本文描述了一种基于磷酸化流式细胞术的方法，用于分析移植到小鼠体内并从骨髓穿刺液中获取的人急性髓系白血病细胞中 mTORC1、JAK/STAT5 和 MAPK 信号通路下游的信号传导。利用新一代光谱流式细胞仪，可同时高灵敏度地检测 p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6 和 p-ERK1/2 的水平。
本文内容
摘要
摘要
为了适应并抵抗已批准的治疗方案，急性髓系白血病（AML）细胞会激活特定的分子通路，从而导致基因表达、蛋白质水平和活性发生变化。本方案报告了一种用于探索AML中癌基因信号通路下游被磷酸化的靶点的方法：p-STAT5（Tyr694）、p-4EBP1（Thr37/46）、p-RPS6（Ser240/244）和p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）。该方法可用于评估一种或多种待测化合物对来自活体小鼠骨髓细胞中这些通路的调控作用，这些细胞在治疗前后通过穿刺抽吸获取。相比破坏骨骼的方法，这种微创技术能更好地保持细胞完整性并减少应激反应，后者可能造成细胞损伤并影响实验结果。为优化用于流式细胞术分析的细胞内抗体染色，本研究建立了以多聚甲醛固定和甲醇透化为基础的实验流程。该方法可确保高精度染色并最大限度降低背景噪声，从而实现对细胞内信号标志物的可靠检测。本方案的主要优势之一是构建了一个多参数抗体组合，可在同一样本中同时评估上述四条通路。利用高灵敏度的下一代光谱流式细胞仪，可观察到不同处理条件下通路激活状态的动态变化，并与同一小鼠治疗前的基线水平进行比较。该方法能够在无需处死动物的情况下，对患者来源的异种移植小鼠骨髓样本中的信号通路调控进行精确的体内分析，为理解AML细胞的适应性机制提供了 宝贵见解，并有助于指导针对这些通路、旨在克服耐药性的治疗策略的评估。
引言
急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓和外周血中未成熟髓系前体细胞的积聚。这种积聚会破坏正常的造血功能，导致危及生命的血细胞减少症及全身性并发症。尽管化疗方案、靶向治疗和造血干细胞移植方面的进展已使部分患者的预后得到改善，但总体而言，5年生存率仍维持在约30%，在老年患者或具有不良遗传特征的患者中预后更差1。AML治疗中的一个重大挑战是药物耐药性的频繁出现，这会导致疾病复发和治疗失败2。因此，深入理解驱动AML进展和治疗耐药的分子与细胞机制显得尤为重要。
为应对这一挑战，本文提出了一种新的方法，将骨髓穿刺与多重细胞内磷酸化流式细胞术相结合，为研究急性髓系白血病（AML）患者来源的异种移植（PDX）模型中的细胞内信号通路提供了有力工具（图1A，B）。尽管PDX模型中的骨髓穿刺此前已有报道3，但本方案已优化，以更好地保存白血病细胞用于磷酸化流式分析。该方法的总体目标是提供一种微创操作，可在白血病进展及治疗反应过程中进行纵向应用，并实现单细胞分辨率。通过允许对同一动物进行多次取样，该技术能够更准确地反映疾病在治疗过程中的演变情况。开发该技术的理论基础在于需要对AML细胞内的信号传导进行高分辨率、动态的评估。传统方法（如Western blotting）需要大量细胞，缺乏单细胞分辨率和多重检测能力4。相比之下，磷酸化流式细胞术可保留细胞异质性，并能够在不同的白血病亚群中同时检测多种磷酸化信号蛋白5，从而为AML治疗过程中信号通路的激活提供关键见解。
