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方法文章

表现出坏死、凋亡和血小板活化特征的促凝血性血小板的综合分析

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DOI：

10.3791/68116

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2025年5月23日

 , 
1Department of Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Taussig Cancer Institute, Cleveland Clinic

本文内容

摘要

本方案提供了一套完整的操作步骤，用于分析具有坏死、凋亡和血小板活化重叠特征的促凝血性血小板。

摘要

在血液循环中的血小板通常处于相对静息状态，但当其在血管损伤部位遇到刺激物或“激动剂”时，便会进入“活化”状态。促聚集性血小板和促凝血性血小板代表了两种不同的活化血小板亚群。促聚集性血小板通过纤维蛋白原桥连接形成血小板聚集体，从而实现止血；而促凝血性血小板则显著加速凝血级联反应，最终形成纤维蛋白凝块。促凝血性血小板的一个有趣特征是其形态学表现出某些“坏死”和“凋亡”的特征。因此，它们可能代表了一种血小板的细胞死亡形式，尽管在血栓形成和止血过程中发挥着重要作用。本文介绍了促凝血性血小板的概念、其在健康与疾病中的意义，以及现有分析方法的比较。随后提供了分析促凝血性血小板、研究其形成机制以及评估其在促进凝血中促血栓作用的全面实验方案。文章最后讨论了所述方法中的关键步骤、局限性及故障排除原则。

引言

至少存在两种不同的活化血小板群体1,2。促聚集性血小板的特征是整联蛋白高度活化，而磷脂酰丝氨酸（PS）暴露程度很低甚至没有。相反，促凝血性血小板则表现为整联蛋白活性较低但PS暴露显著增加1,2，从而为凝血因子X酶复合物和凝血酶原酶复合物的组装提供表面3，其催化活性分别比游离可溶态的因子IXa和Xa高出105-106倍和300000倍4。因此，促凝血性血小板显著加速了凝血过程。一个有趣的现象是，促凝血性血小板的形态学特征既表现出某些类似"坏死"的特点，如微囊泡形成、细胞肿胀伴细胞骨架破坏以及膜完整性丧失，也表现出某些类似"凋亡"的特征，例如膜磷脂不对称性丧失，导致磷脂酰丝氨酸暴露于细胞膜外小叶5,6。换句话说，促凝血性血小板的形成可能代表了一种血小板的细胞死亡形式，尽管其在止血过程中具有重要的生理功能。

促凝血性血小板与血栓性疾病显著相关。尽管大多数健康个体的循环血液中不存在促凝血性血小板，但约30%的正常供体血小板可呈现促凝血表型。 离体 暴露于凝血酶和胶原等强效激动剂后7. 创伤患者中已报道存在循环中的促凝血性血小板，其形成可能反映了组蛋白H4的激活作用8,9然而，在大多数血栓前状态疾病中，促凝血小板水平的升高仅在以下情况后被检测到 离体 刺激10例如，急性中风患者 >51.1%的血小板经胶原和凝血酶诱导转化为促凝血小板（亦称COAT化血小板）的患者，相较于促凝血小板生成较少的患者，在30天内复发性卒中的风险比为10.7211短暂性脑缺血发作和颈动脉粥样硬化患者中也报道过类似结果12相比之下，出血性疾病斯科特综合征是由一种突变所致 ANO6，编码磷脂翻转酶 TMEM-16F，导致血小板磷脂酰丝氨酸暴露不足13特发性出血性疾病和颅内出血可能与产生促凝血小板的能力下降有关14.

因此，在研究血小板活化机制及其引发的血栓形成和止血过程的基础研究中，以及在各种病理状态下对患者血栓或出血风险进行临床分析时，评估促凝血血小板都是血小板功能分析的重要组成部分。国际血栓与止血学会（ISTH）专家组建议采用膜联蛋白V（Annexin V）结合试验和P-选择素（P-selectin）表达的流式细胞术来区分促凝血性血小板与其他血小板亚群15。该文章还讨论了可用于分析促凝血性和凋亡性血小板的各种方法，但未详细描述具体操作流程。这些方法包括：（1）通过PAC1/JonA或纤维蛋白原结合检测血小板活化（流式细胞术）；（2）通过P-选择素表达检测α颗粒分泌（流式细胞术）；（3）通过膜联蛋白V/乳连蛋白（lactadherin）结合检测磷脂酰丝氨酸（PS）暴露（流式细胞术）；（4）通过GSAO标记检测细胞膜完整性丧失（流式细胞术）；（5）通过显微镜观察气球样变等形态学改变；（6）通过caspase活性检测（免疫印迹/发光法/流式细胞术）或细胞骨架底物gelsolin的降解（免疫印迹）来检测caspase激活；（7）利用JC-1/Mitotracker等线粒体膜电位敏感性染料检测线粒体膜电位的丧失（流式细胞术）；（8）检测线粒体内在凋亡标志物Bax、Bak以及细胞色素c的释放（免疫印迹）；（9）通过凝血酶生成试验以及凝血因子Xa/Va结合检测促凝血功能（流式细胞术、显微镜）；（10）利用荧光钙敏感性染料检测胞质和线粒体内钙离子浓度升高（流式细胞术、荧光光度法、显微镜）。

