方法文章

鉴定 分枝杆菌属 通过DNA微阵列芯片方法鉴定物种

DOI：

10.3791/68234

⸱

2025年6月24日

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍一种用于鉴定分枝杆菌属（Mycobacterium）物种的DNA微阵列芯片方法，该方法将提高相关疾病在临床应用中的诊断准确性和效率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究介绍了一种用于准确鉴定的DNA微阵列芯片方法 分枝杆菌 物种。通过利用不对称PCR扩增和杂交原理，该方法可靶向17种常见分枝杆菌，包括分枝杆菌属中的 结核分枝杆菌 复杂的多种非结核分枝杆菌。该检测适用于多种临床标本，如痰液、脓液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液以及疑似分枝杆菌感染患者的穿刺液。该检测通过扩增目标序列实现 分枝杆菌属 通过不对称PCR扩增基因组，随后与微阵列芯片上的探针进行杂交。独特的探针布局（在12行×10列的微阵列中重复5次）以及对照探针的使用提高了该方法的可靠性。对1,724份样本开展的临床试验表明其具有优异的性能。除两种超出检测范围的罕见非结核分枝杆菌样本外，该方法与测序结果相比，临床特异性、敏感性和总体一致性均达到100%。该DNA微阵列芯片方法较传统诊断技术有显著改进，可缩短诊断时间并实现更全面的检测，因此在分枝杆菌疾病的诊断与管理中具有重要应用潜力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium 是一个细菌属，包含多种对人类和动物健康具有重要意义的生物体。Mycobacterium tuberculosis 是结核病（TB）的致病菌，长期以来一直是全球公共卫生的重大威胁。尽管在预防和治疗方面已进行了数十年的努力，结核病仍然是一个重大的公共卫生问题，每年在全球范围内导致大量死亡和新发感染1，2。非结核分枝杆菌（NTM）作为重要病原体也日益受到关注，尤其在特定患者群体和环境条件下。

准确鉴定Mycobacterium（分枝杆菌）物种是有效疾病管理的基石3,4。传统的诊断方法存在固有局限性。基于培养的技术曾长期依赖，但众所周知耗时极长。分离和培养分枝杆菌的过程可能需要数周至数月，在此期间患者可能经历疾病进展并存在传播给他人的风险。此外，某些分枝杆菌物种极难培养，易导致假阴性结果，从而造成治疗延误或错误5,6。

抗酸染色是另一种常用的方法，可根据分枝杆菌独特的细胞壁特性（即抵抗脱色的能力）来识别分枝杆菌。然而，该方法缺乏区分不同Mycobacterium物种的特异性，仅能提供分枝杆菌存在的大致提示7。为克服上述部分局限，分子检测方法（如聚合酶链式反应（PCR））已逐渐发展起来。PCR 比培养方法能更快速地检测分枝杆菌 DNA，从而实现更快速的诊断。然而，传统的 PCR 检测通常仅针对有限数量的基因，可能无法提供全面的物种鉴定，尤其是在处理亲缘关系较近的Mycobacterium物种时5。

DNA 微阵列技术彻底改变了微生物学和诊断领域。该技术能够同时分析多个基因靶标，从而更全面、更详细地揭示微生物群落的特征8,9。该领域的最新研究进一步阐明了先进分子技术在Mycobacterium鉴定中的潜力与重要性。例如，Wang 等人的一项研究10证明，在临床环境中，改良后的 DNA 微阵列芯片在检测罕见Mycobacterium物种时具有更高的灵敏度和特异性。他们的研究结果强调了持续优化微阵列技术的重要性。Wang 及其同事的另一项研究11则聚焦于将 DNA 微阵列数据与结核病患者的临床结局相结合。研究结果揭示了准确鉴定Mycobacterium物种在预后评估中的价值，以及实现个体化医疗的潜力。

测试原理
该试剂盒采用DNA微阵列芯片技术，结合不对称聚合酶链式反应（PCR）扩增与杂交原理，用于鉴定 分枝杆菌属 物种。该试剂盒包含一个 分枝杆菌 物种鉴定芯片和不对称PCR扩增试剂。该芯片固定有物种特异性探针，用于检测和鉴定 分枝杆菌属 物种。检测目标包括17种临床上常见的物种或菌群，例如 结核分枝杆菌 复合物， 鸟分枝杆菌, 鸟分枝杆菌，戈登分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，偶发分枝杆菌，瘰疬分枝杆菌，黄分枝杆菌，土分枝杆菌，龟分枝杆菌 和 脓肿分枝杆菌，草分枝杆菌，非色素分枝杆菌，海分枝杆菌 和 溃疡分枝杆菌，灿烂分枝杆菌，苏氏分枝杆菌 和 Mycobacterium malmoense，Mycobacterium xenopi 和 Mycobacterium smegmatis