急性髓系白血病（AML）的生物学核心在于调控细胞增殖、存活及代谢适应的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通路以及Janus激酶/信号转导与转录激活因子5（JAK/STAT5）信号通路。这些通路除了在白血病细胞增殖和存活中发挥重要作用外，还关键性地参与干性维持、免疫逃逸以及对氧化应激和代谢应激的适应等重要致癌过程4。除了促进细胞生长和存活外，这些通路之间的相互串扰协调了转录、翻译和细胞代谢等关键过程，使AML细胞能够在治疗干预下仍维持其生长并抵抗凋亡信号6,7（图1A）。
MAPK 信号通路包含 p-ERK1/2（细胞外信号调节激酶 1/2）等关键效应分子，在整合生长因子和细胞因子等细胞外信号以调控细胞增殖与存活中发挥关键作用。ERK1/2 的激活通过 RAS（大鼠肉瘤病毒癌基因同源物）-RAF（快速加速成纤维肉瘤）-MEK（MAPK/ERK 激酶）-ERK 级联反应实现，其中 RAS-GTP 招募 RAF，进而依次磷酸化 MEK1/2 和 ERK1/2 的 Thr202/Tyr204 位点。磷酸化后的 ERK1/2 形成二聚体并转位至细胞核，在核内磷酸化 MYC (Myelocytomatosis viral oncogene homolog)、ELK1（ETS 类似蛋白-1）和 AP-1（激活蛋白-1）等转录因子，促进细胞增殖、分化阻滞和存活8。在急性髓系白血病（AML）中，FLT3（类 Fms 酪氨酸激酶 3）、RAS 或 KIT 基因的突变常导致 ERK 持续性激活9,10（图 1A）。
FLT3、RAS 或 KIT 基因的突变也会导致 mTORC1 信号通路的上调，通过支持代谢重编程、蛋白质合成调控、核糖体生物合成和自噬等致癌过程，促进急性髓系白血病（AML）的生长并产生治疗耐药性11。mTORC1 通过调控 mRNA 翻译，促进致癌蛋白及其他对 AML 进展至关重要的因子的生成。mTORC1 的一类关键底物是 4E-BP 蛋白（真核起始因子 4E 结合蛋白）。在低磷酸化状态下，4E-BP 与 eIF4E（真核起始因子 4E）结合，抑制帽依赖性翻译。mTORC1 在 Thr37/46 位点对 4E-BP1 进行磷酸化，促使 eIF4E 释放，从而启动关键致癌 mRNA（如 MYC、CCND1（Cyclin D1） 和 MCL-1（Myeloid cell leukemia 1））的翻译，促进白血病细胞的增殖与存活8,12。此外，mTORC1 下游的 S6K1（核糖体蛋白 S6 激酶 β-1）介导的 RPS6 在 Ser240/244 位点的磷酸化 ，可增强核糖体的生物合成和 mRNA 翻译，增加代谢适应、应激抵抗和快速增殖所必需的蛋白质合成8,13。值得注意的是，mTORC1 活性与代谢适应密切相关，这是 AML 细胞在治疗压力下采用的关键生存策略13,14,15（图 1A）。
JAK/STAT5 通路是急性髓系白血病（AML）中的另一条关键信号轴，尤其在存在影响细胞因子受体或信号转导分子（如 JAK2、FLT3 和 CALR（钙网蛋白））突变的病例中更为显著16,17。STAT5 可响应通过 FLT3 和 JAK2 等受体传递的细胞因子信号而被激活。配体结合后，相关的 Janus 激酶（JAKs）在 Tyr694 位点对 STAT5 进行磷酸化。磷酸化的 STAT5 形成二聚体并转位至细胞核，在核内结合特定的 DNA 序列，调控参与细胞存活、增殖和分化的基因转录8。在 AML 中，STAT5 的组成性激活（通常由 FLT3 或 JAK2 的突变引起）导致促进白血病发生的基因持续表达18（图 1A）。
