本方案介绍了一种利用光片荧光显微镜进行定量整体三维血管成像的快速方法。该方法的有效性通过鸡胚模型的咽弓动脉系统加以验证，并对血流动力学力进行了量化。 通过 计算流体动力学
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摘要
摘要
在心血管发育与疾病的小动物模型中，基于个体特性的血流计算模拟 实现对难以通过实验测量的血流动力学参数进行定量评估。计算流体动力学模拟揭示了力学因素在心血管功能及疾病进展中的关键作用。获取目标血管的高质量体层影像，是确保形态学测量和血流定量结果准确性和可重复性的核心环节。本研究提出一种快速、经济且易于实施的方法，利用光片荧光显微镜对小型动物血管系统进行整体高分辨率成像。改进的iDISCO+（免疫标记辅助的溶剂清除器官三维成像）光片显微样品制备流程包括：（1）使用荧光试剂标记血管系统，（2）固定保存样品，（3）使样品透明化。与经典iDISCO+采用免疫组织化学染色不同，作者使用FITC标记的聚-L-赖氨酸对血管内皮进行标记，这是一种价格低廉、非特异性的荧光染料，具有高度抗光漂白特性，该过程被称为 "内壁涂覆" 快速标记将样品制备时间从约四周缩短至不到3天。此外，使用危害性较低的溶剂肉桂酸乙酯（ECi）作为透明剂和成像溶液，使样品处理更安全，并适用于更广泛的成像设施。本研究采用该方案获取了发育第3天（HH18）至第8天（HH34）鸡胚心血管系统的高分辨率光片荧光显微图像序列。本研究进一步通过第5天（HH26）鸡胚的三维重建及计算流体动力学建模，验证了该方法在血管定量分析中的适用性。
引言
容积成像对于心血管生理学与疾病研究的准确性至关重要。定量成像可生成具有完整容积维度的高分辨率图像序列。样本必须经过适当保存以维持其原有结构 体内 形态和管腔容积，并以统一的高分辨率成像。通过高分辨率成像序列，用户可生成高保真的三维血管重建图像，完整展示血管的形态、结构及连通性1.
心血管结构具有复杂的三维解剖特征，若通过二维、割裂的视角进行观察，则无法准确呈现其真实形态。立体显微镜宽场形态学成像与组织学切片难以充分展现复杂的三维结构变化1,2,3。微型和纳米计算机断层扫描（micro and nano-computed tomography）图像是小动物体积成像定量分析的金标准1,4，但在生物学研究领域中尚未广泛普及或应用。近年来在组织透明化和全器官/小动物显微成像方面的技术进步，使得整体样本透明化与血管标记技术的定量应用成为可能5,6,7。组织透明化技术通过均一化组织样本中光的散射，降低光在介质中传播时因散射或吸收而产生的延迟。实现高度透明需要严格的组织处理流程，但这可能影响抗原性或荧光标记信号的亮度8。光片显微镜作为一种快速且强大的成像工具，已被生物学家广泛采用9，其成像速度比扫描显微镜高出数个数量级，并能够对尺寸超过1 cm的样本进行成像。在光片荧光显微镜（LSFM）中，激光可比共聚焦显微镜更快速、更深层地照射样本的横截面；因此，该方法要求样本具备高度透明性。
在此，作者改进了近期的iDISCO+透明化方法，并将其与鸡胚动物模型中的内壁染色技术（endo-painting）10相结合，以展示该方法在心血管系统从早期到晚期发育过程中的有效性。iDISCO（免疫标记辅助的溶剂清除器官三维成像）是一种基于有机溶剂的组织透明化方法，与基于水相的透明化方法不同，它不会因溶剂挥发而产生成像伪影。iDISCO与iDISCO+的区别在于，前者使用四氢呋喃进行脱水，而后者（iDISCO+）则采用更温和的甲醇脱水步骤，随后进行脂质提取。iDISCO+透明化方法的优点包括可对大型成体样本和胚胎进行免疫标记、组织收缩程度低以及高透明度8,11。尤为重要的是，iDISCO+能够生成高分辨率的图像堆栈，突破了传统生物学免疫标记技术的局限，使得研究人员可以获得整个器官或完整胚胎的结构信息，而不仅限于传统组织学中因仅采样小区域而导致的、缺乏整体组织层面结构信息的局限9。iDISCO+的缺点在于无法保存基因编码的荧光蛋白11。内壁染色（endo-painting）这一组织标记方法最初被用于心血管缺陷的高通量筛选，其方法是对HH31至HH36期的鸡胚心脏经左心室心尖处灌注0.5 mg/ml的FITC-聚-L-赖氨酸。染料允许结合4分钟后，再进行固定和保存10。
