粪便抗原的快速检测 幽门螺杆菌 基于双抗体夹心检测技术的感染检测

摘要

本研究建立了一种基于双抗体的夹心检测法，用于快速检测感染幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的粪便抗原。

摘要

Helicobacter pylori 可寄生于胃黏膜，感染后可引发一系列胃肠道疾病，与胃炎、胃溃疡及胃癌密切相关。在医疗基础设施薄弱和卫生条件不足的地区，H. pylori 感染的高发病率仍是重要的公共卫生问题。因此，在资源有限的环境中，开发快速、简便且经济高效的 H. pylori 检测筛查方法至关重要。

本研究在广东省石潭村开展了一项基于社区的筛查工作。石潭村地处偏远、经济欠发达，常住人口约300人，居民整体教育水平较低。我们采用双抗体夹心法检测 H. pylori 粪便抗原检测，该方法因其在资源有限环境中的潜在适用性而被选用。共招募了来自该村庄的261名参与者，并使用该技术分析了他们的粪便样本。为了进行比较验证，对同一批样本进行了定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。与qPCR结果相比，该检测方法在识别目标物时的敏感性和特异性分别为 H. pylori 粪便中抗原的检出率分别为60.24%和80.08%。结果表明，粪便抗原检测方法与qPCR之间具有高度一致性（Kappa = 0.630。 本研究系统阐明了粪便抗原检测的原理、流程、方法学及临床应用 H. pylori 感染，旨在探索基于乳胶的双抗体夹心技术，并建立其辅助诊断的新策略与实用指南。

引言

幽门螺杆菌（H. pylori，Hp）是一种微需氧、螺旋状、革兰氏阴性细菌¹。由于其能够在人体胃部定植并引起慢性感染²，该病原体已被确认为胃腺癌发生的主要病因之一^3,4。2015年，全球约有44亿人感染H. pylori⁵。H. pylori感染的流行率存在显著的地理差异，发展中国家的感染率明显高于发达国家。值得注意的是，在低收入国家以及某些脆弱人群中，感染率可高达75%⁶。

尽管胃镜等传统检测方法具有较高的准确性，但由于其具有侵入性、成本较高且患者接受度低，限制了其在大规模筛查和常规随访中的应用⁷。因此，寻找非侵入性、简便且快速的诊断方法已成为现代临床医学研究的重要方向。H. pylori 非侵入性诊断的主要目的是在无需内镜检查的情况下，准确、安全、便捷地检测患者是否感染 H. pylori。尿素呼气试验（UBT）、H. pylori 粪便抗原检测（FAT）⁸ 和血清学检测⁹ 是目前常用的非侵入性技术。

在这些方法中，尿素呼气试验（UBT）是目前可采用的侵入性最小且最准确的检测方法¹⁰。UBT 的灵敏度和特异性均高于 95%¹¹。在现有的非侵入性诊断方法中，UBT 已被证明是最准确且最可靠的。例如，在伊拉克进行的一项验证研究显示，由于其相较于其他方法具有更高的检测性能，UBT 可被推荐作为首选方法¹²。然而，UBT 也存在一些缺点，例如成本较高且需要质谱分析，这限制了其在偏远或资源有限地区的应用¹³。

快速、无创且经济高效的幽门螺杆菌（H. pylori）感染检测方法的开发至关重要，尤其在资源有限的地区。本研究基于双抗体夹心检测技术，建立了一种针对H. pylori粪便抗原的快速检测方法，可对粪便样本中的H. pylori抗原进行快速、有效且低成本的检测。该技术具有成本低、无创、操作简便以及适用于偏远地区等显著优势。我们假设，采用双抗体夹心法检测H. pylori粪便抗原的灵敏度和特异性可与qPCR相媲美，有望成为一种可行的无创临床诊断工具。

我们全面阐述了粪便抗原检测H. pylori感染的原理、操作流程、方法学优势及其临床适用性。为验证其实际应用价值，我们在广东省清远市石潭村开展了一项流行病学调查与筛查工作。该村庄地处偏远、经济欠发达，常住人口约400人，教育水平有限。研究结果表明，本研究所设计的粪便中H. pylori抗原快速检测技术可在20分钟内完成。值得注意的是，粪便中H. pylori抗原的快速检测有望成为在偏远落后地区快速、可靠诊断H. pylori感染的一种潜在且具有前景的工具。

