小胶质细胞线粒体提取用于糖链分析

摘要

建立了一种从小胶质细胞中制备纯化线粒体、分离线粒体蛋白以释放N-聚糖，并利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离联用高分辨准确质量分析仪质谱技术快速检测亚细胞线粒体聚糖的实验方案。

摘要

了解小胶质细胞中线粒体蛋白的糖基化模式，对于确定其在神经退行性疾病中的作用至关重要。本文介绍了一种新颖且高通量的方法，用于分析培养的小胶质细胞中分离出的线粒体蛋白的糖组。该方法包括从小胶质细胞培养物中分离线粒体、对线粒体样本进行质量评估，随后采用优化的蛋白质提取方法以最大化糖链的检测，并利用红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）高分辨率精确质量（HRAM）质谱技术，提供线粒体糖基化的详细图谱。

本方案强调在分离过程中维持线粒体完整性的关键性，并采用严格的质控措施以确保可重复性，包括在提取后测定线粒体纯度。该方法可实现对小胶质细胞线粒体在不同实验条件下糖基化变化的全面分析 体外，这有助于深入了解与神经退行性疾病相关的线粒体变化。该方法也可适用于其他领域 体外 处理、其他培养的细胞类型或原代细胞。通过这一标准化方法，我们旨在增进对小胶质细胞线粒体聚糖的理解，从而推动神经退行性病变研究领域的整体发展。

引言

小胶质细胞是大脑中主要的常驻固有免疫细胞，在成年大脑细胞中占10-15%^1,2。它们通过其受体谱动态监测大脑微环境，并调节正常的大脑功能以维持大脑稳态³。小胶质细胞对其微环境的变化极为敏感，在病理状态或不同刺激下，其细胞形态、免疫表型和功能均会发生改变。小胶质细胞的活化状态受到其功能所需细胞能量需求的影响，例如吞噬作用、细胞因子产生或组织修复。因此，细胞能量代谢在调控小胶质细胞功能变化中起着关键作用⁴。小胶质细胞功能失调会导致促炎性细胞因子（如IL-1β、TNF-α）和活性氧（ROS）的过度释放，使大脑易于发生神经炎症^5,6。长期的小胶质细胞功能失调及其引发的神经炎症环境为神经退行性病变奠定了基础⁷。

大脑仅占体重的2%，却消耗了人体总能量的20%。线粒体是脑细胞能量的主要来源，在急性和慢性脑部疾病的发生机制中起着关键作用⁸。既往研究已证实，小胶质细胞活化与衰老⁹以及阿尔茨海默病等年龄相关疾病^10,11中的代谢功能障碍存在显著相关性，凸显了线粒体在细胞衰老和神经退行性变中的核心作用。线粒体功能受损会导致衰老及年龄相关疾病过程中能量生成减少、氧化应激升高以及神经炎症加剧。

尽管已有大量研究阐明了线粒体在能量代谢、衰老和脑部疾病中的作用，但常见的翻译后修饰（如糖基化）在线粒体生物学及功能中的作用仍缺乏充分探索。糖基化是由糖基化酶催化的、将称为聚糖的糖基团共价连接到蛋白质上的酶促反应，是包括小胶质细胞在内的大多数脑细胞中最常见的翻译后修饰。在炎症刺激下，活化的小胶质细胞通过调控细胞内或细胞表面聚糖的表达来调节其免疫功能¹²。小胶质细胞在受到刺激后所表现出的促炎和抗炎反应也受到聚糖的调控¹³。线粒体蛋白同样存在这些聚糖修饰，这些修饰可调控其功能与亚细胞定位。然而，由于研究亚细胞水平糖基化的技术难题，目前仍缺乏对小胶质细胞中细胞特异性线粒体糖基化模式的深入分析。尽管糖基化在调控小胶质细胞表型方面的作用已被广泛研究，但聚糖在调控小胶质细胞线粒体功能以及继而影响其细胞免疫表型方面的角色仍知之甚少。