本研究发现，相同的FITC-聚-L-赖氨酸浓度可用于更广泛的胚胎阶段（HH18–HH34），但理想的固定时间有所不同（5–10分钟），以确保血管标记明亮清晰。采用本研究所述endo-DISCO技术的研究人员，若发现溶液黏度过高而无法充分标记所有目标血管，可考虑逐步降低染料浓度（每次减少0.1 mg/mL），但建议优先调整固定时间，并在调整染料浓度前先优化左心室的肌肉收缩状态。作者曾尝试使用0.1 mg/mL浓度进行内壁染色，发现虽然该浓度下染料更易在细小血管中扩散，但在PFA灌注时也更容易被洗脱。作者证明，通过本技术获得的高分辨率成像序列具有足够质量，可用于计算流体力学建模。血流路径及相应的血流动力学力（包括压力和管壁剪切应力分布）呈现出复杂且局域化的模式，只能通过计算流体动力学模拟加以解析1,12。这些生物力学力会影响邻近心血管组织的行为，并触发血管的适应、生长和重塑过程13。明确局部血流动力学力的数值，对于理解心血管功能及其疾病发生与进展的机制性调控因素具有关键意义2。
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方案
美国实验室动物福利办公室将公共卫生服务政策解释为仅适用于孵化后的鸡胚模型，即视为"脊椎动物"。此类胚胎同样不受机构动物护理和使用委员会（IACUC）的管辖。相关美国国立卫生研究院常见问题解答可通过以下网址访问： http://grants.nih.gov/grants/olaw/faqs.htm#ApplicabilityofthePHSPolicy。
1. 胚胎收集、标记与固定
- 时尚被拉动 使用显微拉针仪将内径为0.75的玻璃毛细管拉制成微针1,12.
注意：所需针头尺寸取决于动物年龄/期望的流速。也可使用显微解剖镊子或剪刀切割微针，但精度显著降低。 - 将Tyrode's溶液预热至约38℃°C
- 将FITC标记的聚-L-赖氨酸固体溶于Tyrode's溶液中，配制0.5 mg/mL的储备液。
注意：该浓度适用于鸡胚动脉的标记，其他组织类型的最适浓度可能有所不同。多余的储备液应保存在 -20 °C。 - 从蛋黄中分离禽类胚胎（本鸡心脏研究采用HH18（第3天）至HH34（第8天）的胚胎），使用尖端弯曲的剪刀围绕胚胎剪开，再用移液管或刮匙将胚胎转移至盛有温热台氏液的35 mm培养皿中。
- 用精细镊子在包裹胚胎的绒毛膜和尿囊膜以及心脏周围的心包膜上做微小（约0.1 mm）切口，然后将这些膜从胚胎上轻轻剥离并小心移除。
- 将胚胎转移至一个新的、洁净的培养皿中，培养皿内装有温热的Tyrode's溶液，以维持心脏跳动。
- 用温热的Tyrode's溶液填充一支5 mL塑料注射器。剪去一支0-20 μL塑料移液器吸头的宽端，并将其连接至注射器的平口端。此时，注射器已延伸为细口径移液吸头。
- 构建一个 "注射管线，" 通过将一段内径为0.03英寸的硅胶管连接到新固定的移液器吸头-注射器装置上（步骤1.7），再将玻璃毛细管微针连接至该管的另一端。
- 将微针安装到连接于显微操作器的显微注射持针器上。排出硅胶管和微针中的气泡。
- 使用显微操作仪，将针头插入心脏心尖部位，并对胚胎进行灌注1,12通过缓慢向心脏注入Tyrode溶液。持续灌注胚胎，直至其血液基本清除。
- 使用显微操作器将针头和注射管路从插入位置缓慢撤回，并调整针头方向，确保其在准备下一根注射管路时不会受到干扰。取下针头和注射器上的硅胶管。