本研究深入探讨了促凝血小板的分析方法，并将其与促聚集性小板及凋亡小板加以区分。所述大多数实验步骤依赖于流式细胞术，该技术具有以下优势：（1）易于获取且操作简便；（2）所需样本量少；（3）可同时检测多种血小板亚群（促聚集性、促凝血性和凋亡性）15。此外，本研究还结合了基于凝血因子结合和凝块形成凝血酶生成的功能性检测方法，以评估促凝血活性。

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方案

在获得受试者书面知情同意后，按照克利夫兰诊所勒纳研究所机构审查委员会的建议和批准，招募人类受试者进行外周静脉采血，所有研究方法均符合《赫尔辛基宣言》所规定标准。纳入年龄在18岁以上健康成年受试者，排除年龄小于18岁、近六个月内有血栓事件病史、有酗酒或药物滥用史，以及在过去四周内使用过抗血小板或抗凝药物的个体。本方案中所用材料与试剂的详细说明见于 材料表.

1. 血小板制备

  1. 在获得受试者书面知情同意后，按照机构审查委员会批准的建议，将外周静脉血样本采集至含ACD抗凝剂的容器中（血液与抗凝剂体积比为1:9）。
  2. 将加入ACD抗凝剂的血液在22 °C条件下以100 × g离心20分钟，收集上清液以获得富血小板血浆（PRP）。
  3. 向PRP中加入3 µM PGE1和2 mM EDTA后，在22 °C条件下以800 × g离心7分钟。
  4. 弃去上清液，用移液器轻轻吹打，将血小板沉淀重悬于缓冲液A中（见材料表）。
  5. 将重悬于缓冲液A中的血小板在22 °C条件下以800 × g离心7分钟。
  6. 用移液器轻轻吹打，将血小板沉淀重悬于缓冲液B中（见材料表）。
  7. 使用自动细胞计数仪将最终血小板浓度调整至1 × 107/mL。
    注意：所有操作均需在无菌条件下进行，并在移液过程中避免过度剪切力，以保持血小板处于静息状态。

2. 通过流式细胞术分析促凝血血小板

  1. 向洗涤后的人血小板中添加 2.5 mM 钙（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储备液）。
  2. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL、0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL）或其组合刺激 15 分钟。
  3. 刺激后，向 100 µL 刺激后的血小板悬液中各加入 1 µL PE-Annexin V、FITC-PAC1 和 APC-抗人 CD62P 抗体。
  4. 将血小板在室温下避光孵育 30 分钟。
  5. 通过加入等体积（1:1）的 2% 甲醛溶液固定血小板。
  6. 通过流式细胞术分析样品，以定量促凝血血小板15,16。
  7. 绘制不规则门控以包含血小板，将其与噪声及多血小板颗粒区分开。
  8. 对每个样品的血小板门控中的 10,000 个事件，使用四象限对数放大方式收集所有荧光数据。
  9. 根据磷脂酰丝氨酸（PS）暴露（Annexin V 结合）、P-选择素（CD62P）表达以及整合素 αIIbβ3 活化（PAC1 结合）的荧光阳性或阴性情况，定义血小板的分群区域。
  10. 将同时表现为 PS 暴露（Annexin V 结合）和 P-选择素（CD62P）表达阳性但整合素 αIIbβ3 活化（PAC1 结合）阴性的血小板定义为促凝血血小板（图 1）（表 1）。
  11. 类似地，将同时表现为整合素 αIIbβ3 活化（PAC1 结合）和 P-选择素（CD62P）表达阳性但 PS 暴露（Annexin V 结合）阴性的血小板定义为促聚集性血小板。
    注意：整合素 αIIbβ3 活化（PAC1 结合）和 P-选择素（CD62P）表达均为阴性但 PS 暴露（Annexin V 结合）阳性的血小板可能为凋亡血小板15,16。