目前针对线粒体蛋白质糖基化的研究较少，且主要集中于基于凝集素的糖基化模式鉴定。凝集素是一类可结合生物分子中糖链部分的糖结合蛋白^14,15，但其缺乏特异性，且无法提供有关糖链组成的详细信息。质谱分析技术能够对糖链组成进行精确鉴定，从而克服凝集素分析所带来的分析挑战。其中一种技术——红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）——采用混合电离策略，利用中红外激光共振激发生物样本中的水分子¹⁶，使中性分子解吸，并将其引入正交的电喷雾羽流中，随后由高分辨率精确质量Orbitrap质谱仪进行分析。IR-MALDESI此前已成功用于组织代谢物的直接分析¹⁷，具有分析速度快¹⁸、电离方式温和，以及可根据氯化糖链加合物的同位素分布模式预测N-连接糖链中唾液酸含量等显著优势¹⁹。然而，该平台尚未见用于亚细胞器糖链直接分析的报道。

本文报道了一种从小胶质细胞中高通量分离线粒体、分离线粒体 N-糖链，并利用红外基质辅助激光解吸电离质谱（IR-MALDESI）进行线粒体 N-糖链检测与分析的实验方案。该方案将为揭示糖基化在线粒体功能中的作用提供基础，有望发现神经炎症和神经退行性疾病新的治疗靶点。

方案

1. BV2 小胶质细胞系培养

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素（PenStrep）和1%非必需氨基酸（NEAA）的DMEM低糖培养基中培养BV-2细胞（源自C57BL/6小鼠的小胶质细胞）。
2. 将细胞在T-175培养瓶中培养，使其贴壁生长至70–80%融合度。
3. 通过在37 °C、5% CO₂条件下用细胞解离酶孵育5分钟，随后加入等体积的细胞培养基以终止酶反应，并在室温（RT）下以500 × g离心5分钟，对细胞进行传代处理。
   注意：此处使用的细胞解离酶比胰蛋白酶更温和，有助于保护BV2细胞表面抗原的表达。
4. 吸除培养基，将细胞沉淀重悬于1 mL生长培养基中，并使用台盼蓝（见材料表）对细胞进行计数。
   注意：本步骤中我们使用了自动细胞计数仪进行细胞计数。
5. 若细胞沉淀中含有2 × 10⁷（2000万个细胞/沉淀），则可继续进行线粒体分离操作。

2. 小胶质细胞线粒体的分离

注意：操作需迅速，并在整个过程中将所有物品保持在冰上。用于线粒体分离的线粒体分离试剂盒包含三种组分：试剂A（细胞裂解缓冲液）、试剂B（稳定缓冲液）和试剂C（线粒体洗涤缓冲液）。在使用前立即向试剂A和试剂C中加入蛋白酶抑制剂。

1. 将收获的细胞在2.0 mL微量离心管中以500 × g 离心5分钟，沉淀2 × 10⁷个细胞。小心吸除并弃去上清液。
2. 加入800 µL线粒体分离试剂A（细胞裂解缓冲液），中等速度涡旋振荡5秒，将离心管精确置于冰上孵育2分钟。
   注意：孵育时间不得超过2分钟。
3. 加入10 µL线粒体分离试剂B（稳定缓冲液），最大速度涡旋振荡5秒，将离心管置于冰上孵育5分钟，每隔1分钟在最大速度下涡旋一次。
4. 加入800 µL线粒体分离试剂C（线粒体洗涤缓冲液），反复倒置离心管数次以混匀，然后在4 °C下以700 × g 离心10分钟。
   注意：请勿涡旋振荡。
5. 将上清液转移至新的2.0 mL离心管中，在4 °C下以3,000 × g 离心15分钟。
6. 将上清液（胞质组分）转移至新离心管中。沉淀物即为分离得到的线粒体。
7. 向沉淀物中加入500 µL线粒体分离试剂C，在12,000 × g 下离心5分钟。
8. 将所得沉淀用于蛋白质定量与后续处理，或于-80 °C保存以备后续使用。

