本研究中，我们描述了一种逐步操作的实验方案，并重点强调了确定活细胞中线粒体形态特征的关键细节，包括样品制备、图像采集和数据分析。该方法常用于研究多种生理或病理状态下线粒体的形态变化。
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摘要
摘要
线粒体融合与分裂的动态平衡直接影响线粒体稳态，进而调控除三磷酸腺苷（ATP）稳态外的多种细胞功能。因此，在应激条件下评估线粒体形态对于机制研究至关重要。本研究描述了一种分析线粒体形态的详细方案，涵盖MitoTracker溶液的配制、线粒体染色、成像参数优化以及形态特征检测。MitoTracker是一类常用且经济高效的线粒体特异性染料。然而，由于操作不当可能导致线粒体形态发生改变，这些变化可能难以察觉，无法真实反映线粒体的实际状态。因此，有必要了解如何利用MitoTracker分析线粒体形态的变化。本方案采用1-甲基-4-苯基吡啶碘化物（MPP+）刺激的SH-SY5Y细胞来演示线粒体形态分析流程。与对照组细胞相比，经MPP+刺激的细胞表现出更小且更碎片化的线粒体，形态学参数显示线粒体投影面积减少。结果表明，MitoTracker染色是一种有效且可行的线粒体形态分析方法，经过少量调整后可适用于研究多种不同条件下的线粒体变化。
引言
线粒体形态由线粒体融合与分裂的动态平衡所维持，因此影响能量稳态及多种其他细胞功能，进而导致神经退行性疾病、癌症和炎症等多种病理状态1,2,3,4,5。为了观察线粒体形态，已开发出多种线粒体特异性染料，包括探针和抗体，可用于共聚焦显微镜检测。一些线粒体特异性探针（如四甲基罗丹明和罗丹明123）依赖线粒体膜电位（MMP）发挥作用，这限制了其在MMP受干扰条件下的应用6,7。相反，抗体染色可在固定细胞中提供不依赖MMP的线粒体形态评估方法。尽管合适的染色方法可用于评估固定细胞中的线粒体形态，但在某些诱导剂作用下对活细胞中线粒体形态的观察仍具挑战性。MitoTracker是一种可穿透细胞膜的阳离子型线粒体特异性荧光探针，能够解决这一难题，实现对活细胞和固定细胞的染色。该探针已被广泛应用于多种疾病研究中线粒体形态的检测8,9,10,11。然而，有研究报道即使严格按照生产商提供的指南使用，该探针仍可能出现背景信号高和非特异性结合等问题。这些现象凸显了充分理解样本制备和图像采集过程对于成功分析线粒体形态的重要性。
为了便于分析线粒体形态，已开发出多种图像处理程序和算法12,13,14,15,16。在本研究中，我们采用 ImageJ 中的宏工具线粒体网络分析（Mitochondrial Network Analysis, MiNA）来分析线粒体形态13。该工具通过计算九个描述性参数，有效识别并表征线粒体网络的形态特征，这些参数包括个体数量（无任何分支的结构数量）、网络数量（至少含有一个连接像素的对象数量）、平均长度（所有杆状结构和分支的平均长度）、中位长度（所有杆状结构和分支的长度中位数）、长度标准差（各长度值的标准差）、平均网络大小（每个网络的平均分支数）、中位网络大小（每个网络分支数的中位值）、网络大小标准差（每个网络分支数的标准差），以及线粒体足迹（背景分离后的总信号面积）。在本实验方案中，选择线粒体足迹作为代表性参数。
本研究的目的是提供一份详细的线粒体形态学分析分步实验方案，重点关注关键操作细节。我们采用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞来演示该方案。MPP+可抑制多巴胺能神经元中线粒体呼吸链复合物I的活性，导致线粒体形态和功能受损8,17。本研究所述的形态学分析方案能够获取高分辨率图像，并评估相关参数，以界定线粒体网络的形态学特征。
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方案
1. 准备
- 用二甲基亚砜（DMSO）溶解MPP+，配制成1 mM的储存液，并在避光条件下于-30 °C保存（参见材料表）。
- 将50 µg的MitoTracker（MitoTracker Red CMXRos）溶于94 µL的DMSO中，配制成1 mM的储存液。将该储存液分装至多个微量离心管中，避光保存于-30 °C，待后续使用。
- 在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12培养基中，于37 °C、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养SH-SY5Y细胞。传代时，用0.05%胰蛋白酶溶液消化细胞1分钟，然后以100 × g离心3分钟。
2. MPP+ 刺激
- 将SH-SY5Y细胞接种于带玻璃底的共聚焦培养皿中，加入含1% (v/v) 胎牛血清的DMEM/F12培养基，于37°C培养过夜。
- 更换新鲜培养基，随后在有或无MPP+的条件下孵育细胞24小时。
3. 线粒体染色（MitoTracker染色）
- 预热 DMEM/F12，然后用 DMEM/F12 稀释 MitoTracker 储存液，配制成 50 nM 的工作液。整个操作过程中需避光保存。
- 移除细胞培养基，用新鲜的 DMEM/F12 将共聚焦培养皿清洗 2 次。
- 每皿中加入 1 mL MitoTracker 工作液，在 37 °C 避光条件下孵育 15 分钟。
- 移除 MitoTracker 工作液，并用 DMEM/F12 清洗 2 次。
- 每皿中加入 1 mL DMEM/F12，成像前置于细胞培养箱中孵育。
共聚焦显微镜的成像参数
- 为后续操作预先平衡显微镜。在采集面板中，通过设置激发和发射波长来调整与光路相关的参数。
- 将参数设置如下：针孔大小，1.2 AU；像素扫描尺寸，1,024 × 1,024；像素驻留时间，2.4 µs（平均 2 次） （为校准目的保持一致）。