3. 通过流式细胞术分析线粒体钙

  1. 将洗涤后的人血小板稀释至 1 × 106/mL，并补充 2.5 mM 钙（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储存液）。
  2. 在避光条件下，用 5 µM Rhod-2 AM（用于线粒体钙检测）标记血小板，孵育 30 分钟。
  3. 按照步骤 2 中所述方法，对血小板进行适当的设门。
  4. 使用 PE 荧光（对应 Rhod-2 AM）对时间的密度散点图，分析血小板门内事件在 5 分钟内采集事件平均荧光强度随时间的变化。
  5. 记录前 1 分钟的基线钙水平。
  6. 加入凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或两者的组合，继续采集数据 4 分钟17。

通过流式细胞术分析线粒体膜电位

  1. 向洗涤后的人血小板中补充 2.5 mM 钙离子（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储存液）。
  2. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或其组合刺激 15 分钟。
  3. 刺激后，向刺激的血小板悬液中加入线粒体标记染料（见材料表），终浓度为 500 nM。
  4. 将血小板在避光条件下孵育 30 分钟。
  5. 通过加入等体积的 2% 甲醛固定血小板。
  6. 通过流式细胞术17分析样品。
  7. 按照步骤 2 中所述方法适当设门圈定血小板。
  8. 分析血小板门内事件在流式细胞仪 PE 通道（用于线粒体标记染料）荧光信号的下降情况。

通过流式细胞术分析caspase 3和caspase 8的活性

  1. 向洗涤后的人血小板中添加 2.5 mM 钙（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储存液）。
  2. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或其组合刺激 15 分钟。
  3. 刺激后，向刺激的血小板悬液中加入 1:1000（v/v）的凋亡检测试剂（见材料表）（用于检测内源性和外源性凋亡通路），或加入 1:300 （v/v） FITC-IETD-FMK（用于外源性凋亡通路中的 caspase 8）。
  4. 将血小板在避光条件下孵育 30 分钟。
  5. 通过加入等体积的 2% 甲醛固定血小板。
  6. 通过流式细胞术17分析样品。
  7. 按照步骤 2 中所述方法，正确设门圈定血小板。
  8. 在流式细胞仪的 FITC 荧光通道中，分析血小板门内事件的荧光信号（用于检测 caspase 3/7 或 caspase 8）。

6. 通过流式细胞术分析凝血酶原结合

  1. 使用蛋白质标记试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书将牛凝血酶原与 Alexa Fluor 488 染料进行偶联。
  2. 在洗涤后的人血小板中加入 2.5 mM 钙离子（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储备液）。
  3. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或两者联合刺激 15 分钟。
  4. 刺激后，在 100 µL 刺激后的血小板悬液中加入 AF488 标记的牛凝血酶原（100 µg/mL），以及 PE 标记的 Annexin V 和 APC 标记的抗人 CD62P 抗体各 1 µL。
  5. 通过加入等体积的 2% 甲醛溶液固定血小板。
  6. 通过流式细胞术17 分析样品，以定量凝血酶原与血小板的结合情况。
  7. 绘制不规则门控区域，以区分血小板与噪声及多血小板颗粒。
  8. 对每个样本在血小板门控区域内，使用四象限对数放大方式收集 10,000 个事件的全部荧光数据。
  9. 设定区域，用于区分磷脂酰丝氨酸（PS）暴露（Annexin V 结合）、P-选择素（CD62P）表达以及 AF488-凝血酶原（凝血酶原结合）呈荧光阳性或阴性的血小板。
  10. 确定所有血小板事件中，以及同时表现为 PS 暴露（Annexin V 结合）和 P-选择素（CD62P）表达阳性（即促凝血活性血小板）的血小板中，凝血酶原结合阳性的比例。

7. 通过共聚焦显微镜分析凝血酶原结合

  1. 使用蛋白质标记试剂盒（参见材料表），按照制造商说明书将牛凝血酶原与 Alexa Fluor 488 染料进行偶联。
  2. 在洗涤后的人血小板中加入 2.5 mM 钙离子（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储备液）。
  3. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或两者的组合刺激 15 分钟。
  4. 刺激后，在 100 µL 刺激后的血小板悬液中加入 AF488 标记的牛凝血酶原（100 µg/mL），以及各 1 µL 的 PE-Annexin V 和 APC 标记的抗人 CD62P 抗体。
  5. 通过加入等体积的 2% 甲醛溶液固定血小板。
  6. 将固定的血小板沉淀至聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上。
  7. 使用抗荧光淬灭溶液将盖玻片封片于显微镜载玻片上。
  8. 或者，在湿润环境中用胶原蛋白（100 µg/mL）包被盖玻片 1 小时。
  9. 用含 0.5% BSA 的 PBS 溶液在室温下封闭包被后的盖玻片 1 小时。
  10. 用 AF488 标记的牛凝血酶原（100 µg/mL）以及各 1 µL 的 PE-Annexin V 和 APC 标记的抗人 CD62P 抗体对血小板进行标记。
  11. 让标记后的血小板在胶原蛋白包被的盖玻片上黏附 20 分钟。
  12. 用 PBS 溶液洗涤黏附有血小板的盖玻片三次。
  13. 用 2% 多聚甲醛在室温下固定盖玻片 1 小时。
  14. 使用抗荧光淬灭溶液将盖玻片封片于显微镜载玻片上。
  15. 在共聚焦显微镜下使用 63× 物镜观察载玻片。
  16. 使用 Fiji 软件对图像进行荧光定量分析。

