使用共聚焦显微镜测定活细胞中的线粒体形态

摘要

在这项研究中，我们描述了一个循序渐进的方案，并强调了确定活细胞中线粒体形态学特征的关键细节，包括样品制备、图像采集和数据分析。这种方法通常用于检查线粒体形态以研究各种情况。

摘要

线粒体融合和裂变的动态平衡直接导致线粒体稳态，除了三磷酸腺苷 （ATP） 稳态外，线粒体稳态还影响许多细胞功能。因此，在压力条件下评估线粒体形态对于机制研究至关重要。本研究描述了分析线粒体形态的详细方案，包括 MitoTracker 溶液的制备、线粒体染色、成像参数的优化和形态学特征的检测。MitoTrackers 是常用的、经济高效的线粒体特异性染料。然而，由于处理不当，线粒体形态可能会发生一些变化，这可能是难以察觉的，并且无法反映线粒体的真实状态。因此，有必要了解如何使用 MitoTrackers 分析线粒体形态的变化。该方案利用用 1-甲基-4-苯基吡啶碘化物 （MPP⁺） 刺激的 SH-SY5Y 细胞来说明线粒体形态学分析的方案。与对照细胞相比，MPP ⁺ 刺激的细胞表现出更小和更碎片化的线粒体，形态参数表明线粒体足迹减少。这些结果表明，MitoTracker 染色是一种有效且可行的线粒体形态分析方法，（稍作修改）可用于研究各种条件。

引言

线粒体形态由线粒体融合和裂变的动态平衡维持，因此影响能量稳态和许多其他细胞功能，导致各种病理，如神经退行性疾病、癌症和炎症 1,2,3,4,5 .为了观察线粒体形态，已经开发了几种线粒体选择性染色剂，包括探针和抗体，用于共聚焦显微镜。一些线粒体特异性探针，如四甲基玫瑰胺和罗丹明 123，基于线粒体膜电位 （MMP） 发挥作用，这限制了它们在 MMP 破坏条件研究中的适用性 ^6,7。相反，抗体染色提供不依赖 MMP 的形态学评估，用于检查固定细胞中的线粒体形态。尽管合适的染色剂可以评估固定细胞中的线粒体形态，但检查受某些诱导剂损害的活细胞中的线粒体形态仍然具有挑战性。MitoTracker 是一种细胞渗透性阳离子和线粒体特异性荧光探针，为这一挑战提供了解决方案，允许对活细胞和固定细胞进行染色。该探针已广泛用于检查各种疾病研究中的线粒体形态 ^8,9,10,11<....

方案

1. 准备工作

1. 用二甲基亚砜 （DMSO） 溶解 MPP ⁺ 制成 1 mM 储备溶液，并将其在 -30 °C 避光下储存（参见 材料表）。
2. 将 50 μg MitoTracker （MitoTracker Red CMXRos） 溶解在 94 μL DMSO 中，制成 1 mM 储备液。将储备溶液分装到几个微量离心管中，并在-30°C避光保存直至进一步使用。
3. 在 37 °C 下，将 SH-SY5Y 细胞与补充有 10% （v/v） 胎牛血清 （FBS） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/营养混合物 F-12 培养基在培养瓶中孵育。 对于传代，用 0.05% 胰蛋白酶溶液分离细胞 1 分钟，然后以 100 × g 离心 3 分钟。

^{2. MPP+} 刺激

1. 将 SH-SY5Y 细胞接种在玻璃底的共聚焦培养皿上，并在补充有 1% （v/v） FBS 的 DMEM/F12 培养基中维持过夜。
2. 更换培养基，然后将含或不含 MPP ⁺ 的细胞孵育 24 小时。

....

结果

该协议通过三个相互依赖的优化模块概述了线粒体形态学分析的详细分步程序：标本制备方案的标准化、共聚焦显微镜成像光学参数的系统优化以及计算图像处理指南。最佳样品制备方案对于获得可靠的线粒体成像数据至关重要。MitoTracker Red CMXRos 浓度的系统评估表明荧光特性呈浓度依赖性。与较高浓度相比，25 nM 处理导致荧光信号明显较弱（图 1A）。值得注意的是，虽然在 50 nM 和 100 nM 处理之间没有观察到标记效率的显着差异，但 200 nM 条件表现出两个关键限制：光敏性增加，需要较低的激光照射阈值，以及大量的细胞质背景染色。

此外，还评估了 PBS 和培养基对背景荧光信号的影响。结果表明，严格的 PBS 洗涤与充满 PBS 的成像相结合，可有效减少培养基的自发荧光。然而，这种方法与线粒体结构的时间依赖性降解有关，使用 MitoTracker 染色后 1 小时观察到明显的形态变化（图 1B）。相反，线粒体形态在 DMEM/F12 培养基中显著保留，.......

讨论

本研究建立了一种在胁迫条件下分析活细胞线粒体形态的系统方法。线粒体成像的关键程序步骤包括：适当浓度的 MitoTracker 探针，在图像采集前彻底清洗共聚焦培养皿，最大限度地减少对细胞状态的干扰，并设置合适的成像参数。

使用较高浓度的 MitoTracker 会诱导细胞毒性，使线粒体对激光功率敏感，并可能导致染料染色其他细胞结构（图 1A）。基于这些发现，确定 50 nM 为最佳浓度，平衡了强信号强度和最小的光毒性效应。同样，应确定其他细胞类型的 MitoTrackers 的实验浓度和孵育时间。通常，MitoTrackers 的工作浓度范围为 25 nM 至 200 nM，孵育时间范围为 10 至 30 分钟 ^9,10。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-甲基-4-苯基吡啶碘化物 （MPP+）	麦克林	M875357	用于诱导氧化应激
共聚焦盘	巢	801001	用于培养细胞
共聚焦显微镜	尼康	C2	用于捕获图像
Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/营养混合物 F-12	赛默飞世尔科技	11320033	用于为细胞提供营养
二甲基亚砜 （DMSO）	碧奥泰姆	ST038	用于溶解丝裂追踪探针
胎牛血清 （FBS）	赛默飞世尔科技	A3161001C	用于为细胞提供营养
图像J	美国国立卫生研究院	图像J	用于分析线粒体形态
MitoTracker 红色 CMXRos	赛默飞世尔科技	型号M7512	用于可视化线粒体
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	赛默飞世尔科技	C10010500BT	用于清洗共聚焦培养皿上的细胞
SH-SY5Y电池	ATCC	CRL-2266型	用于演示分析线粒体形态的工作流程
TI-SH-U 载物台适配器	尼康	MEC59110	用于固定标本