用于内皮细胞与β细胞相互作用三维研究的新型胰岛模型：在细胞保护剂筛选中的应用价值

摘要

本方案提供了生成小鼠胰岛稳定类球体的详细步骤，以及针对其微小尺寸优化的三维染色、透明化和封片的详细方法。

摘要

本方案详细描述了一种优化的小型稳定类球体的制备、培养及三维成像方法，用于在胰岛三维模型中研究内皮细胞与胰岛素分泌β细胞之间的相互作用。该类球体直径为150–200 µm，模拟了胰岛尺寸的最低范围，由1个胰岛内皮细胞（MS-1细胞）与20个胰岛素分泌细胞（β-TC-6细胞）按特定比例组合制备而成。文中详细阐述了小型类球体在染色、透明化和封片过程中面临的挑战，以及如何通过使用低熔点琼脂糖和CUBIC透明化技术来克服这些问题，同时介绍了利用不同探针高效分析三维结构的关键要点。实验数据显示，NTPDASE-外核苷酸酶3在类球体模型中不与胰岛素共定位，提示β-TC6细胞可能存在不同的成熟度和功能水平；此外，该完整流程也可应用于分离的胰岛组织，实现对胰岛内血管结构的清晰探查。这些结果凸显了该三维成像方案在揭示胰岛模型中复杂胰腺细胞组织结构与细胞间相互作用方面的有效性。

引言

胰岛移植常伴随即刻性血液介导的炎症反应（IBMIR），该反应会显著损伤胰岛内皮细胞（IEC），影响移植物的灌注和功能。长期来看，患者在移植后4年会出现功能性胰岛质量减少以及胰岛素非依赖性丧失的情况¹。尽管已建立小鼠或大鼠的胰岛移植模型，但目前仍缺乏标准化模型用于研究胰岛预处理中的药物靶点，尤其是在IBMIR引起的细胞因子驱动型移植物损伤背景下²。事实上，类球体结构特别适用于发现新的药理靶点，并评估针对细胞因子诱导的细胞功能障碍具有细胞保护作用的分子。此外，该方法还为减少1型糖尿病和胰岛移植动物模型的使用提供了替代方案。

寻找适用于胰岛尺寸范围内小型类球体的合适染色、光学透明化和封片条件仍然具有挑战性。文献中极少有研究描述小型类球体的处理方法及其关键结构特征。这一困难还源于需要在组织渗透性、信号保留和结构完整性之间取得平衡，同时维持这些微型三维细胞结构的 delicate 特性。此外，传统的染色方法通常难以实现类球体的均匀标记。由于细胞排列致密，抗体和染料的渗透受限，会阻碍试剂的扩散，从而加剧了这一问题^3,4。最后，光学透明化过程对于降低光散射背景并提高成像深度至关重要，必须仔细优化该过程，以避免破坏类球体结构或改变其生物学特性⁵。

对小型类球体进行三维显微成像的制片是另一项挑战。传统的封片介质可能无法为这些精细结构提供足够的支撑，导致其在成像过程中发生变形或塌陷。此外，为了获得最佳成像质量，必须精确控制折射率匹配，以确保在整个类球体深度范围内实现准确的可视化^6,7。由于类球体培养中所使用的细胞类型和实验条件具有高度多样性，针对小型类球体的实验方案开发变得更加复杂³。最后，在染色和透明化全过程维持多种细胞群体完整性的特殊方法，对于评估细胞响应至关重要。

为应对研究IBMIR介导的胰岛细胞应激所面临的特定挑战，设计了一种包含2000个细胞的球体模型，该模型结合了小鼠胰岛内分泌细胞（IEC）和分泌胰岛素的β细胞，其中IEC与β细胞的比例为1:20，类似于胰腺胰岛中观察到的比例。此外，先前的实验已证实该结构在96小时内保持活性，从而为观察短期（数小时）或较长期（数天）的应激诱导细胞反应及其药理学调控提供了具有生理相关性的三维模型。该球体模型由小鼠胰岛内皮细胞MS-1组成，这类细胞具有胰岛微血管的特征，同时包含组成型分泌胰岛素的β细胞β-TC-6⁸。该模型的设计旨在紧密模拟胰腺胰岛的最小尺寸范围（直径50–200 µm）及其平均细胞数量⁹。