8. 基于凝块的血小板磷脂依赖性凝血酶生成检测

  1. 向洗涤后的人血小板中加入 2.5 mM 钙（在 100 µL 血小板悬液中加入 0.5 µL 的 0.5 M CaCl2 储备液）。
  2. 将一部分血小板保持未刺激状态，其余部分在室温下用凝血酶（0.1 U/mL、0.25 U/mL 或 0.5 U/mL）、convulxin（20 ng/mL、50 ng/mL 或 100 ng/mL）或其组合刺激 15 分钟。
  3. 将 100 µL 处理后的血小板加入预先在 37 °C 预孵育 5 分钟的混合液中，该混合液包含 50 µL 混合正常血浆和 50 µL 低浊度高岭土溶液（20 mg/mL）。
  4. 向混合液中加入 5 mM CaCl2。
  5. 使用酶标仪通过浊度法监测凝块形成，每 60 秒测量一次 660 nm 处的吸光度，持续 1 小时。

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结果

一部分活化的血小板会转变为“促凝血型”，其特征是表面磷脂酰丝氨酸（PS）和P-选择素的表达显著升高，从而区别于仅表达PS暴露的“凋亡型”血小板以及仅表达P-选择素的“促聚集型”血小板。我们发现，凝血酶可诱导表达P-选择素和PS双阳性的促凝血型血小板比例呈剂量依赖性增加，该现象分别通过FITC-抗CD62P抗体和PE-Annexin V结合检测得到证实（图2）。促凝血型血小板的生成依赖于线粒体钙离子内流18,19，该过程发生于激动剂诱导胞质钙升高后，沿线粒体内膜电化学梯度进行，并继发环亲素D（CypD）依赖的线粒体通透性转换孔（mPTP）形成20。与此一致的是，凝血酶诱导的促凝血活性增强伴随着线粒体钙水平升高（图3）以及线粒体膜电位下降（图4），分别通过Rhod-2和Mitotracker Red染...

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讨论

促凝血小板在受到刺激后，其细胞内钙离子水平会显著且持续升高26，但这一过程可能通过不同的机制产生。在胶原和凝血酶等强激动剂的刺激下，促凝血小板通过多种介质生成，其中最主要的是在线粒体膜电化学梯度驱动下，细胞质钙离子升高诱导的线粒体钙离子内流18,19。当线粒体内的钙离子浓度达到一定阈值时，会以亲环素D（CypD）依赖的方式激活线粒体通透性转换孔（mPTP）的形成20。一旦线粒体对钙离子通透，无法再作为细胞质钙离子的缓冲池，mPTP形成后即出现超最大强度的钙信号26。持续升高的细胞质钙离子水平反过来激活钙依赖性磷脂翻转酶TMEM16F，导致磷脂酰丝氨酸（PS）暴露27,28。PS的暴露伴随着整合素αIIbβ3的失活，该过程...

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披露

作者声明无竞争利益需要披露。

致谢

Paresh P. Kulkarni 和 Keith R. McCrae 分别致谢 VeloSano、克利夫兰诊所基金会资助的学者奖和试点项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）溶液（配制1000 mL）三钠柠檬酸盐-            22 g
柠檬酸-                            8 g
葡萄糖-                              24.5 g
水-                                   加水定容至1000 mL 
Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒InvitrogenA10235
APC 小鼠抗人 CD62PBD Pharmingen550888
牛凝血酶原ProlytixBCP-1010
缓冲液 A（血小板制备）                    分子量         1X 浓度      配制 100 mL 10X 溶液
HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g
NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g
KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg
MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg
NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg
NaHCO3        84.01           12 mM            1.01 g
调节 pH 至 6.2 后加水定容至 100 mL

