本研究建立了一种优化的小鼠系膜细胞（MCs）分离方案及其 离体 细胞培养。这些细胞可多次传代、冻存、复苏和培养，且不会影响细胞生长或蛋白表达。
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摘要
摘要
系膜细胞（MCs）是位于肾小球中间区域的间充质细胞，在肾小球稳态中发挥关键作用。自20世纪80年代以来，已建立并优化了用于生物医学研究（尤其是肾脏病学领域）的肾小球MCs分离、纯化和培养方法。小鼠是肾病研究中最常用的实验动物模型。在本研究中，我们开发了一种优化的小鼠MCs分离及ex vivo细胞培养方案。这些细胞可多次传代、冻存、复苏和培养，且不影响细胞生长或蛋白表达。该优化方法显著缩短了研究人员所需的研究周期，并支持细胞的长期保存。实验所需设备在基础生物医学实验室中易于获取，操作步骤简便。获取目标细胞仅需2-3周，相比现有方法至少缩短1周。
引言
肾小球是一团毛细血管网，其基本功能是过滤血液以形成尿液1。系膜细胞（MCs）嵌于系膜基质中，位于肾小球毛细血管之间，凭借其多种功能在调控肾小球动态过程中处于独特位置2。MCs在肾小球中发挥关键作用，包括参与肾小球发育、为肾小球毛细血管提供结构支持、执行吞噬功能以及合成肾小球基底膜基质3。对系膜细胞的研究对于深入理解肾脏生理学和病理学具有重要意义。
系膜细胞在病理状态中的作用同样值得关注。在肾小球损伤或疾病（如糖尿病肾病或肾小球肾炎）发生时，系膜细胞可发生增殖并分泌过多的细胞外基质成分，导致肾小球硬化及肾功能受损4,5。因此，深入了解系膜细胞的功能及其调控机制，对于开发肾脏疾病的治疗策略至关重要。
小鼠系膜细胞 使研究人员能够模拟并探索IgA肾病6、糖尿病肾病7以及局灶节段性肾小球硬化症（FSGS）8,9等疾病中涉及的分子和细胞过程。由于小鼠肾小球系膜细胞在肾纤维化和炎症中发挥重要作用，它们常被用于临床研究，以评估治疗性化合物的疗效9,10。此外，小鼠系膜细胞也是研究多种信号通路对肾功能影响的重要工具，包括RhoA/ROCK通路11和转化生长因子-β（TGF-β）通路12。这些研究有助于阐明这些信号分子如何促进肾脏疾病的进展。无论用于疾病建模、药物开发还是信号转导研究，小鼠系膜细胞都持续作为推动我们理解肾脏健康与疾病的关键资源。
Mackay 等人于 1988 年建立了一种从转基因小鼠获取肾小球上皮细胞、系膜细胞和内皮细胞的离体（ex vivo）细胞系的方法13。Wilson 和 Stewart 开发了一种从患者肾组织中分离和纯化原代系膜细胞（MCs）的方法，该方法包括三轮筛分以及用培养基进行大量洗涤14。Menè 和 Stoppacciaro 也提出了一种从患者或大鼠肾组织中分离原代系膜细胞的方法。该技术包括两轮筛分、两次针头推挤以及胶原酶消化。来自 4–8 只大鼠肾脏的细胞被接种于六孔板中，但产量相对较低15。这些方法均需在处理前将肾脏解剖成小块。此外，这些方法大约需要 3–4 周才能获得纯化的系膜细胞。
小鼠是肾脏疾病研究中最常用的实验动物模型。然而，目前仍缺乏系统的小鼠系膜细胞（MCs）分离方法。在本研究中，我们建立了一种优化的小鼠系膜细胞分离方案 离体 细胞培养。该方法适用于使用原代小鼠肾系膜细胞（MCs）进行实验研究。与以往方法相比，该方法无需在消化前进行组织切割和过筛。取完整小鼠肾脏，使用细胞研磨器研磨后，直接用胶原酶消化。消化液随后进行两次过筛，所有细胞收集于第二层筛网上并重悬。该方法可在10天内利用两只小鼠的肾脏获得足够接种两至三个100 mm培养皿的细胞量。随后通过特定培养基培养与纯化，获得纯化的系膜细胞（MCs）。 含有D-缬氨酸。这些细胞可多次传代、冻存、复苏和培养，且不影响细胞生长或蛋白表达。所需设备在基础生物医学实验室中易于获取，整个过程仅需2-3周即可获得目标细胞。该方法适用于利用小鼠MCs研究肾脏相关疾病或机制，具有高效且节省时间的优点。