除了各自的独立作用外，这些通路还共同调控转录和翻译过程，从而以促进急性髓系白血病（AML）细胞存活和耐药性的方式重塑其蛋白质组。特别是，mRNA翻译正逐渐被视为AML病理生理学中的一个关键因素，因为它能够快速生成致癌蛋白和应激反应因子，使AML细胞能够适应环境挑战并逃避靶向治疗的影响。翻译机制的失调，例如真核起始因子（eIFs）或核糖体蛋白的异常，已被证实与AML的治疗耐药性和不良预后相关19。深入研究MAPK、mTORC1以及JAK/STAT5通路在转录和翻译调控中的作用，对于全面理解AML进展和耐药背后的分子机制至关重要。这些认识对于发现新的治疗反应生物标志物以及设计靶向这些通路以克服耐药性的新型治疗策略具有重要意义。本文提供了一项专门设计用于在AML患者来源的异种移植（PDX）模型中研究这些信号网络的实验方案。
该方案的一个关键优势在于将骨髓穿刺与细胞内磷酸化流式细胞术相结合，从而能够对急性髓系白血病（AML）患者来源的异种移植（PDX）模型中信号通路的激活状态进行动态且微创的评估。这对于监测关键信号通路（如MAPK、mTORC1和JAK/STAT5）在靶向治疗下的激活状态尤为重要。这些技术的结合使得研究人员能够全面、高分辨率地理解AML的生物学特性，最终有助于开发更有效的治疗策略。
方案
以下实验均获得麦吉尔大学动物护理委员会（CIHR PJT-186019）和犹太总医院机构审查委员会（11-047）的批准。在本方案中，使用8周龄至6个月大、体重为20-30 g的雄性NOD-scid IL2Rg^null-3/GM/SF（NSGS）小鼠，这些小鼠此前已移植了来源于人类患者的急性髓系白血病（AML）细胞。本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 骨髓穿刺
警告：应遵循使用针头时的安全预防措施。
- 围手术期镇痛：在骨髓穿刺前1-4小时，皮下注射0.1 mg/kg缓释布托啡诺对小鼠进行给药。此剂量可确保术后长达72小时的镇痛效果。
- 在超净工作台内准备手术区域，放置外科垫、毛发修剪器、加热灯，以及骨髓抽吸所需的所有必要材料（25 G注射器、预先加入0.5 mL PBS并置于冰上的1.5 mL微量离心管、70%异丙醇消毒棉片）。使用胶带固定异氟烷吸入用鼻罩。图2A).
- 为每次抽吸准备两支25 G注射器，一支用于骨穿刺（"干针"）以及一个已用PBS冲洗中心以用于吸取的吸头（"冲洗过的针头").
- 使用经认证的异氟烷挥发器，按照制造商说明和兽医指南，通过吸入方式对小鼠进行麻醉。局部操作程序可能有所不同。作为参考，本方案遵循麦吉尔大学的小鼠麻醉标准操作程序20.
- 确认麻醉深度 通过 对足部夹捏无反应且肌肉松弛。在动物麻醉期间，向眼睛涂抹兽用眼膏以防止干燥。麻醉过程中持续监测呼吸频率。
- 使用毛发修剪器将进行穿刺的整条腿部区域剃净。用浸有异丙醇的消毒垫对穿刺部位（股骨）进行消毒图2B).
- 通过弯曲膝关节并用非优势手固定腿部，暴露位于此处穿刺位点的股骨关节面。将拇指置于胫骨上，示指置于股骨上，中指则稳定于两骨外侧的相应位置（图2C).
注意：使用非优势手确保腿部位置非常稳定，以防止穿刺抽吸过程中腿部移动，导致操作失败或损伤。如果腿部固定不稳，应在穿刺前重新调整手的位置并再次尝试。 - 用非优势手固定的同时，再次使用异丙醇消毒膝部区域（图2C）以移开残留的毛发，从而改善骨结构的可视化效果。
- 使用第一支干燥的25 G注射器，在股骨关节面中央位置插入并轻轻旋转（切勿用力），以形成一个孔洞图 2D，E确保注射器针头与股骨的长轴完全对齐（偏差0°），以正确进入骨髓腔。
注意：保持此对齐方式，以确保顺利进入，避免对周围组织造成不必要的损伤。 当针头进入股骨中段时，阻力轻微减小表明已成功穿入骨髓腔（图2F）。此步骤中应避免对针施加过大压力，以免导致位置偏移、骨折或组织损伤。采用旋转钻入动作，有助于针沿阻力最小的路径行进，从而更准确地进入股骨髓腔。当骨髓针正确置于股骨内时，即使松开持针的手，针也应保持垂直状态。 - 进入骨髓后，一边旋转一边逐渐拔出注射器（图2G）并将第二个已冲洗的注射器插入第一个针头所留下的孔中（图 2H，I).