3. 使用微BCA法进行蛋白质定量

注意：本方案的蛋白质定量可使用不同的试剂和检测方法进行。可通过将胞质或线粒体蛋白的测定值归一化至检测中所用的总蛋白浓度，实现对这些蛋白的定量。

1. 配制浓度为 0 µg/mL 至 200 µg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）标准品（0 µg/mL、0.5 µg/mL、1 µg/mL、2.5 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL、200 µg/mL），并设置仅含裂解缓冲液的空白对照。
2. 将每种标准品各 150 µL 加入含有样品的平底 96 孔板中。
3. 按 25 份试剂 MA（二辛可宁酸（BCA）溶液）与 24 份试剂 MB（硫酸铜溶液）和 1 份试剂 MC（稳定缓冲液）的比例（25:24:1，试剂 MA:MB:MC）混合，配制成工作液。向每个样品和标准品孔中加入 150 µL 混合后的 BCA 试剂。
4. 在 37 °C 下孵育 2 小时。
5. 使用酶标仪在 562 nm 处测定吸光度，并根据标准曲线定量蛋白质浓度。从所有其他标准品及未知样品重复孔的吸光度值中减去空白对照的吸光度，以获得样品的蛋白质浓度。

4. 线粒体提取物的质量控制（蛋白质印迹）

1. 用放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）重悬线粒体沉淀，以进行蛋白质定量。使用微定量BCA法测定每个样品的蛋白质浓度。
2. 在样品缓冲液中于94 ^oC变性样品5分钟。
3. 将等量（20 µg）的线粒体蛋白与分子量标记物一起上样至预制胶中（见材料表）。
4. 在100 V电压下电泳50分钟。
   注意：电泳时间可能有所不同，因此当蛋白质迁移至样品缓冲液染料指示的凝胶末端时，应立即停止电泳。
5. 使用Western blot转膜系统中的干转法，在20 V电压下将蛋白质从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续7分钟。
6. 取出膜后，用封闭液（表1）在室温下封闭1小时。
7. 在封闭缓冲液中加入适当稀释的一抗，4 ^oC孵育过夜（COXIV = 1:3,000，GAPDH = 1:3,000）。
   注意：可通过在Western blot中使用其他标志物（如lamin（核标志物）和ERp57（内质网标志物））检测线粒体制备物中是否存在核或内质网（ER）污染。
8. 用洗涤缓冲液（表1）洗涤膜3次，每次15分钟。
9. 在封闭缓冲液中加入适当稀释的HRP标记的二抗，室温孵育1小时。
10. 用洗涤缓冲液洗涤膜3次，每次15分钟。
11. 显影时使用化学发光底物试剂盒。
12. 使用凝胶和膜成像仪扫描膜。

5. 小胶质细胞中用于 N -糖链提取的线粒体蛋白分离

1. 将分离的线粒体重悬于 50 µL 蛋白质提取缓冲液（表 1）中，冰上孵育 20 分钟。
2. 吹打三次，冰上静置 20 分钟（使用前涡旋振荡）。若线粒体沉淀未完全溶解，可再加入 50 µL 提取缓冲液，并合并至同一离心管中。
3. 在 13,000 × g 条件下离心 10 分钟。
4. 收集上清液，于 -80 ^oC 冻存至少 1 小时，随后在真空浓缩仪中尽可能干燥。
5. 在进行 IR-MALDESI 分析前，使用 PNGase 消化缓冲液（表 1）重悬样品以进行糖链分离。

