存在下被 LuxR 蛋白激活¹⁷。GFP 为操纵子中的第一个 CDS，其核糖体结合位点（RBS）为 iGEM BBa_B0064。GFP 后接一个非末端连接序列，即“终止子桥”。第二个 CDS 为 mTurquoise，其 RBS 由 RBS 计算器设计¹⁸。最后，操纵子以终止子 L3S2P21 结束¹⁹。
   2. 选择各元件在组装中的位置，图1展示了位置的总体示意图。根据所选位置，确定用于 Golden Gate（GG）组装的受体质粒。
      注：元件可被“驯化”以用于后续不同位置的组装。例如，启动子可单独组装，之后与 5'UTR 元件（pSL252）连接，也可预先与 5'UTR 一同“驯化”（pSL099）。一个 CDS 可在四种不同的受体质粒中进行组装：无标签（pSL102）、带 N 端标签（pSL104）、带 C 端标签（pSL101），或同时带 N 端和 C 端标签（pSL103）。在本示例中，启动子被“驯化”至 pSL252，第一个 RBS 被“驯化”至 pSL253，第一个 CDS 被“驯化”至 pSL102，终止子桥被“驯化”至 pSL106，第二个 RBS 被“驯化”至 pSL099，第二个 CDS 被“驯化”至 pSL102，终止子被“驯化”至 pSL106。
   3. 根据所选的受体质粒，为设计的插入片段添加相应的末端序列。表1列出了不同受体质粒进行 GG 组装所需的末端序列。这些末端序列应在 PCR 引物设计、双链寡核苷酸退火构建元件，或基因合成过程中加入。
      注：为使元件成功“驯化”，必须确保元件内部不含有本试剂盒所用 Type IIS 限制性内切酶的识别位点，即 SapI（5'-GCTCTTC-3'）、BbsI（5'-GAAGAC-3'）和 BsaI（5'-GGTCTC-3'）。若元件中含有这些识别位点，会显著降低正确组装的效率，因为最终产物可能被所用的 Type IIS 酶切割（见 图1）。
2. GG 反应
   1. 进行 GG 反应时，加入 50 fmol 目标插入片段、50 fmol 受体质粒、1 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA 连接酶和 1 µL BbsI。用无核酸酶水补足至总体积 10 µL。同时设置阴性对照，除不加目标插入片段外，其余组分相同。
   2. 在热循环仪中运行以下程序：37 °C 孵育 3 分钟（37 °C 为限制性内切酶的最适温度），16 °C 孵育 4 分钟（16 °C 为 T4 连接酶的最适温度），重复 25 个循环；随后在 50 °C 进行最终消化 20 分钟（50 °C 时 T4 连接酶活性极低或无，而限制性内切酶仍可发挥作用，从而减少最终产物中未切割的受体质粒）；最后在 80 °C 热失活酶 20 分钟（80 °C 可使所有酶完全失活，终止反应）⁶。
   3. 将 5 µL GG 反应产物加入 50 µL 化学感受态 E. coli 细胞中，按照先前发表的方案¹⁵进行热激转化，并包含恢复培养步骤。
   4. 取 100 µL 转化后培养物涂布于含 100 µg/mL 链霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。37 °C 过夜培养。
   5. 通过计数两个平板上的白色菌落数量，比较阴性对照与完整组装反应的转化效率。若组装反应的白色菌落数约为阴性对照的 10 倍或更多，则可进入下一步。
      注：大多数转化菌落应为白色，仅少数为红色。用于 In-Cloning 工具包的受体质粒包含双重筛选元件，即 mCherry（Level 0 和 Level 1）或 LacZα（Level M 和 Level P），以及编码拓扑异构酶抑制剂的 ccdB 基因。GG 反应的转化在 ccdB 敏感型 E. coli 细胞中进行，因此只有成功组装质粒的细胞才能生长，而原始受体质粒无法增殖。常见的 ccdB 敏感菌株包括 DH5α 和 TOP10。mCherry/LacZα 可用于视觉识别逃逸 ccdB 机制的细胞¹⁶。
   6. 对每次组装，挑取两个白色菌落，用移液枪头取少量菌落材料，分别重悬于 5 mL 含 100 µg/mL 链霉素的 LB 培养基中，37 °C、250 rpm 摇床过夜培养。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。通过 Sanger 测序验证提取质粒是否具有预期序列。