注意：部分使用者可能会发现将针头保留在心脏上更为合适，此时应移除针头与注射器之间的硅胶管，同时保持针头位置不变。 - 通过内膜染色法用绿色荧光标记血管内皮。
- 使用微量移液器将20–40 μL的FITC标记多聚-L-赖氨酸储备液加入硅胶管中，注意避免在FITC液体前沿产生气泡。
- 重新连接装有Tyrode's溶液的注射器，使用显微操作器缓慢将溶液注入心脏心尖部，必要时可重新插入针头。在FITC标记的聚-L-赖氨酸完全扩散后、任何气泡进入心脏前，移除针头。
- 让FITC标记的聚-L-赖氨酸在胚胎中孵育5-10分钟。
注意：（可选质量检查）为验证荧光，可使用荧光体视显微镜或宏镜拍摄图像。该图像可用于在胚胎透明化完成后帮助确定脱水因子。
- 用5 mL注射器吸取4%多聚甲醛（PFA），并将其连接至硅胶注射管路，进行第三次注射步骤。
- 灌注胚胎1,12 用4% PFA固定至所有心血管结构达到完全充盈状态且组织开始变得不透明。
- 将胚胎轻轻装入一个装有足量4% PFA、体积为2-5 mL的样品瓶中，确保液体足以覆盖样本。注意不要过度挤压或变形胚胎。
注意：应选择足够大的小瓶来盛放目标样品，以避免样品被压碎或变形。 - 在4 °C条件下，将胚胎置于摇床中孵育过夜。
2. 胚胎脱水与透明化
- 小心地用移液器吸出4% PFA。
注意：从此时起，避免直接接触胚胎，以防组织损伤或变形。 - 为清洗胚胎，将胚胎在室温下置于新鲜的磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育30分钟，并轻轻振荡。重复此步骤两次，共完成3次洗涤。
- 在通风橱中开始对胚胎进行脱水处理。小心吸出PBS，将胚胎依次在梯度浓度的甲醇溶液中室温孵育，每次1小时：分别为20%、40%、60%、80%和100%甲醇浓度，共5次甲醇孵育。
- 将胚胎留在新鲜的100%甲醇中，于室温下过夜。
注意：（可选的暂停点）胚胎可在100%甲醇中于-20 °C保存长达6个月，以备后续使用。 - 在通风橱内开始脂质清除步骤。将胚胎置于二氯甲烷（DCM）与甲醇按2:1（体积比）配制的溶液中，室温孵育3小时，并轻轻振荡。
警告：DCM具有毒性，必须在通风橱中操作。操作DCM时需格外小心，建议佩戴双层手套以提供额外防护。 - 将肉桂酸乙酯（ECi）从4 °C取出，置于室温下使其融化。
- 在室温下用新鲜的100% DCM清洗胚胎，振荡15分钟。重复一次100% DCM清洗，共完成2次清洗。
- 用移液器吸出DCM，将胚胎转移至100% ECi中孵育。保持胚胎在ECi中直至其变得透明，约需1小时。必要时可轻轻振荡试管。
- （可选验证步骤）使用荧光体视显微镜或宏观成像系统检查组织透明化效果及血管染色质量。拍摄胚胎图像，以确定对应发育阶段/年龄的脱水缩放因子。
- 将已完成透明化的胚胎在4 °C避光保存，最长可达6个月，直至准备进行成像。
3. 数据采集
- 为了成像胚胎，使用光片荧光显微镜。用超级胶水凝胶将光学透明化胚胎的头部固定在玻璃毛细管上。
- 将玻璃毛细管安装到样品 holder 上，用 ECi 填充成像室，并将胚胎放入成像室中。
- 调整参数并进行成像。
4. 定量应用：三维重建与计算流体动力学建模
注意：在这些步骤中，使用光片显微镜获得的高分辨率图像序列将被导入开源软件 SimVascular14，用于三维解剖结构重建和计算流体动力学建模。SimVascular 官网提供了详细的教程（参见材料表）。重建过程包括在目标血管中创建中心线路径，沿路径生成二维分割轮廓，并将这些轮廓通过放样方式组合成一个三维实体模型。计算建模过程则包括准备网格化几何模型、定义边界条件以及运行模拟计算。
- 在“文件”下创建一个新的 SVProject，然后通过右键单击上传高分辨率的光片成像图像序列 图像 然后点击 添加/替换图片.