注意：使用第二支注射器是因为在钻孔过程中，第一支注射器常被骨组织堵塞。 - 在插入股骨的注射器内施加负压，同时轻轻旋转并逐渐抽出注射器。注射器芯内应可见约10–20 µL骨髓。图 2J).
注意：如有需要，可轻轻将针头在骨内再次推进，以优化骨髓提取效果。 - 将骨髓通过冲洗注射器内容物转移至含有500 µL PBS的预冷微量离心管中（图2K). 保持在冰上，并尽快进行步骤 2-3。
- 用异丙醇棉签对穿刺部位施加轻柔压力 30 秒，以止住任何出血（图2L).
- 将小鼠放入使用加热灯预热的清洁恢复笼中。监测其呼吸和活动能力，直至小鼠清醒并完全恢复后，再将其与其他小鼠一同放入集体饲养笼中。检查是否有出血迹象。
2. 活/死细胞及表面标志物染色
注意：整个操作过程中需将细胞置于冰上。在进行步骤2和步骤3之前，预先配制抗体染色溶液的主混合液（用于步骤2.4和步骤2.7），并在4 °C避光保存。新鲜配制1.6%甲醛溶液（步骤3.1），并将100%甲醇溶液置于-20 °C保存（步骤3.6）。
- 使用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色法并结合细胞计数仪对活细胞进行计数21。
- 将相当于100万个细胞的适当体积转移至新的1.5 mL离心管中。若体积不足，则转移全部体积。 将剩余细胞合并，并分装到3个重复管（每管100万个细胞）用于同型对照染色，另取1管作为未染色对照。
- 在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。使用真空抽吸系统轻轻吸除并弃去上清液。
- 每份样品加入200 µL用PBS按1:100稀释的荧光细胞染色液，用于标记死细胞。用移液器轻轻重悬细胞。对用于同型对照染色的额外样品管进行相同操作。
- 冰上避光孵育10分钟。
- 在4°C条件下，以500 × g离心5分钟。使用真空系统轻轻吸除并弃去上清液。
- 每份样品加入100 µL用含2%胎牛血清的PBS按1:100稀释的人CD45-BUV395抗体，用于标记人造血细胞。对保留用于同型对照的额外样品管进行相同操作。
- 冰上避光孵育15分钟。随后立即进入步骤3。
3. 固定与通透处理
- 配制新鲜的1.6%甲醛/PBS溶液：每份样品加入29.5 µL的37%甲醛储备液和970.5 µL的PBS（为防止损耗，可适当多准备一些）。将1.6%甲醛/PBS溶液置于室温保存。
注意：甲醛应在化学通风橱中操作，并按照机构安全规定进行处置。 - 在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
- 用1 mL的1.6%甲醛/PBS溶液重悬细胞。
- 在室温下避光孵育10分钟。
- 在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
- 直接向管中加入1 mL预冷至-20 °C的100%甲醇。
- 在-20 °C避光孵育30分钟。
注意：此时可将固定并透化的细胞在-80 °C保存最多一个月，再进行后续分析。
4. 磷酸化流式染色
注意：以下抗体组合是使用配备以下激光器的流式细胞仪验证的：320 nm、355 nm、405 nm、488 nm、561 nm、637 nm 和 808 nm。如果使用具有不同激光器和检测器配置的流式细胞仪，应重新验证该抗体组合。
- 在市售染色缓冲液中配制抗体主混合液，按 表1 所示稀释比例，每份样本计算使用体积为 50 µL。置于 4 °C 避光保存。
- 洗涤步骤（步骤 4.8、4.10）中，将 PBS 置于冰上（每份样本使用 2 mL）。
- 在染色缓冲液中配制第二份主混合液，用于同型对照技术重复样本（表1），每份样本计算使用体积为 50 µL。置于 4 °C 避光保存。建议至少设置两个同型对照样本，以确保技术重复性。
- 将步骤 3.7 的细胞在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