2. 一级：位置的确定

注意：1级是指在驯化部件与组装多顺反子操纵子之间的层级（图2）。在此层级中确定中间组装片段在最终构建体中的位置。通过使用不同的1级接受质粒，可以改变1级组装在操纵子中的位置。此处给出的示例描述了双顺反子单元的组装，但该方案可轻松适用于最多六个编码序列（每个均带有核糖体结合位点）的组装。若需组装更多编码序列，则还需在P级和M级之间进行循环。通过P级与M级的迭代循环，单个操纵子中可组装的编码序列数量没有固定的上限。

1. 部件与受体质粒的选择
   1. 选择将要组装成转录单元的0级部件。至少应包括启动子、CDS（编码序列）和终止子。
   2. 确定转录单元在操纵子中的组装位置。根据该位置选择合适的受体质粒。详见图2。
      注：以构建双顺反子操纵子为例，共需7个DNA片段，分别组装为两个1级结构。其中启动子、第一个RBS、第一个CDS和终止子连接桥片段组装至pSL68；第二个RBS、第二个CDS和终止子组装至pSL69。
2. GG反应
   1. 进行GG反应时，加入每种所需插入片段各50 fmol、50 fmol受体质粒、1 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4 DNA连接酶和1 µL SapI。用无核酸酶水补足至总体积10 µL。
   2. 在PCR仪中运行以下程序：37 °C孵育3分钟和16 °C孵育4分钟，重复25个循环，随后在50 °C进行最终消化20分钟，最后在80 °C加热失活酶20分钟⁶。
   3. 可选：向GG反应体系中加入0.5 µL SapI，在37 °C孵育1小时。
      注：SapI的稳定性不如其他常用IIS型限制性内切酶。研究发现，在GG反应后增加一步SapI消化，可减少携带重新连接受体质粒的菌落数量。SapI有一个同裂酶BspQI，可能无需此最终消化步骤。
   4. 取5 µL GG反应产物，转入50 µL化学感受态E. coli细胞中，进行热激转化，建议采用步骤1.2.3中的恢复培养步骤。
   5. 取100 µL转化后培养物涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C过夜培养。
   6. 对每个转化子，挑取两个白色菌落，用移液器吸头取少量菌落材料，分别重悬于5 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。
   7. 通过BbsI限制性酶切验证正确组装，确认切出片段大小与预期插入片段大小一致。取1000 ng质粒DNA，加入1 µL相应的10x酶切缓冲液和1 µL BbsI，用无核酸酶水补足至总体积10 µL，37 °C孵育15分钟。
   8. 将酶切后的质粒样品上样至1%琼脂糖凝胶，以100 V电泳35分钟。
      注：可通过in silico（计算机模拟）酶切分析预期质粒，模拟琼脂糖凝胶电泳以预测结果。

3. M 级：多顺反子操纵子的组装

注意：在此步骤中，正在组装多顺反子操纵子。以所示的双顺反子操纵子为例，两个一级插入片段被分别组装至第1和第2位点。因此，选择受体质粒pMA60。此外，还需要一个末端连接子。所有M级和P级受体质粒在第二个突出端均为GGGA。末端连接子用于连接插入片段与受体质粒，实现P级构建体向M级的组装，反之亦然。在将两个一级插入片段进行P级组装时，使用末端连接子pMA668，并将其置于第三即最终位置。图3展示了M级和P级的总体示意图以及克隆步骤的示意图。仅在M级（或P级）进行组装时，最多可克隆包含6个编码序列的操纵子（位置1–6）。第7位点由末端连接子占据。虽然可在操纵子中组装更多数量的编码序列，但这需要在M级（或P级）之间循环操作，本实验方案未对此进行描述。

