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方法文章

经验证的免疫化学检测法用于全面测定细胞释放及细胞结合的人表皮生长因子受体2

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DOI：

10.3791/68204

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2025年5月9日

 ,  ,  , 
1SDS Optic S.A.

本文内容

摘要

我们介绍一种经过验证的夹心ELISA检测方法，该方法使用新型抗HER2单克隆抗体，可实现对细胞结合型及释放型HER2蛋白的精确定量 体外 培养的细胞及其他样本，包括血液和组织。

摘要

人表皮生长因子受体2（HER2）是一种公认的癌症标志物。它已成为一种非常成功的诊断和治疗靶点，尤其在乳腺癌及其他表达HER2的癌症类型中。在临床实践中，采用特异性抗HER2抗体的免疫组织化学方法是检测膜结合型受体表达水平的金标准。由过表达细胞释放的HER2可溶性胞外结构域（ECD）可在血液中循环，并反映组织中该受体的表达情况。因此，亟需准确且经过验证的检测方法，以将循环HER2蛋白的浓度与疾病的临床表现相关联。

我们的团队已开发并验证了一种新型夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA），用于定量检测细胞膜结合型及自细胞释放的HER2胞外结构域（ECD）. 该检测使用两种先前开发的针对HER2的特异性单克隆抗体。定量范围涵盖1.56–100 ng/mL的HER2浓度，该浓度范围符合培养癌细胞中的预期水平 体外和 检测灵敏度可达0.5 ng/mL。该方法良好的批内和批间精密度及准确性使其适用于多种生物样本中的HER2定量，包括细胞培养上清、血清和实体肿瘤组织。本文重点介绍受体相关及分泌型的全面测定 体外 培养的癌细胞。该论文提供了一种定量HER2蛋白的逐步实验方案，可用于多种细胞系、血液和组织样本的检测。

引言

现代治疗的成功往往与精准医疗相关，而精准医疗依赖于准确识别对治疗敏感的患者1。其中一类治疗方法是靶向多种肿瘤（包括乳腺、子宫内膜、胃、肺及其他组织）中过表达受体的抗HER2药物。目前已有多种针对HER2的药物，证实对HER2阳性癌症患者（包括HER2低表达型）具有明确疗效2。确认HER2阳性状态对于识别可能产生应答的患者至关重要；然而，这仍然是一个挑战，尤其是在HER2低表达人群中。

临床环境中用于HER2检测的金标准方法包括免疫组织化学（IHC）蛋白表达检测以及通过荧光原位杂交（FISH）技术进行的HER2基因扩增检测。此外，Oncotype DX检测可用于评估HER2 mRNA表达水平。这些方法均需依赖组织活检，导致判断患者是否适合特定治疗及其对疗法可能的反应性存在不确定性。尽管美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家学院（CAP）于2018年更新了指南以减少不同检测单位之间的差异，HER2检测结果的一致性仍有待进一步提高3。

HER2 是表皮生长因子受体（EGFR）家族中的一种原癌基因，其在病理状态下的过表达和活化会导致更具侵袭性的疾病进展或预后不良4。HER2 是一种分子量为 185 kDa 的模块化蛋白，锚定于细胞膜上，包含一个细胞内酪氨酸激酶结构域和一个胞外结构域（ECD）。HER2 的 ECD 可从细胞表面脱落，释放到细胞外基质5，成为无细胞蛋白并进一步在血液中循环。HER2 表达水平的升高可能反映为循环 ECD 水平的升高，因此可作为有价值的预测和预后标志物6,7、治疗反应的替代标志物8，或作为免疫组织化学（IHC）的补充方法，用于识别适合接受抗 HER2 治疗的患者9。然而，目前仍存在挑战，即如何建立肿瘤组织中 HER2 表达水平与血液中受体系统性水平之间的相关性，以赋予其明确的临床意义。