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方案
动物实验遵循 ARRIVE 指南，所有动物操作均依照国家法律法规及欧洲委员会指令（2010/63/EU）进行。小鼠饲养和维持于无病原体环境中，符合四川大学华西医院动物护理与使用委员会的要求。所有实验动物研究均经四川大学华西医院动物护理与使用委员会批准。本实验采用 8 周龄 C57BL/6JGpt 雄性小鼠用于分离系膜细胞。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。图 1展示了小鼠肾小球系膜细胞的分离与纯化流程。
1. 小鼠肥大细胞分离所需试剂的制备
注意：确保所有试剂和设备均为无菌状态。
- I 型胶原酶（750 U/mL）：称取粉末，使用前立即用 RPMI 1640 溶解。
- 系膜细胞培养基 1：将 RPMI 1640 与 2 mM 谷氨酰胺、17% 胎牛血清（FBS）、抗生素（100 单位/mL 青霉素 + 10,000 µg/mL 链霉素）以及 0.1 U/mL 胰岛素混合。
- 系膜细胞培养基 2：将 RPMI 1640（D-缬氨酸）与 2 mM 谷氨酰胺、10% 胎牛血清（FBS）、抗生素（100 单位/mL 青霉素 + 10,000 µg/mL 链霉素）、ITS-G（胰岛素、转铁蛋白、硒溶液 100 倍浓缩液）以及 0.1 U/mL 胰岛素混合。将系膜细胞培养基储存于 4 °C，配制后 1 个月内使用。
- 细胞冻存培养基：按 7:2:1 的比例配制 RPMI 1640 培养基、血清和 DMSO 的混合液。
2. 小鼠肥大细胞的分离
- 人道处死小鼠 通过 CO2 窒息后行颈椎脱位（遵循机构批准的方案）。将尸体浸入盛有75%酒精的烧杯中进行消毒，然后将动物转移至无菌操作台。
注意：一氧化碳（CO）反应完成后2 观察小鼠心跳和呼吸停止以确认窒息死亡，随后进行颈椎脱位以确保安乐死。 - 无菌条件下使用剪刀和镊子取出小鼠肾脏，置于培养皿中，用EBSS（Earle's平衡盐溶液）冲洗，然后用镊子仔细去除结缔组织和肾包膜。
- 将肾脏纵向切成两半，加入3-4 mL I型胶原酶溶液，用塑料细胞研杵研磨。
- 将所有组织和溶液用移液器从培养皿转移至15 mL离心管中。用1–2 mL胶原酶I溶液冲洗培养皿，以确保所有组织被完全转移。将溶液置于37 °C摇床中，以120 rpm振荡30分钟。随后，加入等体积的终止液（培养基1）。
- 从15 mL离心管中吸取溶液，经100 µm细胞滤网过滤，将滤液收集至50 mL离心管中。
- 将步骤2.5中的液体通过40 µm细胞筛网过滤，仅保留截留在40 µm细胞筛网上的细胞。用培养基1反复冲洗筛网，以确保尽可能收集筛网上滞留的全部细胞。将筛网上收集的细胞转移至一个新的50 mL离心管中。
- 将悬液在600 x g 5分钟（室温），然后根据细胞密度将细胞重悬于细胞培养皿中。通常将两个肾脏的细胞重悬于两至三个100 mm培养皿中（每100 mm培养皿加入10 mL培养基）。将培养皿置于37 °C、95%空气/5% CO₂的细胞培养箱中2.