6. 用于红外基质辅助激光解吸电喷雾电离质谱的线粒体 N-聚糖制备

1. 将25–250 µg的分离线粒体蛋白（最大体积为250 µL）上样至10 kDa分子量截留值（MWCO）滤膜上。
2. 向滤膜中的每个样品加入2 µL的1 M二硫苏糖醇（DTT），以还原蛋白并暴露糖链部分。
3. 用200 µL PNGase消化缓冲液稀释样品，并轻轻涡旋混匀，避免扰动滤膜。
4. 将样品在56 °C孵育30分钟，以变性线粒体蛋白。
5. 加入50 µL的1 M碘乙酰胺对线粒体蛋白进行烷基化，使终浓度约为200 mM，并在37 °C孵育60分钟。
6. 为进一步浓缩变性后的线粒体蛋白，将样品在14,000 × g离心40分钟，弃去滤过液。
7. 用100 µL PNGase消化缓冲液洗涤样品。
8. 在14,000 × g下离心20分钟，将糖蛋白浓缩于滤膜上，弃去滤过液。重复洗涤和浓缩步骤2次，共进行3次，最终得到体积约为5 µL的浓缩液。所有滤过液均需弃去。
9. 完成洗涤后，弃去收集管。后续所有洗脱液和洗涤步骤均使用新的收集管。
10. 为从变性线粒体糖蛋白上切割糖链，将滤膜转移至新的收集管，向滤膜中加入2 µL无甘油PNGase（75,000单位/mL），再加入98 µL PNGase消化缓冲液，使总体积达到100 µL，并通过在滤膜上轻轻吹打混匀。
11. 在37 °C孵育样品18小时，以酶解方式完全切断线粒体蛋白上的所有N-糖链。
12. 在20 °C、14,000 × g条件下离心20分钟，将释放的线粒体N-糖链洗脱至收集管中。
13. 向滤膜中加入100 µL PNGase消化缓冲液，洗涤线粒体糖链，并在20 °C、14,000 × g条件下离心20分钟。将含有残留N-糖链的洗涤液收集至与洗脱液相同的收集管中。重复此步骤2次，然后将滤膜从收集管中移除。
14. 将含有线粒体糖链的样品置于-80 °C冰箱中冷冻至完全冻结（30–60分钟），随后在真空浓缩仪中室温下彻底干燥（400 µL样品需4–6小时）。
    注意：N-糖链可在分析前于-20 °C保存最多6个月。
15. 在进行IR-MALDESI分析前，将干燥的N-连接糖链直接重悬于50 µL液相色谱/质谱级水中。

7. 通过红外基质辅助激光解吸电离质谱法检测释放的糖链

1. 每次实验当天均需进行质谱校准。将校准溶液加载至注射泵中，并以1.2 µL/min的流速注入。施加3.5 kV电压，以在正负两种模式下均获得稳定的电喷雾喷流，用于质谱校准。
2. 用移液器将5 µL重悬的线粒体糖链加样至聚四氟乙烯微孔载玻片的样品位点上。
3. 使用波长为2.97 µm的中红外激光进行解吸，每束激光能量为1.8 mJ。
4. 在负离子化模式下电离并检测 N-糖链。采用含60%乙腈和1 mM乙酸的电喷雾溶剂，以2 µL/min的流速在3.2 kV电压下形成稳定的电喷雾喷流。
5. 进行分析时，将红外基质辅助激光解吸电喷雾电离（IR-MALDESI）与高分辨精确质量（HRAM）质谱仪联用，设定在m/z 200处的质量分辨率为240,000_FWHM，在负离子模式下扫描500至2,000 m/z范围。
6. 关闭自动增益控制（AGC），设定固定的90 ms注入时间。使用EasyIC离子源对每个谱图进行实时内标校准，以实现高精度质荷比测量（MMA）。

8. 线粒体 N- 糖链数据分析

1. 通过搜索单同位素质量并利用 m/z 间距确认同位素分布，手动鉴定 N-连接聚糖，以确定电荷态为双重和三重、且离子通量阈值不低于 1,000 离子/秒的离子。
2. 将原始质谱数据中的 m/z 比值转换为中性单同位素质量。
3. 将单同位素质量上传至在线寡糖结构预测工具，以确定可能的聚糖组成。使用经过实验验证的糖组学数据库²⁰确认注释结果；确保每个鉴定结果的质谱质量偏差在 2.5 ppm 以内，包含核心 N-连接聚糖结构（Hex₃HexNAc₂），并排除戊糖、KDN 或己烯糖醛酸（HexA）单糖。
4. 使用 SNFG 命名法绘制已确认的聚糖结构²¹。
5. 从原始质谱数据中获取聚糖的相对丰度，并以线粒体蛋白含量（µg）进行归一化，得到离子数/(秒·微克)（ions/s/µg）。
6. 采用卡方分析检验 N-连接聚糖理论分布与实验分布的拟合优度，以确定氯加合物的数量，从而直接推算唾液酸的数量¹⁹。