可采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）对释放的HER2胞外区（ECD）进行定量10。夹心ELISA法利用两种特异性抗体，分别结合同一靶抗原上的不同表位，能够准确检测易于获取的血液及其他液体生物样本（即所谓的液体活检）中可溶性蛋白的含量。尽管已有经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的检测方法，但关于HER2 ECD诊断的临床价值以及血液中HER2水平升高的临界值仍存在争议5。尚需采用经过验证的方法和统一公认的阈值开展更多研究，以确认这些检测方法的适用性11。

任何ELISA的关键组分包括捕获抗体（固定在板上，决定检测的特异性和灵敏度）和检测抗体（在加入样品后添加）（图1）。本报告中，我们介绍了一种基于新近开发的抗HER2胞外区（ECD）单克隆抗体（mAb）的ELISA方案，这些抗体已通过亲和柱进行制备和纯化，并经过充分表征，具有独特的序列12。利用这些定制抗体建立的ELISA方法可用于准确定量与细胞膜相关以及释放至培养基中的HER2蛋白，从而全面评估受体状态。该检测方法可用于临床前测试，并支持正在进行的研究。该检测方法的性能已在不同来源的生物样本（包括血清和组织匀浆）上进一步验证12，显示出其在未来研究、诊断以及新型抗HER2治疗开发中的潜在应用价值。

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方案

1. 人类癌细胞的培养

  1. 在含有 4.5 g/L ᴅ-葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM-HG）中培养 MDA-MB-231、SK-BR-3 和 SK-OV-3 细胞系，培养基中添加 2 mM ʟ-谷氨酰胺和 10%（v/v）热灭活胎牛血清（FBS）。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的湿化环境中孵育。
  2. 当细胞培养至约 80% 汇合度时，通过胰酶消化法使细胞脱离，并将其分别收集至 15 mL 圆底离心管中。
  3. 使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞以每毫升培养基 3 × 105 个细胞/孔的密度接种于 12 孔板中。将细胞培养物置于 37 °C、5% CO2 的湿化环境中孵育。
    注意：每个实验时间点需单独接种一孔。后续分析将同时使用培养后的上清液和细胞裂解物。

2. 样品采集与制备

  1. 从24小时培养物中，将每种细胞系一个孔的培养基收集到1.5 mL离心管中。
  2. 在4 °C条件下，以10 000 × g 离心10分钟。将上清液转移至新离心管中，并于-20 °C保存，用于进一步测定分泌的ECD HER2水平。
  3. 用1 mL预冷的PBS洗涤培养板上剩余的细胞，轻柔吸弃PBS并丢弃。
  4. 向每个孔中加入200 µL RIPA裂解缓冲液（含1%蛋白酶抑制剂），孵育5分钟。用细胞刮刀刮取细胞，并通过反复吹打混匀，使裂解液充分均质化。
  5. 将裂解后的细胞收集至新离心管中，缓慢吸入装有针头（G21 / 0.8 mm × 40 mm）的2 mL注射器中。重复抽吸5–10次，以进一步破碎细胞。
  6. 在4 °C条件下，以10 000 × g 离心10分钟。将上清液转移至新离心管中，并于-20 °C保存，用于进一步测定细胞结合型HER2蛋白含量。
  7. 按照上述操作步骤，重复收集培养基和细胞样品，用于后续时间点（48小时和72小时培养）的样品制备。