- 第二天在显微镜下（40×）观察细胞形态和贴壁情况。如果培养基中存在漂浮的死亡细胞，用移液器从培养皿底部小心吸出培养基，注意不要扰动贴壁的细胞。
- 沿培养皿内壁加入1-2 mL PBS以润洗细胞。用移液器从培养皿底部吸除全部PBS，最后沿培养皿内壁加入10 mL培养基1。
3. 小鼠肥大细胞的纯化
- 分离后一天，轻轻洗涤并更换为新鲜的培养基1（如步骤2.8所述），以去除未贴壁的细胞。在相差显微镜下（40×）观察肾小球细胞。
注意：明亮的球形结构代表肾小球，而周围具有鹅卵石样特征的细胞为上皮细胞的典型形态（图2A）。 - 在1–3 天后观察细胞形态（图2B-C）。如图2D所示，在鹅卵石样细胞周围将出现星状和纺锤状细胞。
- 当细胞达到80%融合度时（通常在7–10天内），用无菌PBS洗涤细胞两次，然后用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化（每100 mm培养皿加入2 mL 0.25%胰蛋白酶溶液）。
- 初次细胞消化过程可能需要约20分钟。加入胰蛋白酶后，将培养皿置于37 °C培养箱中。在相差显微镜下（40×）实时观察，以评估细胞消化情况。
- 当大多数细胞呈现圆形并从培养皿表面脱落时，加入等体积的培养基2以终止消化过程。
- 将细胞以600 × g离心5分钟（室温），然后重悬于培养基2中。通常将一个100 mm培养皿的细胞重悬后接种至两个100 mm培养皿中（每100 mm培养皿加入10 mL培养基2）。
- 次日更换培养基 2。在显微镜下（40×）可观察到大量悬浮细胞和细胞碎片，因为在D-缬氨酸培养基中仅有系膜细胞（MCs）能够存活并增殖16。每隔1–2天更换一次培养基以清除死亡细胞。培养皿中贴壁生长的细胞即为系膜细胞（MCs）（图3A-D）。测定分离获得的MCs的生长速率（图3E）。
- 当细胞再次达到80%融合度时，进行胰蛋白酶消化并传代。MCs的消化通常需要约5–10分钟。
4. 小鼠肥大细胞的长期保存
注意：由于原代细胞可能随着时间推移和多次传代而发生分化和突变，因此在细胞纯化后应将MCs冻存，以实现长期保存。
- 使用移液管沿培养皿底部边缘小心吸除上清液，用无菌 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 0.25% 胰蛋白酶溶液进行消化（每 100 mm 培养皿加入 2 mL 0.25% 胰蛋白酶溶液）。胰蛋白酶消化步骤请参照 3.3–3.8 步骤所述进行。
- 消化完成后，加入等体积的培养基 2 以终止消化反应，将全部液体转移至 15 mL 离心管中。在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用 1 mL PBS 重悬细胞以进行细胞计数。
- 使用自动细胞计数仪进行细胞计数。取 1 mL 重悬细胞溶液中的 20 µL 加入专用细胞计数板，测定细胞总数。根据细胞数量，将细胞重悬于细胞冻存液中（每 106 个细胞加入 1 mL 细胞冻存液）。
- 将细胞悬液转移至冻存管中（每 2 mL 冻存管加入 1 mL 细胞冻存液），先缓慢降温至 -80 °C，再转移至液氮中长期保存。
注意：可根据需要将细胞重悬后接种于细胞培养皿中进行扩增。细胞应在完成全面表征后的第 3 至第 8 代之间使用17。
5. 小鼠肥大细胞的鉴定
注意：细胞传代两次后，使用以下技术鉴定小鼠肥大细胞（MCs）。
- 小鼠MCs的Western印迹