方案

本横断面研究已获得广东省人民医院伦理委员会批准（批准号：KY2024-445-01），研究过程中所有受试者的个人信息均严格保密。所有参与者在实验前均签署了书面知情同意书。研究对象为2024年广东省清远市石潭村的常住居民，年龄和性别不限。下述双抗体夹心法（定性实验）由专业医学技术人员严格按照说明书操作。本研究纳入该村全部常住人口，无论其健康状况、是否存在胃肠道相关症状或已知胃肠道疾病。

1. 患者选择

1. 若患者在近1个月内使用过质子泵抑制剂、铋剂、H₂受体阻滞剂或抗生素，则予以排除。
2. 要求所有参与者匿名填写问卷。问卷内容包括五个问题：您是否规律进食三餐？您是否饮酒？您是否知晓H. pylori？您是否认为有必要进行H. pylori检测？您是否了解H. pylori感染的不良后果？

2. 粪便中幽门螺杆菌（H. pylori）感染抗原检测的操作步骤

注意：幽门螺杆菌（H. pylori）粪便抗原检测的算法设计旨在确保结果的准确性和可靠性，同时兼顾操作的简便性与卫生性。整个流程分为五个步骤：样本采集、样本处理、样本保存、检测和结果判读。样本检测的工作流程图和示意图见图1和图2。

1. 样本采集
   注意：H. pylori 抗原特异性容器应用于样本采集。样本不得与水、尿液、消毒剂和污水混合。
   1. 排便完成后，取下专用容器的顶盖，取出采样棒。
   2. 将采样棒连续插入粪便的五个不同位置进行采样，确保采样棒的螺纹端完全插入粪便中。
   3. 采样完成后，将采样棒重新插入试剂管中；总采样量约为 5–50 mg。
2. 样本处理
   1. 将试剂管左右摇动约 10 秒，使粪便样本在稀释液中充分混匀（主要成分：乙二胺四乙酸四钠水合物 0.018 g/mL 和氯化钠 0.01 g/mL）。
3. 样本储存
   1. 采样后应尽快进行检测；如需延后，可在室温下保存不超过 6 小时，或在冷藏条件下（2–8 °C 下不超过 72 小时）以及冷冻条件下（-25 °C 至 -15 °C 下不超过 6 个月）保存，以减缓抗原降解和微生物活性。
      注意：样本可反复冻融最多 3 次，冷藏或冷冻样本在检测前均应恢复至室温。
4. 样本检测
   1. 打开试剂管盖上的白色盖帽，并保持试剂管直立。
   2. 将盖子压到底部，使样本流入检测卡，流经包被有鼠抗 Hp 抗体的检测区（T）和质控区（C）。
5. 结果判读
   1. 等待 10–20 分钟，使样本中任何存在的 H. pylori 抗原若与抗体结合，则在检测区形成肉眼可见的显色反应。通常表现为一条红色或紫色的条带，与质控区的条带形成对比。
   2. 显色反应的有无及颜色深浅与样本中 H. pylori 抗原浓度相关。通过比对比色卡可快速准确地判读结果（见 图 3）。

3. DNA 提取

1. 取适量粪便样本放入离心管中，加入PBS溶液，充分振荡混匀。在12,000 × g 条件下离心5–10分钟，然后小心吸取200 µL上清液用于后续提取。
2. 根据样本数量，准备相应数量的1.5 mL离心管。向每管中依次加入20 µL蛋白酶K（20 mg/mL）、10 µL磁珠、200 µL样本上清液和200 µL裂解缓冲液A。通过反复倒置混匀，然后在55 °C金属浴中孵育10分钟。
3. 裂解完成后，将离心管置于磁力架上静置，使磁珠吸附1分钟。待管内液体完全澄清后，弃去上清液，并尽量避免扰动磁珠。
4. 将离心管从磁力架上取下，放置于1.5 mL离心管架上。使用移液器向每管中加入500 µL洗涤缓冲液E，充分混匀1分钟，然后将离心管放回磁力架。静置1分钟，待溶液澄清后弃去上清液，注意避免吸走磁珠。
5. 向每管中加入500 µL洗涤缓冲液W2，重复洗涤步骤。充分混匀1分钟，将离心管置于磁力架上静置1分钟。溶液澄清后小心弃去上清液，确保磁珠不被扰动。
6. 向每管中加入100 µL洗脱液，混匀后在55 °C孵育5分钟。
7. 将离心管置于磁力架上静置2分钟。待溶液澄清后，小心将洗脱的核酸转移至新的离心管中，避免吸入磁珠。
8. 通过测定260 nm（A₂₆₀）和280 nm（A₂₈₀）处的吸光度评估提取DNA的纯度。计算A₂₆₀/A₂₈₀比值，高纯度DNA的理想比值应大于1.8。