3. 进行用于 HER2 检测的夹心 ELISA

  1. 配制缓冲液。
    1. 包被缓冲液：将 0.42 g NaHCO3 溶解于 50 mL 蒸馏水中，充分混匀，配制成 0.1 M NaHCO3 溶液。用 3 M NaOH 调节 pH 至 9.6。
    2. 封闭缓冲液：将 0.5 g 印迹级脱脂奶粉加入 10 mL PBS 中，充分混匀，配制成含 5% 脱脂奶粉（NFDM）的 PBS 溶液。
    3. 洗涤缓冲液：将 0.5 mL 0.05% Tween-20 加入 1000 mL PBS 中，混匀（避免产生过多泡沫），配制成含 Tween 20 的磷酸盐缓冲盐水（PBST）。
  2. 对检测抗体进行生物素标记。
    1. 使用市售的生物素标记试剂盒，按照生产商说明书对 50–200 µg 检测用抗 HER2 抗体（克隆号 70.21.73.67）进行生物素标记。
      注：生物素标记过程的可靠性和重复性取决于最终抗体产物的蛋白浓度测定结果以及不同批次产品之间的比较。
  3. 包被酶标板。
    1. 用包被缓冲液将抗 HER2 捕获抗体（克隆号 70.27.58）稀释至 1 µg/mL 浓度。包被一块板需使用 6.5 mL 捕获抗体溶液。
    2. 使用多通道移液器，将 100 µL 捕获抗体溶液（按步骤 3.3.1 配制）加入 96 孔 ELISA 板的每个孔中。
      注：为减少边缘效应带来的变异，应避免使用板的最外周孔（例如 A1、H12）。最外周孔应加入蒸馏水以确保反应条件稳定。
    3. 用封板膜覆盖酶标板。
    4. 在 4 °C 下过夜（O/N）孵育。
    5. 过夜孵育后，将酶标板置于室温（RT），在水平微孔板振荡器上（转速 20–30 rpm，倾斜角 4°–6°）孵育 1 小时。
    6. 使用微孔板洗板机吸去包被液，并用洗涤缓冲液洗涤 3 次（每孔每次 300 µL PBST）。
  4. 封闭酶标板。
    1. 使用多通道移液器，向每个已包被的孔中加入 100 µL 封闭缓冲液（含 5% NFDM 的 PBS），以封闭非特异性结合位点。
    2. 用封板膜覆盖酶标板。
    3. 在 37 °C 湿度箱中孵育 1 小时。
    4. 使用微孔板洗板机吸去封闭液，并用洗涤缓冲液洗涤 3 次（每孔每次 300 µL PBST）。
  5. 制备标准曲线和阳性对照（图 2）。
    1. 通过将 2 µL 的 1 mg/mL 储备液加入 1998 µL PBS 中，配制 HER2 抗原工作标准液，获得 0.001 mg/mL（1000 ng/mL）的 HER2 浓度。
    2. 将工作标准液（WSS）200 µL 加入 1800 µL PBS 中，稀释得到标准液 1（STD 1）。
    3. 通过将 STD 1 在 PBS 中进行系列稀释，制备后续六个标准品（STD 2–STD 7）（图 2）。
      1. STD 2：将 500 µL STD 1 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 50 ng/mL。
      2. STD 3：将 500 µL STD 2 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 25 ng/mL。
      3. STD 4：将 500 µL STD 3 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 12.5 ng/mL。
      4. STD 5：将 500 µL STD 4 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 6.25 ng/mL。
      5. STD 6：将 500 µL STD 5 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 3.125 ng/mL。
      6. STD 7：将 500 µL STD 6 与 500 µL PBS 混合，充分混匀，配制成 1.5625 ng/mL。