5. 优化成像参数
警告：避免眼睛暴露于可见和/或不可见激光的直接辐射和散射辐射中。
- 使用卤素灯通过平场复消色差60倍物镜（1.4 NA）对细胞进行聚焦，以避免光毒性。
- 将激光功率和高压（HV）调节至接近但略低于饱和水平，将缩放系数设为3，然后采集图像。
- 移动感兴趣区域并重新对细胞聚焦，在不改变任何设置的情况下采集图像。
6. 数据分析
注意：数据使用预装了 MiNA 插件13的 ImageJ 进行分析。为获得准确的相关测量结果，图像应清晰显示独立分布的线粒体，并具有干净且明亮的染色效果。
- 在进行二值化转换和骨架化之前，为提高图像质量，请打开图像并进行初步处理。使用ROI工具选择单个细胞的区域。应用Process | Filters | Unsharp Mask功能以增强图像锐度，并使用Process | Enhance Contrast功能以减少噪声的过度放大。为专门去除椒盐噪声，请使用Process | Filters | Median功能（参见补充图S1）。
- 为构建简化的形态学模型以计算描述性参数，通过阈值化将图像转换为二值图像（点击Process | Binary | Make Binary），然后使用Skeletonize功能对二值图像进行骨架化（点击Process | Binary | Skeletonize）（参见补充图S2）。
- 使用Analyze | Skeleton | Analyze Skeleton (2D/3D)功能对骨架中的所有像素进行分组。通过使用MiNA工具计算骨架化图像中的九个描述性参数，以简化分析过程（参见补充图S3）。
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结果
本方案通过三个相互关联的优化模块，详细阐述了线粒体形态学分析的逐步操作流程：样本制备方案的标准化、共聚焦显微镜成像光学参数的系统性优化，以及计算图像处理指南。优化的样本制备方案对于获得可靠的线粒体成像数据至关重要。对MitoTracker Red CMXRos浓度的系统性评估显示其荧光特性具有浓度依赖性。25 nM处理组的荧光信号显著弱于较高浓度组（图1A）。值得注意的是，尽管50 nM与100 nM处理组在标记效率上未观察到显著差异，但200 nM处理组表现出两个关键局限性：光敏感性增加，需降低激光照射阈值；以及明显的细胞质背景染色。
此外，还评估了 PBS 和培养基对背景荧光信号的影响。结果表明，充分的 PBS 洗涤结合 PBS 填充成像可有效降低培养基的自发荧光。然而，该方法与线粒体结构随时间推移而发生降解相关，在使用 MitoTracker 染色后 1 小时即可观察到明显的形态学改变（图 1B）。相反，DMEM/F12 培养基中线粒体形态得以显著保留，但其...
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讨论
本研究建立了一种在应激条件下分析活细胞线粒体形态的系统性方法。线粒体成像的关键实验步骤包括：使用适当浓度的MitoTracker探针，成像前充分清洗共聚焦培养皿，尽量减少对细胞状态的干扰，以及设置合适的成像参数。
使用较高浓度的 MitoTracker 可能会引发细胞毒性，使线粒体对激光功率敏感，并可能导致染料非特异性地染色其他细胞结构(图1A)。根据这些结果，50 nM 被确定为最佳浓度，可在强信号强度与最小光毒性效应之间取得平衡。类似地，MitoTracker 在其他细胞类型中的实验浓度和孵育时间也应进行优化。通常，MitoTracker 的工作浓度范围为 25 nM 至 200 nM，孵育时间为 10 至 30 分钟9,10。
在成像前，必须彻底清洗含有 MitoTracker ...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（81974501）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物 (MPP+) | Macklin | M875357 | 用于诱导氧化应激 |
| 共聚焦培养皿 | NEST | 801001 | 用于细胞培养 |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | C2 | 用于采集图像 |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | 用于为细胞提供营养 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Beyotime | ST038 | 用于溶解 MitoTracker 探针 |
| 胎牛血清 (FBS) | ThermoFisher Scientific | A3161001C | 用于为细胞提供营养 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | ImageJ | 用于分析线粒体形态 |
| MitoTracker Red CMXRos | ThermoFisher Scientific | M7512 | 用于可视化线粒体 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | ThermoFisher Scientific | C10010500BT | 用于清洗共聚焦培养皿上的细胞 |
| SH-SY5Y 细胞 | ATCC | CRL-2266 | 用于演示分析线粒体形态的工作流程 |
| TI-SH-U 载物台适配器 | Nikon | MEC59110 | 用于固定样本 |
参考文献
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重印与许可