结果

图1 展示了从小胶质细胞BV2细胞系中分离线粒体用于质谱糖链分析的步骤示意图。图2 显示了在相同起始密度的小胶质细胞中进行多次线粒体分离时，线粒体蛋白分离的可重复性，微BCA法测定的线粒体蛋白浓度之间无显著差异。

图3 展示了通过COX IV和GAPDH的蛋白质印迹分析所评估的线粒体分离纯度。在此，我们观察到在线粒体分离最终步骤中获得的线粒体组分中存在线粒体蛋白COX IV的表达。免疫印迹结果显示，在分离的线粒体组分中出现明显的COX IV条带，而在相同曝光条件下，GAPDH仅在细胞质组分中被检测到。延长曝光时间可能导致检测到微弱的GAPDH条带。在分离线粒体后的全细胞裂解液中可明显观察到非线粒体标志物GAPDH的表达，而无CoxIV条带，表明线粒体组分已被完全分离且非线粒体污染极少。在线粒体组分中，COX IV的表达在不同批次之间具有一致性，前提是起始细胞密度相似，均为2 × 10⁷

讨论

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，糖基修饰可调节小胶质细胞的免疫表型和功能。这些免疫功能需要大量的细胞能量，而能量主要由线粒体提供。值得注意的是，线粒体蛋白也存在糖基修饰，但由于研究亚细胞水平糖基化的技术难题，这类修饰至今仍被严重忽视。目前大多数关于线粒体糖基化的研究依赖于凝集素法鉴定糖链模式²²，但该方法受限于凝集素结合特异性较差的问题。本研究所提出技术方法的关键进展包括：i）从小胶质细胞中可重复地分离线粒体N-糖链；ii）利用红外基质辅助激光解吸电离高分辨质谱（IR-MALDESI HRAM）对线粒体N-糖链进行检测与鉴定。本文所述的工作流程首次报道了从小胶质细胞中生理表达水平的线粒体糖蛋白上释放的N-糖链的检测结果。