这17种的检测 分枝杆菌 物种的准确鉴定对于临床诊断和个体化患者管理至关重要。 结核分枝杆菌 复合群（MTBC）因其在结核病中的重要作用而被列为优先处理对象，需立即进行隔离并采用多药联合治疗，以控制传播并应对耐药性问题。属于该复合群的物种 鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌 复合物（MAC），例如 M. avium 和 M. intracellulare，主要影响免疫功能低下者（如 HIV/AIDS 患者）或患有慢性肺部疾病的人群，需采用基于大环内酯类药物的长期治疗方案。快速生长的 分枝杆菌 （RGMs）如 M. abscessus 和 M. fortuitum 以抗生素耐药性著称，常引起严重的皮肤、软组织或肺部感染，需采用手术与靶向抗生素（如阿米卡星、大环内酯类）联合的强化治疗方案。环境来源的物种，例如 M. gordonae 或 M. smegmatis 是常见的污染物，但在特定情况下可能引起机会性感染，因此需要谨慎进行临床相关性分析，以避免不必要的治疗。诸如 M. marinum （与水生暴露相关）以及 M. ulcerans （导致布鲁里溃疡）具有不同的流行病学生态位，可指导暴露史评估。罕见但具有临床意义的物种（例如， M. szulgai, M. malmoense模拟 结核病 且需要针对特定物种的治疗方案。准确鉴定至关重要，因为治疗时长和药物选择（例如利福平敏感性） M. kansasii 与非结核分枝杆菌的固有耐药性相比，其预后差异显著。分子诊断和抗菌药物敏感性试验对于优化治疗结局至关重要，尤其是在免疫功能低下人群或复杂感染中。

首先，通过不对称PCR扩增Mycobacterium基因组中的目标序列。然后，将扩增产物与芯片上的探针进行杂交。如果样本中存在目标Mycobacterium，扩增产物将特异性地结合到芯片上对应的探针。最后，通过扫描芯片上的杂交信号，即可确定样本中Mycobacterium的种类。

利用基因芯片微阵列技术，将用于检测上述基因的特异性探针以及多种对照探针固定在基底上。每个检测探针和对照探针均重复5次，构成一个12行×10列的微阵列。探针排列方式如图1所示。每张芯片包含四个相同的微阵列，每个微阵列可检测一个样本。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究经福建医科大学附属泉州市第一医院伦理委员会批准（批准号：2024-K035）。在采集临床标本前，已从所有患者处获得知情同意。研究人员已向患者说明研究目的、涉及的程序，以及其可在不影响医疗照护的前提下随时退出研究的权利。

1. 样本要求

注意：当采集临床疑似结核病和非结核分枝杆菌（NTM）疾病患者的样本以使用本试剂盒进行检测时，请遵循以下步骤：

  1. 采集患者的样本，如痰液、脓液或分泌物、支气管肺泡灌洗液、穿刺液（包括脑脊液、胸腔积液和腹腔积液、心包液、关节液及胆汁）以及尿液。
    1. 对于痰液样本：
      1. 指导患者早晨用清水漱口后，咳出深部痰液至无菌样本保存容器中，密封后送检。
      2. 加入1–2倍体积的4% NaOH，振荡并充分混匀。
      3. 15–20分钟后，加入等体积pH 6.8的磷酸盐缓冲液，混匀。
      4. 室温下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。用移液器加入1 mL 0.9% NaCl，充分混匀，用于检测。
    2. 对于脓液或分泌物样本：
      1. 用无菌生理盐水冲洗表面，用无菌拭子采集脓液或分泌物，密封后送检。
      2. 加入3倍体积的4% NaOH，充分振荡混匀。
      3. 室温静置20分钟（期间手动振荡2次），室温下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。用移液器加入1 mL 0.9% NaCl，充分混匀，用于检测。
    3. 对于支气管肺泡灌洗液：
      1. 通过保护性支气管肺泡灌洗（PBAL）管注入10–20 mL生理盐水。
      2. 用负压吸引将样本收集至无菌瓶中，送检。
    4. 对于脑脊液：
      1. 采用无菌技术采集至少2 mL样本。
      2. 室温下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。用移液器加入1 mL 0.9%氯化钠溶液，充分混匀后用于检测。
    5. 对于尿液样本：
      注：建议使用早晨首次大量尿液或中夜至晚夜尿液。也可通过导尿方式收集尿液。
      1. 将样本收集于无菌容器中，让收集的尿液静置4–5小时。
      2. 室温下以2,000 × g离心15分钟，弃去上清液。用移液器加入1 mL 0.9%氯化钠溶液，充分混匀，用于检测。
  2. 样本保存
    注：固体培养基上的样本不应冷冻保存，因冷冻可能影响后续操作。
    1. 液体培养基中的样本可在-70 °C保存，保存时间不超过5年。
    2. 所有样本在2–8 °C保存时间不得超过2个月。
  3. 样本运输
    1. 运输检测分离样本时，必须使用符合生物安全要求的密闭容器，并在法规允许的条件下进行。