      7. STD 8：加入 500 µL PBS，配制成 0 ng/mL。
    4. 阳性对照：将 100 µL STD 1 溶液加入 900 µL PBS 中，稀释得到蛋白浓度为 10 ng/mL 的 HER2 溶液。
  6. 制备加标回收实验样品。
    1. 制备加入已知浓度 HER2 蛋白的基质样品（PBS、细胞裂解液和培养基）。将细胞裂解液按 1:2000 稀释，即取 2.5 µL 相应细胞裂解液加入 5 mL PBS 中，获得 HER2 浓度低于方法检测限（LOD）的样品基质。
    2. 使用 WSS（1000 ng/mL）和 STD1（100 ng/mL）对基质样品进行加标。
    3. 对每种基质，分别制备浓度为 0、2、5、10、30 和 50 ng/mL 的 6 个样品。
    4. 制备 0 ng/mL 样品：加入 400 µL PBS/培养基/细胞裂解液。
    5. 制备 2 ng/mL 样品：向 392 µL PBS/培养基/细胞裂解液中加入 8 µL STD1，充分混匀。
    6. 制备 5 ng/mL 样品：向 380 µL PBS/培养基/细胞裂解液中加入 20 µL STD1，充分混匀。
    7. 制备 10 ng/mL 样品：向 396 µL PBS/培养基/细胞裂解液中加入 4 µL WSS，充分混匀。
    8. 制备 30 ng/mL 样品：向 388 µL PBS/培养基/细胞裂解液中加入 12 µL WSS，充分混匀。
    9. 制备 50 ng/mL 样品：向 380 µL PBS/培养基/细胞裂解液中加入 20 µL WSS，充分混匀。
  7. 加入标准品、空白和待测样品。
    1. 使用单通道移液器，向相应孔中加入 100 µL 标准品、空白（PBS）和待测样品（细胞裂解液和培养基）。
      注：建议每个样品设三个复孔。
    2. 用封板膜覆盖酶标板。
    3. 在 37 °C 湿度箱中孵育 1 小时。
    4. 使用微孔板洗板机吸去孔内液体，并用洗涤缓冲液洗涤 3 次（每孔每次 300 µL PBST）。
  8. 检测抗体结合。
    1. 将生物素化检测抗体（克隆号 70.21.73.67）用 PBS 稀释至工作浓度 1 µg/mL。一块板需使用 6.5 mL 检测抗体工作液。
    2. 使用多通道移液器，向每孔加入 100 µL 检测抗体工作液。
    3. 用封板膜覆盖酶标板。
    4. 在 37 °C 湿度箱中孵育 1 小时。
    5. 使用微孔板洗板机吸去孔内液体，并用洗涤缓冲液洗涤 3 次（每孔每次 300 µL PBST）。
  9. 加入亲和素-辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）偶联物。
    1. 将市售的 Avidin-HRP 偶联物按 1:40,000 稀释，即取 1 µL 酶偶联物加入 40 mL PBST 中。
    2. 使用多通道移液器，向每孔加入 100 µL 稀释后的偶联物。
    3. 用封板膜覆盖酶标板。
    4. 在 37 °C 湿度箱中孵育 1 小时。
    5. 使用微孔板洗板机吸去孔内液体，并用洗涤缓冲液洗涤 3 次（每孔每次 300 µL PBST）。
  10. 显色反应。
    1. 使用多通道移液器，向每孔加入 100 µL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。
    2. 用封板膜覆盖酶标板。
    3. 在 37 °C 避光条件下孵育 1–5 分钟，并观察显色情况。
    4. 当显色达到预期水平时，加入 100 µL 终止液以终止反应。
      注：预期显色水平对应于分析物浓度较高的样品孔中出现明显的蓝色。
  11. 获取并分析数据。
    1. 使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。
    2. 采用四参数拟合标准曲线，根据曲线方程计算样品浓度。