- 按照软件教程步骤重建血管解剖结构 计算机模拟
- 右键单击以创建路径线 路径 并选择 创建路径沿目标血管放置路径标记。对每个目标血管重复此操作。
- 对于每条生成的路径线，通过在路径线上右键点击来追踪二维血管横截面 分割 并选择 创建轮廓组选择 血管通路 并双击 血管 名称下方 分割 开始手动分割。
- 所有血管分割完成后，通过右键单击创建模型 模型 然后选择 建立模型选择 PolyData 类型，输入型号名称，点击 创建实体模型，并选择所有应包含在模型中的分割部分。
- 使用 SimVascular SVMesher 中内置的 Tetgen 网格生成器对几何体进行网格划分。定义最大边长，并同时执行表面和体网格生成。
注意：选择能够分辨血管内精细几何结构和局部血流动力学变异性的网格尺寸。从以下开始 估算全局网格尺寸 按钮。在完成仿真时，可能需要进行网格收敛性研究。 - 使用 SimVascular 求解器设置计算血流模拟。通过右键点击创建模拟文件 模拟 并选择 创建仿真任务调整基本参数，并为特定边界条件选择入口和出口边界条件（BCs）。
- 调整求解器参数，进入“创建文件并运行模拟”选项卡，选择网格文件，然后单击 创建数据文件 用于模拟。
- 使用高性能计算工作站或超级计算机启动模拟。
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结果
本文所介绍的快速整体高分辨率成像方案（图1，表1）可清晰显示血管管腔轮廓，如图2、图3和图4所示，其中鸡胚血管内皮表达GFP荧光，因此在从早期至成熟心脏发育的各个胚胎阶段均呈现绿色轮廓（图4）。若样本血管未清晰标记，需优化聚-L-赖氨酸浓度、染料固定时间以及是否利用心室收缩（如适用）（参见图2，了解在进行光片荧光显微镜成像前，胚胎在荧光体视显微镜或宏观显微镜下应呈现的形态）。通过温热的台氏液维持心脏跳动，并迅速将胚胎从卵黄囊中分离，有助于溶液在整个样本或小型动物模型中的扩散。聚-L-赖氨酸的黏度可通过母液浓度进行调控。较低黏度的溶液可能更有利于荧光在样本中的渗透，但应在PFA灌注后验证标记的稳定性。若聚-L-赖氨酸母液浓度较低，操作者可通过增加注射体积并在PFA固定前延长孵育时间来补...
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讨论
在三维条件下研究生物学对于准确理解形态复杂性、内部器官结构以及血管连接至关重要。精确且可靠的三维血管图像也是针对特定对象进行计算流体动力学模拟的核心，而此类模拟往往是量化壁面剪切应力和压力分布等关键血流动力学参数的唯一可靠手段。本文作者介绍了一种快速且易于实施的样本制备方法，用于在小型动物中利用光片荧光显微镜（LSFM）实现高分辨率三维血管成像。该方法可稳定地获得从HH18期（第3天）到HH34期（第8天）鸡胚的高分辨率图像序列，这一时期正是心脏发育的关键阶段。从HH24期（第4天）到HH34期（第8天），整个胚胎的尺寸由约30 mm增长至550 mm3，每24小时平均生长增加2倍，心脏心肌尺寸从约1 mm增大3 （第4天）至约17毫米3 （第8天）15由于胚胎和心血管系统的快速发育，本研究的图像采集采用了不同的平面分辨率，聚焦于咽弓动脉系统时，平面分辨率从HH18期（第3天）的0.61 µm变化到HH34期（第8天）的2.28 µm，z轴步进范围为1.92–2.4 µm；采集整个胚胎图像时，平面分辨率从HH18期...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国心脏协会职业发展奖、伯勒斯威康基金科学界面职业奖、Additional Ventures单心室研究基金以及加州大学圣地亚哥分校医学院显微镜核心（资助号 P30 NS047101）的支持。作者感谢 Dr. Bobby Thompson 介绍内膜染色技术，同时感谢加州大学圣地亚哥分校医学院显微镜核心以及 Robert Porter（UCSD）提供的实验支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5 镊子 | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| #55 镊子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 内径 0.03 英寸硅胶管 | VWR | 32829-182 | |
| 20 μL 移液器吸头 | VWR | 76322-134 | |
| 35 mm 培养皿 | VWR | 10799-192 | |
| 5 mL 塑料注射器 | VWR | BD 309646 | |
| 二氯甲烷（DCM） | Sigma-Aldrich | 270997 | 参见材料安全数据表（MSDS）。存放于通风橱下方的侧柜中 |
| 肉桂酸乙酯（ECi） | Sigma-Aldrich | 112372 | 4 °C 下保存 |
| 精细弯头剪刀 | Fine Science Tools | 14061-09 | |
| 荧光素标记的聚-L-赖氨酸（FITC-poly-L-lysine） | Sigma-Aldrich | P3069 | -20 °C 保存（粉末、储备液），4ºC 保存（工作液） |
| 荧光显微镜 | EVIDENT SCIENTIFIC | MVX10 | |
| 玻璃毛细管（0.75 mm 内径） | Sutter Instrument | FG-GB100-75-10 | |
| 光片显微镜 | Zeiss | Z.1 系统 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | M1775 | 参见材料安全数据表（MSDS）。存放于通风橱下方的易燃品柜中 |
| 微电极拉制仪 | Narishige International USA, Inc. | MF2 | |
| 显微操作器 | World Precision Instrument | M3301R | |
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Thermo Scientific | J19943.K2 | 参见材料安全数据表（MSDS）。-20 °C 保存（粉末），4 °C 保存（4% 工作液） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Cytiva | SH30256.01 | 室温存放 |
| SimVascular | 开源软件 www.simvascular.org | ||
| Tyrode’s 溶液 | 自行配制 |
参考文献
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