2. 实验准备

  1. 芯片洗涤液的配制
    注意：根据芯片数量配制芯片洗涤液 I 和芯片洗涤液 II。所需体积应确保洗涤过程中芯片能够完全浸没。混合均匀后平衡至室温（10–30 °C）。最终 SSC 浓度为 2x，SDS 最终浓度为 0.2%。
    1. 配制芯片洗涤液 I：按 10:88:2 的比例依次将 20x SSC、蒸馏水（或纯化水）和 10% SDS 混合，配制成芯片洗涤液 I。例如，配制总体积为 600 mL 时，先量取 60 mL 的 20x SSC 和 528 mL 的蒸馏水（或纯化水），置于 1 L 烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀；然后加入 12 mL 的 10% SDS，再次充分混匀。
    2. 配制芯片洗涤液 II：最终 SSC 浓度为 0.2x。将 20x SSC 与蒸馏水（或纯化水）按 1:99 的比例混合，得到芯片洗涤液 II。以配制总体积 600 mL 为例，量取 6 mL 的 20x SSC 和 594 mL 的蒸馏水（或纯化水），置于 1 L 烧杯中，混合均匀。
      注意：若 10% SDS 溶液出现白色絮状沉淀，可在 50 °C 加热，充分混匀后再配制微阵列洗涤缓冲液。若洗涤缓冲液 I 出现白色絮状沉淀，也需在 50 °C 加热并彻底混匀，冷却至室温后方可使用。
  2. 准备 350 mL 冰水混合物。
  3. 准备好蒸馏水（或纯化水）。

3. 仪器和材料的准备

  1. 仪器选择与设置
    1. 确定并准备基因芯片扫描仪，确保其已校准并处于可用状态。
    2. 设置核酸提取仪，检查其功能并加载必要的试剂。
    3. 将杂交盒（Hybridization box）基因芯片杂交盒放置在适当位置，并确认其工作状态正常。
  2. 移液工具准备
    1. 准备规格为 0.1–10 µL、2–20 µL 和 20–200 µL 的微量移液器，以及相应洁净且无菌的移液器吸头。确保移液器已准确校准，吸头安装妥当。
  3. 辅助设备布置
    1. 准备恒温水浴锅，并将其设定至所需温度（50 °C）。
    2. 放置可离心 1.5 mL 离心管的微型离心机，并检查其平衡状态和转速设置。
    3. 在离心管架上整理洁净且无菌的离心管（200 µL 和 1.5 mL），以及可选的洁净且无菌八联管条（200 µL）。
  4. 样本处理设备准备
    1. 将恒温振荡器放置在方便操作的位置，并设置适当的振荡参数。
    2. 准备两个用于清洗芯片的容器，并确保其清洁干燥。
    3. 摆放载片架和离心机，并准备好用于离心和干燥芯片的容器。
  5. PCR 扩增仪准备
    1. 开启 PCR 扩增仪，并根据实验方案进行程序设置，确保其可执行扩增反应。

4. 核酸提取

注意：在样本制备区域进行操作，并遵循以下步骤：

  1. 准备
    1. 向核酸提取管中加入 80 µL 核酸提取液，并加入 1 mL 0.9% NaCl。
  2. 分离株样本的采集
    1. 开始样本采集前，需检查样本来源，确认其来自固体培养基还是液体培养基。
    2. 采集固体培养基样本时，使用无菌接种环从合适的固体培养基上挑取一个可见菌落。若细菌已生长至覆盖整个培养基表面，则挑取相应量的菌苔。小心将其放入含有核酸提取液的核酸提取管中，注意尽可能避免带入固体培养基。
    3. 对于液体培养基样本，用移液器吸取浊度等于或高于 1 McFarland 标准的细菌悬液 10–20 µL，注入含有核酸提取液的核酸提取管中。
      注意：无论来自固体或液体培养基，样本采集完成后即可进行后续的核酸提取操作。
  3. 核酸提取
    1. 将上述步骤 1.1 中预处理后的标本或分离株样本加入后，使用核酸快速提取仪进行核酸提取。提取后的核酸可暂时存放于 -20 °C。
      注意：作为提取效率的指标，自动提取仪可提取病毒核酸载量高于 100 拷贝/mL 的样本。临时保存时间不应超过 2 个月。