4. 用于检测幽门螺杆菌（H. pylori）及其抗生素耐药性的qPCR

注意： 我们通过扩增 ureA 基因进行 qPCR 检测以确定 H. pylori 感染。所有阴性质控品均为无菌的纯化水。H. pylori 核酸检测试剂盒中的阳性对照品为灭活的 H. pylori 标准微球（ATCC 43504）。C_T  ≤ 30 且具有典型 S 形扩增曲线的结果判为阳性。

1. 根据待检测样本的数量，从试剂盒中取出H. pylori冻干品，并快速离心，使冻干粉沉于管底。
2. 小心打开冻干品管盖；取待测样本的核酸；向冻干品中加入25 µL样本核酸，并盖紧管盖。
3. 将PCR试剂轻轻振荡混匀8–10秒，然后快速离心3–5秒。
4. 针对32孔板上的每份样本，配制25 µL PCR反应体系（含冻干粉[内含Taq酶（5 U/µL）、脱氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L）、UNG酶（2 U/µL）、ureA基因上游引物（5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3'）和下游引物（5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3'）（40 µmol/L）]）以及25 µL（2.5 µg）提取的DNA。
5. 将32孔板qPCR板放入qPCR仪中运行。设置扩增程序：42 °C和95 °C（各1个循环），每个温度保持2分钟；95 °C 10秒、65 °C 45秒（两步为1个循环），重复10次；95 °C 10秒、58 °C 45秒（两步为1个循环），共35个循环。
6. 使用qPCR专用软件分析数据，并由仪器自动设定基线阈值。

5. 统计分析

1. 采用卡方检验分析实验数据，评估本方法与qPCR结果之间的一致性，并将该技术筛查的阳性率与更广泛范围（例如全国范围）的H. pylori感染阳性率数据进行比较。当P < 0.05时，认为差异具有统计学意义。

结果

问卷调查
本研究共纳入261名参与者，包括144名女性和117名男性，年龄范围为4至99岁，平均年龄为48.30 ± 17.61岁。其中未成年人（0-17岁）17人，成年人（18-64岁）202人，老年人（>64岁）42人。问卷调查结果见表1。大多数参与者（90.8%）认为有必要开展H. pylori筛查。

本村粪便H. pylori抗原检测筛查结果
在接受粪便H. pylori抗原检测的261名参与者中，52人（19.92%）结果为阳性，209人为阴性。在52例阳性病例中，女性32人，占所有女性参与者的22.22%；男性20人，占所有男性参与者的17.09%。按年龄分层分析，阳性率分别为：未成年人（0–17岁）2例阳性（11.76%），成年人（18–64岁）41例阳性（20.30%），老年人（>64岁）9例阳性（21.43%）。

讨论

H. pylori 是全球范围内最常见的细菌感染之一¹⁵。问卷调查结果显示，55.2%的人群对H. pylori缺乏认知，而90.8%的人认为H. pylori筛查是必要的。这些发现凸显了在经济欠发达和偏远地区推行H. pylori筛查项目的重要性¹⁶。尽管尿素呼气试验（UBT）是一种常用的诊断方法，但其高昂的成本以及对儿童和孕妇的不适用性限制了其广泛应用^17,18。血清H. pylori抗体检测可检测患者血清中的抗体¹⁹。然而，由于抗体在细菌被清除后仍可长期存在，该检测不适用于治疗后的评估²⁰。相比之下，粪便抗原检测是一种无创方法，无需进入胃腔，仅需采集粪便样本即可进行分析。该方法显著减轻了患者的不适感和潜在风险，更便于筛查和随访。此外，其无...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNA提取试剂盒	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	无
H. pylori粪便抗原检测试剂盒	杭州诺辉健康科技有限公司	20213401126	无
H. pylori 核酸检测试剂盒	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	无
实时荧光定量PCR	上海宏石医疗科技有限公司	20183221659	无
统计产品与服务解决方案	IBM公司	无	无