本文报道了一种专门针对小型类器官（直径150-200 µm）操作而优化的新型收获与染色方法，可实现荧光染料和抗体在整个类器官结构中的最佳渗透，并将背景信号降至最低。该方案包含一种利用低熔点琼脂糖（LMPA）的封片步骤，可在为脆弱的类器官提供温和结构支撑的同时，实现最佳的折射率匹配。LMPA是琼脂糖的一种修饰形式，其凝胶化温度（约27 °C）和熔点（约65 °C）较低，可在包埋过程中保持样品完整性，并形成光学透明、自发荧光极低的基质^4,6。最后，采用透明化脑/体成像鸡尾酒试剂与计算分析（CUBIC）¹⁰方法进行光学透明处理，以最大程度地可视化内部结构，并保持脆弱的细胞间相互作用的完整性^5,6,10。

方案

使用人胰腺组织及所有实验方案均获得法国政府高等教育与研究部（研究与创新总司，生物伦理部门）批准，并注册编号为 DC-2019-3439。所有受试者法定监护人均已签署知情同意书。

1. 类球体的制备

注意：同时培养小鼠肠上皮细胞系 MS-1 和小鼠胰腺 β 细胞系 β-TC6，以获得足够的细胞数量用于球状体培养。MS-1 在含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 高糖培养基中培养，培养基添加 5% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，置于 37 °C 恒湿环境中，在 T75 贴壁细胞培养瓶中进行。细胞在培养 2 天达到汇合时，用 1× 胰蛋白酶-EDTA 消化后进行传代，并用 Hank 平衡盐溶液（HBSS）洗涤三次。β-TC6 在含 4.5 g/L 葡萄糖的 DMEM 高糖培养基中培养，培养基添加 15% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，置于 37 °C 恒湿环境中，在适用于难贴壁细胞的 T75 培养瓶中进行。细胞在培养 10 天达到 β-TC6 汇合状态时，用 1× 胰蛋白酶-EDTA 消化后进行传代，并用 Hank 平衡盐溶液（HBSS）洗涤三次。

1. 准备球体培养板
2. 使用生产商提供的抗黏附冲洗液 500 µL 洗涤培养板，以防止细胞黏附并促进球体形成。
3. 在室温下，将培养板置于配备板架的摆动桶转子中，以 1,300 x g 离心 5 分钟。
4. 在光学显微镜下观察培养板，确保微孔中无气泡残留。如有气泡，需再次以 1,300 x g 离心 5 分钟。
5. 弃去抗黏附冲洗液，并用 1 mL 温热的 HBSS 洗涤孔内 3 次。
6. 弃去 HBSS，加入 500 µL 温热的球体培养基：含 4.5 g/L 葡萄糖、10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的高糖 DMEM 培养基。
7. 在准备球体悬液期间，将培养板置于 37 °C、湿润环境中保存。
8. 同时用胰蛋白酶溶液孵育 MS-1 和 β-TC6 细胞，并分别计数各细胞系中的活细胞数量。
   注：接种时，采用胰岛中典型的 1 个 IEC 对 20 个 β 细胞的比例形成球体。使用 24 孔球体培养板，每孔含有 300 个微孔，每个微孔可容纳一个由 2000 个细胞组成的球体，即每孔共 600,000 个细胞。本研究中的测量结果显示，在 48 小时球体培养后，选定的 β-TC6 和 MS1 细胞系所占据的球体体积相同。
9. 将两种细胞系按 1:20 的比例混合，配制 24 孔所需的细胞总量，然后悬浮于 24 mL 球体培养基中。
   注：使用 10 mL 或 25 mL 移液器以吸液-排液方式混匀悬液。
10. 每孔加入 1 mL 细胞悬液，并以吸液-排液方式操作，使细胞悬液在孔内均匀分布。
11. 在室温下，将培养板置于配备板架的摆动桶转子中，以 130 x g 离心 5 分钟。
12. 在显微镜下观察培养板，确保细胞在微孔中分布均匀。
    注：在此离心步骤中，应使用较高的加速度和减速度（加速度和减速度刻度的 70%–90%），否则细胞团块会偏移至微孔的一侧。
13. 将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
14. 使用光学显微镜监测球体的形成和生长情况。
    注：β-TC6 / MS-1 球体应在培养 24 小时后开始形成，48 小时后呈现球形。通过台盼蓝染色检测细胞活力，方法为在重复样本中用胰蛋白酶消化球体后进行染色，结果显示细胞活力在 96 小时内维持在 80%–90%。