5. PCR 扩增

  1. PCR反应体系的制备
    1. 在试剂储存与准备区域，根据待检测样本的数量准备200 µL离心管或八联管，并预先标记样本编号。从试剂盒中取出PCR扩增试剂，使其自然解冻并完全融化，轻轻振荡混匀，然后快速离心，使试剂全部聚集于管底。
    2. 根据样本数量，将PCR扩增试剂以每管18 µL的体积分装至200 µL离心管或八联管中。盖紧管盖后，转移至扩增反应体系配制与扩增区域。
    3. 在样本制备区域，向各管中加入2 µL模板DNA（待测样本的DNA（即核酸提取管中的上清液）、阳性对照品或阴性对照品），确保每个PCR反应体系总体积达到20 µL。
      注意：每次扩增时均需使用阳性对照品和阴性对照品。阳性对照品可用于PCR扩增及杂交过程的质量控制，阴性对照品可用于监测环境及操作过程是否存在污染。
  2. 扩增
    1. 将含有反应体系的离心管或八联管放入PCR扩增仪中，确保仪器已预热至所需温度。按照以下热循环程序进行PCR扩增反应：94 °C预变性600 s（1个循环）；随后进行35个循环：94 °C变性30 s、60 °C退火30 s、72 °C延伸40 s；72 °C最终延伸420 s（1个循环）；4 °C保存（1个循环）。

6. 芯片杂交

注意：在 PCR 扩增反应结束前，执行以下操作：

  1. 将恒温水浴锅的温度设置为 50 °C 并预热。
  2. 芯片的准备
    1. 向基因芯片杂交盒底部加入 200 µL 蒸馏水（或纯化水，如图 2A所示）。将支架置于盒内两个定位柱之间。
    2. 小心地将芯片正面朝上放置在支架上，并将盖玻片四角的凸起朝下覆盖在芯片上（如图 2B所示）。
      注意：确保盖玻片放置方向正确，使其末端与芯片末端的标签对齐。
  3. 杂交反应体系的配制、变性与冷却
    1. 根据样本数量准备相应数量的 200 µL 离心管或八联管，并做好标记。
    2. 从试剂盒中取出杂交缓冲液，在 50 °C 下加热至完全融化。充分混匀后，在微量离心机中快速离心。将 9 µL 杂交缓冲液分装至每个已准备好的 200 µL 离心管或八联管中。然后向每管中加入 6 µL 对应的 PCR 产物，使每份杂交反应体系总体积为 15 µL。
    3. 将杂交反应体系（包括杂交缓冲液和 PCR 产物）在 95 °C（使用 PCR 仪或水浴）加热变性 5 分钟。取出上一步已完成变性处理的杂交反应体系，立即放入冰水混合物中冷却 3 分钟。
  4. 杂交反应
    1. 从冰浴中取出杂交反应体系，用移液器轻轻吹打 2 次以混匀。待白色絮状沉淀（如有）完全消失后，通过盖玻片上的加样孔加入 13.5 µL 杂交反应体系（如图 2C所示），迅速盖上杂交盒并密封（如图 2D所示）。记录芯片编号、微阵列位置及对应的样本编号。
      注意：每个微阵列只能加入一个样本。
    2. 立即将密封好的杂交盒水平放入已预热至 50 °C 的恒温水浴锅中。待所有杂交盒放入后，开始计时 120 分钟。
      注意：加样过程中应避免产生气泡。从开始加样到芯片干燥前的所有步骤中，应避免芯片微阵列表面的液体长时间直接暴露于空气中，以防因干燥导致背景过高而干扰结果判读。
  5. 芯片的洗涤与干燥
    1. 杂交反应完成后，水平取出杂交盒，拆开并取出芯片进行洗涤。立即将芯片放置于盛有已平衡至室温（10–30 °C）的芯片洗涤液 I 的容器（如烧杯）中的载玻片架上，在恒温摇床上以 80–100 rpm 的速度于室温洗涤 3 分钟。
    2. 用已平衡至室温的芯片洗涤液 II 在恒温摇床上以 80–100 rpm 的速度于室温洗涤芯片 3 分钟。
    3. 将芯片放入离心机中，在室温下以 100 × g 离心 5 分钟。干燥后进行扫描。
      注意：避免芯片之间发生碰撞或摩擦。