ELISA 流程示意图；抗体包被、封闭、样本孵育；mAb a-HER2；HRP 检测。
图 1：建立的抗 HER2 夹心 ELISA 检测流程示意图。夹心 ELISA 实验关键步骤的概览。包括以红色边框标出的关键步骤，如使用捕获性抗 HER2 抗体 70.27.58 进行酶标板包被、加入样本（标准曲线样品、空白对照、细胞裂解液或培养基的实验样本），以及检测性抗 HER2 抗体 70.21.73.67 的结合。该检测最终通过信号检测与数据分析结束，其中使用酶标仪对显色信号进行定量，以确定目标抗原的浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

连续稀释过程示意图，显示八个试管中浓度依次降低。
图2：校准曲线标准溶液配制示意图。 对HER2重组蛋白进行系列稀释，以制备浓度范围为1.56-100 ng/mL的校准曲线（STD 1-STD 7号小瓶）。此外，包含不含HER2蛋白的阴性对照样品（STD 8）。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

夹心 ELISA 验证
新开发的检测方法需要进行验证。重要的验证参数包括线性、精密度以及检测限，即检测下限（LLOD）和检测上限。在之前的研究中，我们已进行了全面的方法学验证。通过使用模拟样本测试了夹心 ELISA 的线性，抗原浓度分别为低浓度（2、5、10 ng/mL）、中高浓度（30 ng/mL）和显著升高浓度（50 ng/mL），并将这些样本用 PBS 及其他对 HER2 定量具有重要意义的基质（如血清）进行稀释。图 3 显示了典型的校准曲线。 结果表明，该夹心 ELISA 方法对 HER2 蛋白的检测工作范围为 1.56–100.0 ng/mL12。

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讨论

在构建夹心 ELISA 的关键组分中，包被在板上的捕获抗体对检测的特异性和灵敏度具有重要作用。在本实验中，我们采用了一种在本实验室研发和表征的新型单克隆蛋白（HER2/70.27.58）作为捕获抗体。该抗体具有独特的互补决定区（CDR）序列，根据其亲和力测定，其检测灵敏度 ED50 为 0.0922 nM12夹心ELISA的特异性取决于捕获抗体的特异性，该抗体不结合无关抗原，这一点已通过先前的免疫荧光实验得到证实 体外 通过蛋白质印迹法检测培养细胞及细胞裂解物。本研究中所用的检测抗体（HER2/70.21.73.67）已得到充分表征，具有足够的亲和力（ED50为0.2347 nM）和特异性，可用于HER2的夹心ELISA定量分析12.

使用开发的夹心 ELISA 的主要目的是在研究癌症生物标志物及其在生物学中的作用时定量检测 HER2 浓度，尤其是结合 体外 培养的癌细胞模型。因此，工作范围和检测灵敏度需要考虑所研究样本类型（如人癌细胞）中HER2蛋白...

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披露

D.L.、A.A.、A.M.、M.S. 宣布获得 SDS Optic S.A. 的财务支持；A.A.、A.M.、M.S. 宣布持有 SDS Optic S.A. 的股票。

致谢

本研究得到了国家研究与开发中心资助项目 STRATEGMEDII/269364/5/NCBR/2015 以及欧盟“地平线2020”中小企业创新计划第 783818 号的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物素标记试剂盒-NH2AbnovaKA0003
印迹级脱脂奶粉RothT145.1
TC10/TC20细胞计数仪用双腔细胞计数载玻片Bio-Rad145-0011
细胞培养板Biologix07-6012
细胞刮刀Biologix70-1250
离心机Ohaus30130868
II级生物安全柜 - Telstar Bio II Advance 6TelstarN/A
透明平底96孔板Thermo Fisher442404
培养安全CO2培养箱 - Touch 190SLeecN/A
二甲基亚砜 Sigma AldrichD2650
DMEM - 高糖Sigma AldrichD0822
ELISA酶标仪BioTek800TSUVI
FBS标准胎牛血清PAN BiotechP30-19375
强制循环实验室烘箱BINDER9090-0018
HRP-亲和素Thermo Fisher43-4423
人Her2 / ErbB2蛋白，Fc标签，优级AcroBIOSYSTEMSHER2-H5253
免疫洗板机微孔板洗涤器Bio-Rad170-7009
L-谷氨酰胺溶液Sigma AldrichG7513
mAb a-HER2（克隆70.21.73.67）SDS OpticBIO-ABH-2
mAb a-HER2（克隆70.27.58）SDS OpticBIO-ABH-1
MDA-MB-231细胞系ATCCHTB-26
NaHCO3POCH810530115
NaOHPOCHBA0981118
蛋白酶抑制剂混合物Sigma AldrichP8340
RIPA缓冲液Sigma AldrichR0278
ROTI Fair PBSRoth1111.2
SK-BR-3 [SKBR3]细胞系ATCCHTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3]细胞系ATCCHTB-77
终止液 1xAbcamab210900
TC20全自动细胞计数仪Bio-rad1450102
TMB底物溶液 1xAbcamab210902
Tween-20Sigma AldrichP9416
涡旋振荡器Ohaus30392117
摇床振荡器Ohaus30391968

参考文献

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