2. 类球体的收获与染色

1. 用 P1000 移液器在培养基中轻柔重悬类球体。
2. 将类球体排入 15 mL 离心管中的小体积液体中，在室温下以 130 × g 离心 5 分钟。
3. 小心吸除上清液，避免扰动含有类球体的沉淀。
4. 用 2 mL HBSS 轻柔洗涤沉淀两次，以避免类球体解离，并在 130 × g 下离心 5 分钟。
5. 在化学通风橱中弃去 HBSS，将类球体重悬于 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中，在 4 °C 下过夜固定。
6. 以 130 × g 离心 5 分钟，弃去 4% PFA 溶液，并用 2 mL 1× PBS（使用实验室级超纯水配制）洗涤 3 次。
7. 重悬于 2.5 mL HBSS 中。
8. 将类球体悬液分装至 6 孔板中。
9. 在双目放大镜下，使用 P200 移液器手动挑选 20 至 30 个类球体，转移至 1.5 mL 离心管中。
   注意：每个 1.5 mL 离心管代表一种染色条件，包含 20 至 30 个类球体。若收获的类球体少于 20 个，在后续重悬时将难以观察。
10. 调整各 1.5 mL 离心管中的液体体积一致，并在 800 × g 下离心 5 分钟。
    注意：从此时起，所有溶液的吸除步骤均需借助放大镜进行。在人工光源下极难观察到类球体，因此所有后续操作应尽量在白天进行，并将离心管置于自然光下观察。所有溶液均使用 P1000 吸头末端连接 P10 吸头的方式吸除。
11. 尽可能多地去除 HBSS，避免重悬类球体。
12. 将类球体重悬于 400 µL 淬灭溶液（0.5 M 甘氨酸溶于 1× PBS，pH 7–7.4）中，以消除 PFA 固定后残留醛基可能引起的背景噪声。在 37 °C 下孵育 2 小时。
13. 在 800 × g 下离心 5 分钟，用移液器吸除淬灭溶液。
14. 将类球体重悬于 400 µL 通透缓冲液（0.2% Triton X-100、0.3 M 甘氨酸、20% DMSO 溶于 1× PBS）中。该步骤有助于提高抗体和核探针的渗透性。在 37 °C 下孵育 2 小时。
    注意：从此阶段开始，类球体会自行沉降，不再附着于管壁。若在不扰动类球体沉淀的前提下轻柔吸除液体，则无需再进行离心。如有必要，可在 800 × g 下离心 5 分钟。
15. 弃去通透缓冲液，并在 400 µL 封闭缓冲液（0.2% Triton X-100、1% BSA、10% DMSO、5% 山羊血清溶于 1× PBS）中于 37 °C 下过夜孵育。
16. 弃去封闭缓冲液，并在 300 µL 一抗溶液（0.2% Tween 20、1% BSA、5% DMSO、5% 山羊血清溶于 1× PBS）中于 37 °C 下过夜孵育。
    注意：使用的一抗包括抗 CD31 抗体（终浓度 2.2 µg/mL）、抗整合素 β1 抗体（1.43 µg/mL）、抗胰岛素抗体（0.66 µg/mL）以及抗小鼠 NTPDase3¹¹ 抗体（稀释比例 1:1000）（见材料表）。应使用相应同种型的对照 IgG 在相同结构上进行验证，以通过荧光显微镜确认阳性标记的特异性。
17. 弃去一抗溶液，并用 400 µL 洗涤缓冲液（0.2% Tween 20、1% BSA 溶于 1× PBS）洗涤 3 次，每次洗涤间摇动 5 分钟。
18. 在 300 µL 二抗溶液（含 DAPI（2 µg/mL）、0.2% Tween 20、1% BSA、5% DMSO、5% 山羊血清溶于 1× PBS）中于 37 °C 下过夜孵育。用铝箔包裹离心管避光。
    注意：所有染色条件中均应加入 DAPI，以便在显微镜成像时更容易定位类球体，并有助于防止不同荧光染料/荧光素的光漂白。所有二抗的终浓度均为 2 µg/mL（见材料表）。
19. 弃去二抗溶液，并用 400 µL 第二种洗涤缓冲液（0.2% Tween 20、1% BSA 溶于 1× PBS）洗涤 3 次。保留最后一次洗涤液，并将离心管在 37 °C 下保存，直至当天进行封片。