在本实验方案中，通过使用基于试剂的分离方法，可最大化线粒体的分离效率。该方法可与Dounce匀浆法结合使用，以提高线粒体的得率。与基于试剂的分离方法相比，使用匀浆器的一个缺点是不同操作者在研杵施加的力度和速度上存在差异，从而导致实验变异性增加、可重复性降低。先前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
Amersham 600 成像仪	Cytvia	29194217	凝胶与膜成像仪
Countess 3 自动细胞计数仪	Fisher Scientific	X003SZ1LY9
干浴器 标准型 4 孔 100-120V	赛默飞世尔科技	88870003
i-Blot2 凝胶转印装置	Invitrogen	IB21001	Western blot 转膜系统
倒置显微镜	细胞处理	04355223EA
酶标仪		82050-760
小型凝胶电泳槽	Invitrogen	A25977
开放式空气摇床	Fisher Brand	88861025
移液辅助器	BioTek	229310
涡旋混合器	Integra- VWR
<强>线粒体分离试剂
线粒体分离试剂盒	赛默飞世尔科技	89874
磷酸酶抑制剂	赛默飞世尔科技	1861274
蛋白酶抑制剂	赛默飞世尔科技	1861281
<强>N-聚糖分离与IR-MALDESI试剂
乙酸	Fisher Scientific	A11350	ESI溶剂中50%
乙腈	Sigma Aldrich	34851-4L	1 mM ESI溶剂
碳酸氢铵	Fisher Scientific	A643500	100 mM
校准溶液	赛默飞世尔科技	A39239	Pierce FlexMix
二硫苏糖醇	Sigma Aldrich	AC426380100	1 M
碘乙酰胺	Sigma Aldrich	A322-10VL
LC/MS级水	赛默飞世尔科技	047146.M6
PNGase F	Bulldog Bio	NZPP010	75000 U/mL，用于N-糖链释放的酶
<强>N-糖链分离与红外基质辅助激光解吸电离二次离子质谱消耗品
Amicon 离心滤器	Fisher Scientific	UFC501024	10 kDa 分子量截留值
质谱仪	Orbitrap Exploris 240
中红外激光器	JGM 联合公司，美国马萨诸塞州伯灵顿
聚四氟乙烯微孔玻片	Prosolia，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国
<强>N-糖链分析软件
GlycoMod	Expasy		https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnect	Expasy		https://glyconnect.expasy.org/
<强>蛋白质分离与蛋白质印迹耗材
Basix加样枪头（10 µL	Basix	13-611-102
Basix 加样枪头（200） µL	Basix	13-611-116
细胞刮刀	VWR 实验室	14-388-100
i-Blot NC 常规叠层	Invitrogen	IB23001
i-Blot2 PVDF 常规堆叠膜	Invitrogen	IB24001
10  µL 微量移液器	Fisher Scientific	FBE00010
20 µL 微量移液器	Invitrogen	FBE00020
200  µL 微量移液器	Fisher Brand	FBE00200
1000 µL 微量移液器	Fisher 品牌	FBE01000
10  µL型移液器吸头	VWR 实验室	76322-528
20  µL型移液管吸头	VWR 实验室	76322-134
200  µL型移液器吸头	VWR 实验室	76322-150
1000  µL型移液器吸头	VWR 实验室	76322-154
培养板	Fisher 品牌	14-388-100
<强>蛋白质分离与蛋白质印迹试剂
肌动蛋白抗体（宿主：兔）	细胞信号传导技术	8457T
抗兔 IgG HRP 偶联	细胞信号传导技术	7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus	Invitrogen	NW04120BOX
牛血清白蛋白	Fisher 生物试剂	BP9700-100
COXIV 抗体（宿主：兔）	细胞信号传导技术	4844S
GAPDH 抗体（宿主：兔）	细胞信号传导技术	2118S
MicroBCA 蛋白检测试剂盒	赛默飞世尔科技	23235
Nupage MOPS SDS 电泳缓冲液 [20x]	赛默飞世尔科技	NP0001
PAGE Ruler 预染蛋白质标准品	赛默飞世尔科技	815-968-0747	稀释= 使用 7  µL 加样至第一孔
磷酸盐缓冲液	Aniara Diagnostics	A12-9423-5	从10x粉末配制1x PBS
Pierce ECL Western Blotting Substrate	赛默飞世尔科技	32106	化学发光底物试剂盒
RIPA缓冲液	赛默飞世尔科技	89901
样品缓冲液	Novex	B0007	样品与LDS上样缓冲液按3:1的比例配制bolt LDS上样缓冲液
Tween-20	MP Biomedicals	TWEEN201
<强>组织培养耗材
Countess 载玻片	Avantor	229411
Eppendorf管	细胞处理	414004-265612-5884
2 mL 吸液移液管	Vista 实验室	5090-0010E
5 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-11D
10 mL 血清移液管	Basix	13-678-11E
25 mL 血清移液管	Vista 实验室	FB012937
50 mL 血清移液管	Vista 实验室	14955233
15 mL 圆底离心管	Avantor	229225A
50 mL 离心管	细胞处理	4190-0050
T-75 cm²2 组织培养瓶	Fisher Scientific	FB012937
T-180 厘米2 组织培养瓶	Fisher Scientific	FB012939
<强>组织培养试剂
BV2 小胶质细胞系	Creative Bioarray	CSC-I2227Z	源自C57/BL6新生小鼠小胶质细胞的永生化小鼠小胶质细胞（BV2）
细胞解离酶	赛默飞世尔科技	12563029	TrypLE
低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Gibco	10567014
胎牛血清	Cytiva	SH30071.03HI
最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸	Gibco	11140050
青霉素 链霉素	Cytivia	SV30010
磷酸盐缓冲液	康宁	21-040-CV
0.4% 台盼蓝染色液	Invitrogen	T10282