注意：固定和透化处理后，细胞可能呈现更透明的外观。 - 加入 50 µL 抗体混合液（步骤 4.1）或同型对照混合液（步骤 4.2）。用移液器轻轻重悬细胞。
- 所有样本在 4 °C 避光条件下过夜孵育。
- 在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
- 用 1000 µL PBS 轻柔重悬细胞进行洗涤。
- 在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
- 再次使用 1000 µL PBS 轻柔重悬细胞进行第二次洗涤。
- 在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟。使用真空系统吸除并弃去上清液。
- 将样本重悬于 200 µL PBS 中，转移至流式细胞分析管或板中，用于流式细胞术分析（图3）。
- 按照生产商说明书（见 材料表），将每种抗体各 0.1 µL 与补偿微珠孵育，制备单色补偿对照。
结果
实验设计旨在监测所选目标蛋白在不同时间点的磷酸化状态，例如治疗开始前1天和治疗开始后15天。该基线作为关键对照，用于验证治疗后信号通路激活状态变化的真实性。经过十五天的治疗后，进行第二次比较，以评估治疗组小鼠与溶剂对照组小鼠之间的通路调控差异（图4）。这种两步法可有效区分由治疗引起的效应与基线变异。
本研究采用急性髓系白血病（AML）PDX小鼠模型。将具有以下突变特征的患者来源的AML细胞移植到小鼠体内：DNMT3AMR882H 突变的变异等位基因频率（VAF）为48%，NPM1W288fs 突变VAF为36%，FLT3ITD 突变VAF为10%，以及 IDH2R140Q 突变VAF为44%。移植后，给予三周时间使肿瘤生长，随后开始治疗。携带FLT3突变的PDX小鼠接受为期十五天的治疗，分为三种方案：安慰剂、吉列替尼（15 mg/kg，每日一次），或维奈托克（50 mg/kg，每日一次）、阿扎胞苷（2.5 mg/kg，每日一次）和cedarizudine（3 mg/kg，每日一次）联合用药（图4A）。
关于所获得的结果，值得注意的是，基于维奈托克的治疗方案显著增强了STAT5和RPS6的磷酸化水平，提示这些通路可能参与了治疗耐药性（图4E）。相比之下，靶向FLT3的药物吉列替尼并未降低突变型FLT3效应分子的磷酸化状态。在所检测的急性髓系白血病（AML）样本中，可能存在除FLT3-ITD以外的其他附加继发性突变（例如IDH2），从而促进这些通路的激活；或者两周的药物处理导致信号通路活性降低的AML细胞被选择性清除。由于所有分析的磷酸化蛋白均来自同一细胞群体，因此可对磷酸化蛋白的激活状态进行比较。在本实验中，磷酸化蛋白染色之间最强的相关性出现在p-STAT5与p-RPS6之间（Supplementary Figure 1A），二者在该实验组经治疗后均上调（图4E）。p-STAT5与p-ERK之间的关联性则较弱（Supplementary Figure 1B）。重要的是，细胞大小（通过FSC-A评估）并非总体p-STAT5阳性率的主要影响因素，表明染色阳性并非单纯由细胞大小所致（Supplementary Figure 1C）。该实验体系可全面评估这些治疗手段对信号通路调控的影响。
图1：目标信号通路及其分析策略的可视化示意图。（A）涉及 p-STAT5（Tyr694）、p-4EBP1（Thr37/46）、p-RPS6（Ser240/244）和 p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）的信号通路概览。在 p-STAT5 通路中，JAK 在配体结合后发生自磷酸化，增强其催化活性，随后磷酸化特定的酪氨酸残基，形成 STAT 蛋白的停靠位点。磷酸化的 STAT5（Tyr694）形成同源二聚体并转入细胞核，在核内结合靶基因启动子区域的特定 STAT 响应元件。