3. 溶液配制

1. 透明化溶液的配制
   注意：透明化溶液参照 CUBIC¹⁰ 方法，按照 Gunasingh 等人⁴ 提出的方法进行配制。各组分比例以最终溶液质量的百分比（w/w）表示，因为 Quadrol/N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺黏度过高，无法用移液器操作，必须称重。
   1. 在玻璃瓶中称取 9%（w/w）N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺、22%（w/w）尿素、44%（w/w）蔗糖、0.1%（w/w）Triton X-100 和 24.9%（w/w）实验室级超纯水。
      注意：清除一个 24 孔板大约需要 60 g 溶液。
   2. 加入一个与瓶直径相匹配的磁力搅拌子。
   3. 将溶液加热并搅拌至 56 °C。在同一加热板上放置一个装有水的对照玻璃瓶，以监测温度上升情况。
   4. 调节搅拌速度，使液体形成平稳的漩涡，并持续搅拌直至所有成分完全溶解。溶液应完全呈液态且澄清透明，此过程可能需要长达 1 小时。
   5. 置于室温避光保存。
      注意：透明化溶液必须至少在使用前 24 小时配制完成，以便溶液脱气并消除可能存在的气泡。为避免引入气泡，切勿再次震荡溶液。切勿冷藏储存。
2. 2% LMPA 溶液的配制
   1. 用精密天平称取 0.5 g LMPA，并放入一个 100 mL 锥形瓶中。
      警告：切勿使用体积更小的锥形瓶，否则在溶液沸腾时可能溢出并造成烫伤。
   2. 在室温下用 25 mL 1x PBS 溶解。
   3. 轻轻摇动锥形瓶，使粉末充分分散于 1x PBS 中。
      警告：下一步操作时必须佩戴个人防护装备：手套以及保护眼睛和面部的面罩，以防液体飞溅或烫伤。
   4. 将锥形瓶放入微波炉中加热。
   5. 观察溶液开始沸腾时（液体中出现气泡），立即取出，防止其溢出。
   6. 轻轻搅拌锥形瓶，使粉末进一步溶解。
      警告：切勿剧烈搅拌，以免液体溢出或暴沸飞溅。
   7. 将锥形瓶再次放回微波炉，重复加热和搅拌步骤，直至 LMPA 完全溶解。
   8. 取出锥形瓶，在 LMPA 凝固前迅速将 2% LMPA 溶液以每管 1 mL 分装至 1.5 mL 离心管中。室温储存。
      注意：该过程耗时较长，建议预先配制并储存以备后续使用。