7. 芯片扫描与结果解读

注意：使用微阵列芯片扫描仪及相应软件读取信号并解读结果。异常结果及故障排除请参见表1。操作步骤如下（请同时参考扫描仪和软件的用户手册）。

  1. 打开扫描仪及相应软件，然后点击 激光控制 按钮，使其预热 10 分钟。
  2. 输入与样品相关的各类信息，例如 样品编号。
  3. 扫描仪完成预热后，点击 弹出 按钮，将芯片平稳放置在小支架上，轻轻水平推入扫描仪仓的开口中，然后点击 加载 按钮。
  4. 输入芯片编号，点击选择 检测区域（微阵列 1-4），然后点击 选择样品，为每个微阵列选择对应的样品。接着点击 开始检测 按钮进行芯片扫描。扫描结果将显示在屏幕上并自动保存。
  5. 完成一张芯片的扫描后，重复步骤 7.3 和 7.4 以扫描下一张芯片。依此流程操作，直至所有芯片扫描完毕。
  6. 使用 数据查询 页面进行数据查询和打印操作。
  7. 完成所有操作后，先关闭激光，再退出软件，最后关闭扫描仪。

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结果

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阳性结果
对于Mycobacterium属（内参，IC）和Mycobacterium tuberculosis的探针，其阳性结果阈值通过受试者工作特征（ROC）曲线法确定；而对于用于检测其他16种非结核分枝杆菌（NTM）的探针，其阳性结果阈值则通过百分位数法确定。

实验质量控制
阳性对照品的检测结果应为“Mycobacterium tuberculosis 复合群”（如图3A所示）；阴性对照品的检测结果应为“无Mycobacterium”（如图3B所示）。若任一对照品的结果不符合预期，则该次实验中所有样本的结果均视为无效，需重新检测。

结果解读说明
将探针的信号值与其阳性结果值进行比较。如果探针的信号值大于或等于其...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍的DNA微阵列芯片方法可直接检测疑似结核病和非结核分枝杆菌病患者的临床标本（包括痰液、脓液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液和穿刺液）中的核酸，显著缩短确诊所需时间。本研究提出的DNA微阵列芯片方法在分枝杆菌属（Mycobacterium）物种鉴定方面具有重要意义，相较于传统方法及部分现有分子诊断技术具有多项优势12。

该方法的一个关键优势在于能够同时靶向17种常见的分枝杆菌。这种广谱检测能力在临床环境中至关重要，因为结核病与非结核分枝杆菌病之间的鉴别诊断往往具有挑战性。通过在不对称PCR中使用特异性PCR引物和荧光标记探针，该方法可生成高度特异性的DNA片段，能够与芯片探针有效杂交。基于精确碱基配对原则的杂交过程，可实现准确的菌种鉴定（见表3）。这对于确保结果的有效性以及提供内置的质量控制机制至关重要。与耗时较长且在检测某些Mycobacterium菌种时可能存在局限性的培养方法相比，DNA微阵列芯片方法可直接用于临床标本的检测，...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由福建省自然科学基金项目（2024J011521）和泉州市科技计划项目（2024NY006）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液 (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Applied Biosystems 扩增仪Thermo Fisher ScientificVeriti 96-孔热循环仪
CapitalBio LuxScan10K/BCapitalBioLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 CapitalBioSlideWasher 24 
 离心机 Eppendorf5424R最大转速 15000 min-1
杂交缓冲液
HybSet 基因微阵列芯片及盖片
分枝杆菌菌种鉴定试剂盒CapitalBio301030
阴性对照、阳性对照
核酸提取仪TIANLONGGeneRotex 96
PCR 扩增试剂
pH 6.8 磷酸盐缓冲液上海源叶生物科技有限公司R20029-10
移液器及吸头Thermo Scientific0.1 - 10 μL, 2 - 20 μL, 20 - 200 μL, 100-1000 μL
qEx-DNA/RNA 核酸提取或纯化试剂盒TIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSCapitalBio441060
氢氧化钠(NaOH)XILONGS  ScientificXK13-011-00027
SSCCapitalBio441050
恒温水浴箱SURUIHH-W600

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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PCR

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