1. 进行GG反应时，加入每种所需插入片段各50 fmol、50 fmol的受体质粒、1 µL的10x T4 DNA连接酶缓冲液、1 µL T4连接酶和1 µL BbsI。用无核酸酶水补至总体积为10 µL。
2. 在PCR仪中运行以下程序：37 °C 3分钟和16 °C 4分钟，共50个循环；随后在50 °C进行最终消化20分钟，再于80 °C使酶失活20分钟⁶。
3. 将5 µL GG反应产物转入50 µL化学感受态E. coli细胞中，并按照步骤1.2.3的方法进行热激转化及恢复培养。
4. 取100 µL转化后菌液涂布于含100 µg/mL链霉素的LB琼脂平板上。37 °C过夜培养，若预期组装产物存在代谢负担或毒性，则在30 °C培养。
5. 对每个组装产物，挑取两个白色菌落进行培养。具体操作为：用移液器吸头蘸取菌落，接种至含100 µg/mL链霉素的5 mL LB培养基中，在250 rpm摇床中37 °C或30 °C过夜培养。按照制造商说明书进行柱式质粒提取。
6. 通过BsaI限制性酶切验证正确组装，检查切出片段大小是否与预期插入片段大小一致，操作方法同步骤2.2.7。
   注意：构建体可能过长，无法通过Sanger测序完全验证。此时可通过全质粒测序确认，该服务可由多家测序服务提供商提供商业服务。

结果

此处展示了从 Level 0 到 Level M 自下而上组装一个多顺反子操纵子的结果（图 S1）。该操纵子以启动子 P_LuxB 起始，在诱导物 N-(β-酮辛酰基)-L-高丝氨酸内酯（OC6）存在的情况下，可被蛋白 LuxR 激活¹⁷。操纵子的第一个编码序列（CDS）为绿色荧光蛋白（GFP），其核糖体结合位点（RBS）为 iGEM BBa_B0064。GFP 后接一个非终止型连接序列，即“终止子桥”。第二个 RBS 由 RBS 计算器设计¹⁸，第二个编码序列为 mTurquoise。最后，操纵子以终止子 L3S2P21 结束¹⁹。

终结者装置的驯化
为了组装设计的多顺反子操纵子，所有分子元件都需要在相应的受体质粒中进行驯化。通过退火两条寡核苷酸（见 表 S2）。寡核苷酸设计时包含4个核苷酸的突出端，以便插入p...

讨论

分子克隆可能耗时且繁琐，尤其是采用临时设计的克隆策略时。MoClo 工具包通过其模块化设计、分级组装以及高效的一锅法反应，可显著提升分子克隆效率。该方法依赖于Golden Gate连接反应实现DNA组装。由于采用标准化的黏性末端，分子元件文库可被重复使用并共享给其他研究者^3,6。元件的可重用性使得构建混合或阵列化的多基因组合文库成为可能。例如，这有助于优化异源表达通路，以确定理想的启动子强度或酶的种类。该方法的标准化特性使其易于实现自动化，从而支持DNA的高通量组装。此外，In- & Out-Cloning MoClo 工具包中的Out-Cloning方案支持高效构建含有不同复制起点和筛选标记的受体质粒，使研究人员能够组装适用于其目标生物的质粒⁷。

此处使用了In- & Out-Cloning MoClo工具箱。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Merck Life Science	A9518
细菌琼脂	Fisher Scientific	P0011B
BbsI-HF	New England Biolabs	R3539
BsaI-HF V2	New England Biolabs	R3733
E. coli DH5α 感受态细胞
Eppendorf Mastercycler Nexus 热循环仪	Eppendorf	6333000014
EzDrop 1000 微量分光光度计	Blue-Ray Biotech	BRED-1000
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0503
In- & Out- Cloning Toolkit
连接酶缓冲液	New England Biolabs	B0216
NaCl	Fisher Scientific	BP358
New Brunswick Innova® 42/42R - 可堆叠培养摇床	Eppendorf	M1335-0080
PhenoBooth+	Singer Instruments	PHB-007
SapI	New England Biolabs	R0569
壮观霉素	Merck Life Science	S4014
标准实验耗材
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202
Thermomix MM	B. Braun Biotech International
胰蛋白胨	Fisher Scientific	LP0042B
酵母提取物	Fisher Scientific	LP0021B