4. 封片与光学透明化

1. 将板式离心机预热至 40 °C，运行长时间循环以准备样品板。
   注意：低熔点琼脂糖（LMPA）在 30 °C 时会凝固。离心机温度不得低于 40 °C。若离心机允许，可升温至 50 °C。
2. 将 2% LMPA 分装样品置于 70 °C 水浴或试管加热器中，加热 5 至 10 分钟使其完全液化。
3. 将 2% LMPA 温度降至 55 °C 并维持该温度。
4. 将成像板轻轻放置于已预热至 50 °C 的板式加热器上。
   注意：操作时需小心，避免划伤或损坏用作孔板基底的脆弱聚合物材料。
5. 在加入 2% LMPA 前，注意确认板面温度较高，以防止此阶段发生凝胶化。
6. 向每个孔中加入 200 µL 的 2% LMPA，覆盖整个支撑面底部，形成第一层液态基底，以便更均匀地分布类球体。
7. 弃去管中的洗涤缓冲液，将类球体重悬于 300 µL 的 2% LMPA 中，并直接移入对应孔中。重悬操作应始终轻柔，以避免产生气泡。
8. 用铝箔覆盖板面，以保护荧光染料。
9. 迅速取下铝箔称量板的重量，随后立即将板放回板式加热器上。
10. 准备一个 24 孔板，加入水以进行平衡。
11. 迅速将覆盖有铝箔的板从板式加热器上取下，以保护偶联在二抗上的荧光染料。手持操作，切勿将其放置于低温表面。
12. 取下铝箔，将板放入板式离心机中。
13. 在 40 °C 条件下以 1000 × g 离心 15 分钟。检查转子温度，应处于室温状态。
14. 离心过程中，准备一个冰盘：将冰面压平，以便板可平稳放置。
15. 离心结束后取出板，置于冰上，并用铝箔覆盖冰盘或板面。冰上静置 10 分钟。
16. 将板从冰上取出，连同铝箔一起置于室温下稳定 20 分钟。
17. 每孔加入 1 至 1.5 mL 透明化溶液，用铝箔覆盖，于室温避光条件下静置至少 48 小时以实现光学透明。
    注意：切勿将板储存于 4 °C。LMPA 可能收缩、从孔底脱离并漂浮于透明化溶液中。建议在透明化后一周内完成成像。

5. 成像

1. 使用共聚焦转盘显微镜，选择至少30倍的物镜。
2. 保留透明化溶液，因其可均一化折射率，使三维成像更易于进行。
3. 通过选择DAPI通道来定位类球体，以避免其他荧光染料发生漂白。
4. 使用Z轴层扫功能采集图像。选定类球体的顶部和底部，并将光学切片间距设为10 µm。
   注：图像采集与图像分析在CRBS、PIC-STRA UMS 38、Inserm、Unistra的成像平台完成。

结果

为了评估标记和光学透明化的有效性，多个模型经过相同处理后被固定（图1）。根据上述方法，培养了含有1个IEC与20个β细胞以及1个IEC与50个β细胞比例的类球体。值得注意的是，1个IEC与20个β细胞的比例接近人类胰岛中细胞的比例。使用台盼蓝染色破裂的类球体证实，这些类球体在96小时内保持细胞活力（80–90%的活细胞）。这一观察结果对于研究异种胰岛移植背景下由IBMIR细胞因子诱导的渐进性细胞改变以及细胞保护剂的鉴定具有重要意义。

由于细胞因子应激的后果之一是肠内分泌细胞（IEC）形态和功能的改变，这可能影响β细胞的存活和胰岛素功能，因此我们进一步证实了使用GLP-1类似物度拉糖肽对细胞因子诱导的应激进行三维药理学调控的可行性。在先前的实验中，已证明度拉糖肽对经TGFβ-2或IL-1β诱导应激的IEC单层细胞具有细胞保护作用¹²。

该研究旨在解决三个不同的问题：该方案是否 1）能够在即使经历应激或药物处理后，仍不破坏模...