血小板制备前，用 Milli Q 水将 10X 溶液按 1:10（v/v）稀释，得到 1X 溶液，需补充以下成分
                 1X 浓度      配制 1 mL 1X 溶液
EGTA           1 mM       加入 10 μL（1:100 v/v）100 mM EGTA 
葡萄糖         5 mM      加入 5 μL（1:200 v/v）1 M 葡萄糖
PGE1            3 μM      加入 3 μL（1:333 v/v）1 mM PGE1 溶液
缓冲液 B（血小板制备）                    分子量         1X 浓度      配制 100 mL 10X 溶液
HEPES        238.30         20 mM                    4.766 g
NaCl              58.44       134 mM                   7.83 g
KCl                74.55        2.9 mM               216.19 mg
MgCl2          203.30           1 mM              203.30 mg
NaH2PO4    156.01        0.34 mM                53.04 mg
NaHCO3        84.01           12 mM            1.01 g
调节 pH 至 7.4 后加水定容至 100 mL

血小板制备前，用 Milli Q 水将 10X 溶液按 1:10（v/v）稀释，得到 1X 溶液，需补充以下成分
                 1X 浓度      配制 1 mL 1X 溶液
葡萄糖         5 mM      加入 5 μL（1:200 v/v）1 M 葡萄糖 
CaCl2（0.5 M）（配制 50 mL）CaCl2·2H2O 分子量 = 147.02
将 3.675 g CaCl2·2H2O 溶于 50 mL Milli Q 水中
CellEvent Caspase-3/7 绿色检测试剂InvitrogenC10423凋亡检测试剂
ConvulxinEnzo Life SciencesALX-350-100
EDTA（0.5 M；pH 8）（配制 100 mL）EDTA Na2·2H2O 分子量：372.24 g
称取 18.612 g，溶于 50 mL Milli Q 水中，检测 pH（pH ~ 4）
缓慢滴加 10 N NaOH 并搅拌，同时监测 pH
EDTA 在 pH 约 7 时开始溶解，pH 8 时完全溶解
用 Milli Q 水定容至 100 mL
EGTA（100 mM；pH 7.4）（配制 100 mL）分子量：380.4
将 3.804 g EGTA 加入 50 mL Milli Q 水中，检测 pH（pH ~ 3）
边搅拌边逐滴加入 10 N NaOH，并监测 pH
EGTA 在 pH 约 7.0 时开始溶解
调节 pH 至 7.4
用 Milli Q 水定容至 100 mL
FITC 小鼠抗人 PAC-1BD340507
FITC-IETD-FMK Caspase 8（活化）染色试剂盒Abcamab65614
Mitotracker Red CMXRos（线粒体标记染料）InvitrogenM7512储存液 = 1 mM（50 µg 溶于 90 µL DMSO）
次级储存液 = 100 µM（10 µL 储存液 + 90 µL DMSO）
工作浓度 = 500 nM（0.5 µL 加入 100 µL）
PE Annexin VBD Pharmingen560930
前列腺素 E1SigmaP5515储存液 = 20 mM（1 mg 溶于 141 µL DMSO）
次级储存液 = 1 mM（10 µL 储存液 + 190 µL DMSO）
工作浓度 = 3 µM（3 µL 加入 1 mL）
Rhod-2 AMInvitrogenR1244储存液 = 5 mM（1 mg 溶于 178 µL DMSO）
次级储存液 = 100 µM（10 µL 储存液 + 90 µL DMSO）
工作浓度 = 500 nM（0.5 µL 加入 100 µL）
人血浆凝血酶SigmaT7572

参考文献

  1. Munnix, I., Cosemans, J., Auger, J., Heemskerk, J. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (12), 1149-1156 (2009).
  2. Heemskerk, J. W. M., Mattheij, N. J. A., Cosemans, J. M. E. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  3. Podoplelova, N. A., et al. Coagulation factors bound to procoagulant platelets concentrate in cap structures to promote clotting. Blood. 128 (13), 1745-1755 (2016).
  4. Mann, K. G., Butenas, S., Brummel, K. The dynamics of thrombin formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (1), 17-25 (2003).
  5. Jackson, S. P., Schoenwaelder, S. M. Procoagulant platelets: Are they necrotic. Blood. 116 (12), 2011-2018 (2010).
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  7. Dale, G. L. Coated-platelets: An emerging component of the procoagulant response. J Thromb Haemost. 3 (10), 2185-2192 (2005).
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血小板坏死血小板凋亡流式细胞术血小板代谢凝血酶刺激线粒体钙半胱天冬酶激活磷脂酰丝氨酸表达
表现出坏死、凋亡和血小板活化特征的促凝血性血小板的综合分析
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