在 RAS-RAF-MEK-ERK 级联反应中，FLT3 受体或其他受体酪氨酸激酶（RTKs）在配体结合后发生自磷酸化，促使 RAS 上的 GDP 被 GTP 取代，从而激活 RAS。活化的 RAS-GTP 将 RAF 招募至细胞膜，在此处 RAF 发生构象改变并被激活。活化的 RAF 随后磷酸化并激活 MEK1/2（一种双特异性激酶），后者进一步在 Thr202/Tyr204 位点磷酸化 ERK。活化的 ERK1/2 转入细胞核，磷酸化特定的转录因子。ERK1/2 还可通过中间信号通路增强 mTORC1 活性，并在特定位点磷酸化 eIF4E，从而提高翻译活性。mTORC1 在营养物质和生长因子（通过 FLT3 及其他 RTKs）刺激下被激活，磷酸化其下游靶点如 S6K1 和 4E-BP1。S6K1 进而磷酸化 RPS6，增强核糖体功能并激活翻译过程。4E-BP1 的超磷酸化使其释放 eIF4E，从而促进翻译起始复合物 eIF4F 的组装，并激活帽依赖性翻译。所有这些通路在急性髓系白血病（AML）中均高度参与，通过促进细胞增殖、代谢增强以及对凋亡信号的抵抗，推动肿瘤获得性适应。(B) 展示了骨髓穿刺与细胞内磷酸化流式染色联合实验方案的主要步骤。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：骨髓穿刺过程中关键步骤的示意图。 手术区域及所需材料均在超净工作台内准备就绪。通过吸入异氟烷进行麻醉后（A），准备股骨关节面以进行穿刺抽吸（B,C）。使用第一支注射器对准股骨中线穿刺股骨（D）。操作时应避免对针头施加过大压力，而应采用旋转钻入的方式；通常该方法足以使针头穿透骨表面并沿股骨髓腔行进。随后，通过同一穿刺点使用第二支注射器抽取骨髓（I,J）。将抽取的骨髓转移至微量离心管后（K），轻压止血（L），然后将小鼠置于温暖洁净的笼中恢复。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：包括同型对照在内的设门策略分析工作流程。（A）表示活细胞的设门策略、双联体排除以及hCD45阳性AML细胞的识别。（B）显示各磷酸化蛋白信号（棕色）及同型对照（黑色）（两个生物学重复）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：活体骨髓急性髓系白血病细胞免疫染色后细胞内磷酸化蛋白检测与分析的工作流程。 (A移植了患者来源的AML细胞的NSG-SGM3小鼠分别接受溶剂（对照组）、维奈托克、5-氮杂胞苷和cedazuridine（vene/aza/CDZ）或吉列替尼治疗。15天后，采集骨髓（BM）穿刺液并进行处理。B) 表示治疗15天后对活的急性髓系白血病细胞（例如 hCD45/Zombie-NIR 阳性细胞）进行分析的设门策略。C，D) 表示在经维奈托克/阿扎胞苷/西达他滨治疗或经载体处理的小鼠中分离出的10,000个急性髓系白血病细胞中，每种磷酸化抗体信号的标准化结果（如图所示）B）或吉列替尼或载体（C）。曲线代表从经载剂处理的对照小鼠（浅蓝色）、vene/aza/CDZ（红色）或吉列替尼（紫色）处理的小鼠中分离的急性髓系白血病（AML）细胞的信号。E) 直方图显示了在活体人类急性髓系白血病 CD45 细胞上检测的每种磷酸化蛋白染色强度的平均值变化+ 来自三只小鼠的细胞及标准差。误差线表示标准差。星号表示通过单因素方差分析（ANOVA）评估的染色强度差异具有统计学意义。 p * 表示 p 值小于 0.05，** 表示 p 值小于 0.01。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 抗体 | 荧光染料 | 稀释比例 |
| p-RPS6 (Ser240/244) | AF594 | 1/50 |
| p-4EBP1 (Thr37/46) | AF488 | 1/50 |
| p-STAT5 (Tyr694) | PE | 1/100 |
| p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) | AF647 | 1/100 |