讨论

已开发出一种包含MS-1小鼠肠内分泌细胞（IEC）和小鼠β细胞β-TC6的类球体模型，可模拟胰岛的三维结构。该模型适用于分析72小时内应激诱导的肠内分泌细胞功能障碍及其对β细胞存活率和功能的影响，与胰岛移植研究密切相关。重要的是，该由小鼠细胞构成的类球体具有同质性，并具备相关的胰岛内皮细胞谱系特征。

一项重要成果是开发并验证了一种用于收获、染色和光学透明化小型类球体（150–200 µm）的实验方案，该方案解决了三维成像中的多项挑战，包括增强染料渗透性、利用低熔点琼脂糖（LMPA）提供结构支撑，以及采用CUBIC光学透明技术在保持细胞完整性的前提下实现更优的成像效果。该方案的有效性已在不同肠内分泌细胞（IEC）与β细胞比例（1:20 和 1:50）的类球体以及分离的人胰岛组织中得到验证。

均匀染色、精确的细胞群边界划分、细胞间相互作用的保留以及在人胰岛中的成功应用，凸显了该方法的多功能性。本研究揭示了类球体内部细胞分布与功能的特征，包括在1:20模型中肠上皮细胞（IEC）和β细胞的均一分布、人胰岛中微血管形态的可视化，以及NT...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ- 24孔黑色培养板，内径14 mm	IBIDI	82426
AggreWell 800（24孔）	干细胞	34815
抗黏附冲洗液	干细胞	7010
抗CD31抗体 [P2B1]	abcam	ab24590	终浓度 2.2µg/mL
抗整合素 β1 抗体，克隆 MB1.2	默克	MAB1997	终浓度 1.43µg/mL
细胞培养瓶，T-75，表面，表面 细胞+，滤帽	Sarstedt	83.3911.302	β-TC6 细胞培养
细胞培养瓶，T-75，表面：标准型，双位置螺旋盖	Sarstedt	83.3911.02	MS-1 细胞培养
DAPI 二盐酸盐	赛默飞世尔科技	D1306	终浓度 2µg/mL
二甲基亚砜	Sigma	D8418-250ML
DMEM，高糖，GlutaMAX™ 补充剂，丙酮酸盐	赛默飞世尔科技	31966047
度拉鲁肽
度拉糖肽	Lilly	Trulicity 1.5 mg 笔式注射器
胎牛血清	Biowest	S1810-500
甘氨酸	Sigma	G7126-1KG
山羊抗豚鼠IgG（H+L）高效交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555	赛默飞世尔科技	A21435	终浓度 2µg/mL
山羊抗小鼠 IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488	赛默飞世尔科技	A-11029	终浓度 2µg/mL
山羊抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 633	赛默飞世尔科技	A-21071	终浓度 2µg/mL
山羊抗大鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 555	赛默飞世尔科技	A21434	终浓度 2µg/mL
山羊血清	Sigma	S26-100ML
不含钙的HBSS &和镁  &&酚红	Corning	21-022-CV
胰岛素 (C27C9) 兔单克隆抗体	细胞信号传导	3014S	终浓度 0.66µg/mL
分离的人胰岛	欧洲中心é糖尿病研究中心（CeeD）		Karim Bouzakri博士惠赠。临床级，按指南分离。
低凝胶温度琼脂糖	默克	A9414-10G
MS-1 细胞	ATCC	CRL-2279
4% 多聚甲醛溶液，溶于1×磷酸盐缓冲液	Fischer Scientific	15670799
PBS 10x	Euromedex	ET330-A	用实验室级超纯水稀释至1倍浓度
青霉素-链霉素	PAN Biotech	P06-07100
多克隆豚鼠抗小鼠NTPDase3抗体	mN3-1CI4；mN3-2C(I4,I5)；mN3-3C(I4,I5)	https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.php	稀释比例 1:1000
Quadrol/N,N,N′，N′四(2-羟丙基)乙二胺	Sigma	122262-1L
转盘式 Olympus IXplore SPIN	奥林巴斯科学解决方案
分子生物学用蔗糖	Sigma	S0389-1KG
Triton X-100 Bioquality 实验室级	Euromedex	2000-A
胰蛋白酶/EDTA（10倍浓缩液）	PAN Biotech	P10-025100
Tween-20	Euromedex	//
尿素	Sigma	U-5128
β-TC6 细胞	ATCC	CRL-11506