经验证的免疫化学检测试剂盒，用于全面测定从细胞中释放并结合到细胞的人表皮生长因子受体 2

摘要

我们提出了一种使用新型抗 HER2 单克隆抗体的经过验证的夹心 ELISA 测定法。该检测试剂盒能够对 体外 培养细胞和其他样品（包括血液和组织）中细胞结合和释放的 HER2 蛋白进行精确定量。

摘要

人表皮生长因子受体 2 （HER2） 是一种公认的癌症标志物。它成为一个非常成功的诊断和治疗靶点，尤其是在乳腺癌和其他表达 HER2 的癌症类型中。在临床上，采用特异性抗 HER2 抗体的金标准免疫组织化学诊断方法用于测量膜结合受体的表达水平。从过表达细胞释放的 HER2 的可溶性胞外结构域 （ECD） 在血液中循环，可以反映受体的组织表达。需要准确且经过验证的检测方法，以将循环 HER2 蛋白的浓度与疾病临床表现相关联。

我们的团队开发并验证了新型夹心酶联免疫吸附测定 （ELISA），用于定量 HER2 的膜结合和从细胞释放的 ECD 结构域。 该检测使用先前开发的两种独特的 HER2 特异性单克隆抗体。定量范围包括 1.56-100 ng/mL 的 HER2 浓度，这对于体外培养的癌细胞来说是预期的， 并且在 0.5 ng/mL 水平上显示出敏感性。该方法令人满意的批内和批间精密度和准确度使其适用于各种类型生物样品（包括细胞培养基、血清和实体瘤组织）中的 HER2 定量。在这里，我们专注于综合测定 体外 培养的癌细胞的受体相关和分泌。该论文提出了一种定量 HER2 蛋白的分步方案，可用于检测各种细胞系、血液和组织。

引言

现代疗法的成功通常与精准医疗有关，而精准医疗的基础是准确识别对治疗敏感的患者¹。这些疗法包括针对在各种肿瘤（包括乳腺癌、子宫内膜、胃、肺等）上过表达的受体的抗 HER2 药物。几种 HER2 靶向药物已证实对 HER2 阳性癌症患者有益，包括 HER2 低² 型。确认 HER2 阳性状态对于识别潜在反应患者至关重要;然而，这仍然是一个挑战，尤其是在 HER2 低组中。

临床环境中通常用于 HER2 检测的金标准方法包括免疫组织化学 （IHC） 蛋白表达和通过荧光原位杂交 （FISH） 方法进行 HER2 基因扩增。此外，Oncotype DX 检测用于 HER2 mRNA 表达。这些方法所需的组织活检使得确定患者是否适合适当治疗以及他们对治疗的潜在反应变得不确定。尽管美国临床肿瘤学会 （ASCO） 和美国病理学家学会 （CAP） 于 2018 年更新了指南以减少检测单位之间的差异，但 HER2 一致性仍然是一个需要改进的主题³。

HER2 是表皮生长因子受体 （EGFR） 家族的原癌基因成员，在病理状态下过表达和激活会导致侵袭性结果或导致不良预后

方案

1. 人类癌细胞的培养

1. 在含有 4.5 g/L ᴅ-葡萄糖 （DMEM-HG），补充有 2 mM ʟ-谷氨酰胺和 10% （v/v） 热灭活 FBS 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中培养 MDA-MB-231、SK-BR-3 和 SK-OV-3 细胞系。在 37 °C 下在 5% CO₂ 的潮湿气氛中孵育培养物。
2. 当培养物达到 ~80% 汇合时，通过胰蛋白酶消化分离细胞，并将其收集到单独的 15 mL 锥形管中。
3. 用自动细胞计数器计数细胞，并将用于实验的细胞以 3 × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种到 12 孔板中，溶于 1 mL 生长培养基中。在 37 °C 下在 5% CO₂ 的潮湿气氛中孵育培养物。
   注意：实验的每个时间点播种一个孔。培养基后和细胞裂解物都将用于进一步分析。

2. 样品采集和制备

1. 从 24 小时培养物中，从每个细胞系的一个孔中收集培养基到 1.5 mL 管中。
2. 将收集的样品在 4 °C 下以 10 000 × g 离心 10 分钟。 将上清液转移到新管中并储存在 -20 °C 以进一步测定分泌的 ECD HER2 水平。
3. 用 1 mL 冷 PBS 洗涤板上....