注意：本实验所需试剂见补充表1。- 按照3.3–3.8步骤及步骤4.1的相同操作进行细胞消化。
- 收集细胞后，裂解细胞以提取蛋白，并测定蛋白浓度。
- 取适量样品（通常为20 ng），加入上样缓冲液，在100 °C下变性5分钟。
- 使用10% SDS-PAGE凝胶或7.5% SDS-PAGE凝胶分离蛋白（20 ng），然后在恒定电压下将蛋白转移至纤维素膜上。
- 用5%脱脂牛奶封闭膜，随后在4 °C摇床上与一抗孵育过夜。
- 用TBST（含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水）洗涤三次后，在室温下与二抗孵育1小时。
- 使用成像系统检测信号。
注意：本研究使用的一抗包括小鼠抗-αSMA抗体（1:500）、兔抗-波形蛋白（vimentin）抗体（1:2000）、兔抗-纤连蛋白（fibronectin）抗体（1:2000）以及小鼠抗-GAPDH抗体（1:50000）。使用的二抗包括辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1:5000）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1:5000）。
- 小鼠MCs的免疫荧光染色
注意：本实验所需试剂见补充表2。- 按照步骤3.3–3.8及步骤4.1的相同操作进行细胞消化。
- 重悬细胞并计数。取1 × 105个细胞，加入15 mm玻璃底细胞培养皿中（每15 mm玻璃底加入1 mL培养基2）。
- 用4%多聚甲醛固定MCs 15分钟（每15 mm玻璃底加1 mL 4%多聚甲醛），然后用PBS洗涤三次。
- 用0.1% Triton X-100处理细胞10分钟，以通透细胞膜。
- 再用PBS洗涤三次后，用3% BSA PBS溶液在室温下封闭细胞30分钟。
- 洗涤细胞后，在4 °C下与小鼠抗-αSMA和兔抗-波形蛋白（vimentin）一抗共同孵育过夜。
- 在室温下与红色Alexa 594标记的驴抗小鼠IgG和绿色FITC标记的驴抗兔IgG二抗孵育1小时。
- 室温下用DAPI复染细胞核1分钟。
- 加入封片荧光介质，盖上盖玻片，使用共聚焦显微镜观察细胞。
注意：本研究使用的一抗包括小鼠抗-αSMA抗体（1:200）和兔抗-波形蛋白（vimentin）抗体（1:200）。使用的二抗包括红色Alexa 594标记的驴抗小鼠IgG（1:400）、绿色FITC标记的驴抗兔IgG（1:400）以及DAPI（1:1000）。
- 小鼠MCs的流式细胞术分析
- 按照步骤3.3–3.8及步骤4.1的相同操作进行细胞消化。
- 重悬细胞并计数。取5 × 105个细胞，用3 mL PBS洗涤一次。
- 将细胞重悬于流式管中的100 µL PBS中，然后加入1–2 µL抗小鼠PDGFRB（CD140b）抗体。
- 在冰上避光孵育30分钟，随后进行流式细胞术分析。
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结果
本研究建立了一种优化的小鼠肥大细胞分离方案 离体 细胞培养。据我们所知，目前尚无标准方法用于验证原代MCs 离体根据以往的研究报道，MCs 的特征是表达 αSMA、Vimentin 和 Fibronectin3,14,15. 采用蛋白质印迹分析检测MCs的表达水平。本研究中分离的MCs表现出αSMA、纤连蛋白和波形蛋白的显著高表达（图4A）。完整的 Western 印迹图像见于 补充图1.