结果

夹心 ELISA 验证
新开发的检测方法需要一个验证程序。重要的验证参数包括线性、精密度和检测限，即检测下限 （LLOD） 和检测上限。在上一篇文章中，我们进行了全面的方法验证。使用模拟样品检测低浓度（2、5、10 ng/mL）、中高浓度 （30 ng/mL） 和显著增加浓度 （50 ng/mL） 的 ELISA 线性，这些抗原在 PBS 和其他对 HER2 定量很重要的基质（如血清）中稀释。 图 3 显示了典型的校准曲线。 经测定，开发的夹心 ELISA 的工作范围为 1.56-100.0 ng/mL 的 HER2 蛋白¹²。

讨论

在构建夹心 ELISA 的关键组分中，有固定在板上的捕获抗体，这些抗体有助于检测的特异性和灵敏度。在所提出的测定中，我们采用内部生成和表征的新型单克隆蛋白 （HER2/70.27.58） 作为捕获抗体。该抗体具有独特的 CDR （互补决定区） 序列，根据亲和力，它在 0.0922 nM¹² 时的灵敏度为 ED50。夹心 ELISA 特异性由不结合不相关抗原的捕获抗体的特异性反映，正如之前通过 Western Blotting 对 体外 培养细胞和细胞裂解物进行免疫荧光所证实的那样。所提出的 ELISA 中使用的检测抗体 （HER2/70.21.73.67） 也得到了很好的表征，并显示出足够的亲和力（ED50 为 0.2347 nM）和特异性，可用于夹心 ELISA 定量 HER2¹²。

使用开发的夹心 ELISA 的主要目的是在研究癌症生物标志物及其在生物学中的作用时量化 HER2 浓度，特别是使用培养.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物素标记试剂盒-NH2	Abnova	KA0003
印迹级，奶粉，低脂	Roth	T145.1
细胞计数载玻片，用于 TC10/TC20 细胞计数仪，双室	Bio-Rad	145-0011
细胞培养板	Biologix	07-6012
细胞刮刀	Biologix	70-1250
心机	Ohaus	30130868
II 类生物安全柜 - Telstar Bio II Advance 6	Telstar	N/A
透明平底 96 孔板赛	默飞世尔	442404
安全 CO2 培养箱 - Touch 190S	Leec	N/A
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	D2650
DMEM - 高葡萄糖	Sigma Aldrich	D0822
ELISA 酶标仪	BioTek	800TSUVI
FBS 标准，胎牛血清	PAN Biotech	P30-19375
强制循环实验室干燥机	BINDER	9090-0018
HRP-亲和素	Thermo Fisher	43-4423
人 Her2 / ErbB2 蛋白，Fc 标签，优质	AcroBIOSYSTEMS	HER2-H5253
免疫清洗微孔板清洗机	Bio-Rad	170-7009
L-谷氨酰胺溶液	Sigma Aldrich	G7513
mAb a-HER2（克隆 70.21.73.67）	SDS Optic	BIO-ABH-2
mAb a-HER2（克隆 70.27.58）	SDS Optic	BIO-ABH-1
MDA-MB-231 细胞系	ATCC	HTB-26
NaHCO3	POCH	810530115
NaOH	POCH	BA0981118
蛋白酶抑制剂鸡尾酒	Sigma Aldrich	P8340
RIPA 缓冲液	Sigma Aldrich	R0278
ROTI Fair PBS	Roth	1111.2
SK-BR-3 [SKBR3] 细胞系	ATCC	HTB-30
SK-OV-3 [SKOV-3;SKOV3] 细胞系	ATCC	HTB-77
停止溶液 1x	Abcam	ab210900
TC20 自动细胞计数仪	Bio-rad	1450102
TMB 底物 1x	Abcam	ab210902
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Vortex	Ohaus	30392117
Wave 运动振荡器	奥豪斯	30391968