根据单细胞RNA测序数据库CellMarker，PDGFRB（CD140b）基因是MCs的标志基因18。在细胞经筛选后于培养基2中培养5天后，通过流式细胞术检测PDGFRB（CD140b）的表达水平（图4F
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讨论
肾脏相关疾病具有很高的发病率，而小鼠由于与人类基因相似度高，并且拥有成熟的疾病模型，被广泛用作研究这些疾病的首要动物模型。系膜细胞在维持肾小球正常结构和功能方面发挥着关键作用，包括提供结构支持、调节肾小球滤过功能以及参与免疫反应。尽管目前已存在多种从人类、大鼠和鸡中分离系膜细胞的实验技术14,15,19，但尚无标准化、高效且可重复的小鼠肾脏系膜细胞分离方法。此类方法的缺乏限制了相关研究的进展，也阻碍了在小鼠肾脏疾病模型中对系膜细胞功能的深入探究。
本研究建立了一种高效且省时的小鼠系膜细胞分离、纯化及ex vivo培养方法。优化后的实验方案可获得高活性细胞得率，为肾脏研究提供了有力工具。为成功分离细胞并维持高细胞活性，实验过程中需严格把控多个关键因素：（1）无菌操作：所有细胞收获步骤均须在超净工作台内进行，以防止微生物污染，避免影响细胞活性及实验结果。（2）组织充分破碎：应使用研磨...
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披露
作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
致谢
本工作获得了中国国家自然科学基金（项目编号：82470196、82070219 和 81870157）以及四川大学教师启动基金对 Y.Z. 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 µm 细胞筛 | Biosharp | BS-100-CS | |
| 100 mm 培养皿 | Sorfa | 230301 | |
| 15 mL 离心管 | Sorfa | 411000 | |
| 15 mm 玻璃底细胞培养皿 | Sorfa | 201200 | |
| 180 kDa Plus 预染蛋白 Marker | Vazyme | MP201-01 | |
| 2 mM L-谷氨酰胺 | BasalMedia | S210JV | |
| 4% 多聚甲醛 | Biosharp | BL539A | |
| 40 µm 细胞筛 | Biosharp | BS-40-XBS | |
| 50 mL 离心管 | Sorfa | 41000 | |
| 60 mm 培养皿 | Sorfa | 230201 | |
| 75% 乙醇 | Knowles | 64-17-5 | |
| 96 孔细胞培养板，TC 处理 | Servicebio | CCP-96H | |
| 抗生素（10 μg/mL 头孢曲松 + 100 μg/mL 庆大霉素） | NCM | C100C5 | |
| BCA（双辛可宁酸）蛋白检测试剂盒 | CWBIO | CW0014S | |
| 细胞计数试剂盒-8 | Oriscience | CB101 | |
| 共聚焦显微镜 | FV-3000 | Olympus | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Earle's 平衡盐溶液（1x EBSS） | Beyotime | C0213 | |
| 胎牛血清（FBS） | Excell | FSP500 | |
| 荧光细胞分析仪 | Mira FL | Countstar | |
| 封片介质（Fluoromount） | Southern Biotech | 0100-01 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒溶液 100x（ITS-G） | Gibco | 41400045 | |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX83 | |
| 裂解缓冲液 | Adilab | PP1101 | |
| 一步法 PAGE 制胶试剂盒（10%） | Oriscience | PB102 | |
| 一步法 PAGE 制胶试剂盒（7.5%） | Oriscience | PB101 | |
| PE 标记抗小鼠 CD140b 抗体 | Biolegend | 323605 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Servicebio | G4202 | |
| 塑料细胞研磨棒 | Biofil | CC-4090 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693159001 | |
| PVDF 膜 | Vazyme | E802-01 | |
| 重组人胰岛素 | Solarbio | 11061-68-0 | |
| Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| SDS-PAGE 样品上样缓冲液（5x） | Servicebio | G2013 | |
| 特别定制的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基（以 D-缬氨酸替代 L-缬氨酸） | Procell | WH3923U222 | |
| TBS（Tris 缓冲盐水） | Servicebio | G0001-2L | |
| Triton X-100 | Biosharp | BS084 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | Gibco | 25200072 | |
| Tween 20 | Biosharp | BS100 | |
| I 型胶原酶 | Solarbio | CB140 |
参考文献
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