| Rabbit IgG control | AF594 | 1/50 |
| Rabbit IgG control | AF488 | 1/50 |
| Rabbit IgG control | PE | 1/100 |
| Rabbit IgG control | AF647 | 1/100 |
表1：抗体优化稀释比例列表。
补充图1： 代表性急性髓系白血病PDX样本中p-STAT5、p-RPS6、p-ERK1/2和FSC-A的比较。该图展示了在venetoclax/5-氮杂胞苷/cedazuridine治疗第15天的小鼠“E9”中，p-STAT5、p-ERK和p-RPS6之间关系的一个示例（结果来自图4C）。在此样本中，磷酸化蛋白染色最强的相关性出现在p-STAT5与p-RPS6之间（A），两者在此实验组经治疗后均上调（图4E）。p-STAT5与p-ERK之间的关联较弱（B）。重要的是，细胞大小（通过FSC-A评估）并非总体p-STAT5阳性率的主要影响因素，这表明染色阳性并非单纯由细胞大小所致（C）。请点击此处下载该文件。
讨论
关键步骤
在通过特异性检测磷酸化蛋白来研究复杂信号通路时，使用基于免疫学的技术要求严格控制实验变量22，精细进行样品制备，并采用互补技术进行验证。整合这些实践可确保数据的可重复性、精确性和稳健性，最终有助于得出更可靠的生物学结论。这些努力不仅提高了该方法的科学严谨性，也拓展了其在细胞信号转导与调控复杂研究中的适用性。适当的麻醉和轻柔的操作对于最大限度减少生理应激至关重要，因为生理应激可能显著改变实验结果，尤其是在关注免疫反应或信号通路的研究中。确保使用恰当的镇痛方案，有助于在维持动物福利的同时，避免疼痛相关应激对实验数据的干扰。操作过程中维持无菌条件对于预防感染至关重要，因为感染可能引发炎症反应，进而干扰实验结果。这包括对器械进行灭菌、使用洁净手套，并彻底消毒穿刺部位。
在处理生物样本时，磷酸化蛋白极易受到磷酸酶的作用而发生去磷酸化22,23。为了在处理过程中保持磷酸化状态，必须立即进行固定。本研究测试了两种不同的固定/通透方法：一种为细胞固定/通透试剂盒（cytofix/cytoperm kit），另一种为本方案中所述的常用甲醛/甲醇法。其中，基于甲醇的方法获得了更清晰的结果和更强的荧光信号，因此为首选方法。固定后的样本可短期保存于 -20 °C，或长期保存于 -80 °C。实验表明，固定样本在 -80 °C 下保存长达三个月仍能获得一致的结果。对于抗体染色，建议采用过夜孵育以提高检测准确性，特别是对于细微的磷酸化变化，但具体仍取决于所研究的实验条件和药物效应。在某些情况下，也在冰上避光孵育1小时，同样获得了可接受的结果。为准确评估背景噪声，建议使用同型对照（isotype controls）作为非特异性结合的参考，如图3所示。
技术的改进与故障排除
为提高操作熟练度，我们团队的受训人员会在已实施安乐死的小鼠身上练习穿刺针插入技术，通过解剖可确认针头位置是否正确。活体动物操作由两名操作者协作完成效率最高，其中一人专注于抽吸操作，另一名助手则负责动物监测和样本处理。在极少数情况下，若经过多次尝试仍无法获得抽吸物，建议终止操作，因为每次尝试都会增加动物受伤的风险。术后对动物的监测同样重要。观察是否存在感染、疼痛或应激迹象，以确保小鼠的福利及研究结果的可靠性。饲养环境应有利于动物恢复，提供合适的垫料和营养，以尽量减少外界应激因素。
进行流式细胞术分析时，建议同时处理来自不同骨髓穿刺时间点的所有固定和保存样本。由于操作日期或操作人员不同，可能导致样本复水和染色的差异，从而影响流式细胞仪检测到的荧光灵敏度。为确保结果的一致性，在开始前应优化流式细胞仪的电压设置，使所有染色样本的信号均处于检测范围内。在本抗体组合中，Alexa Fluor 488 标记的 p-4EBP1 蛋白荧光亮度最高，可作为设定最大检测范围的可靠参考。尽管本方案中使用的抗体组合无需进行补偿调节，但具体情况可能因所使用的光谱流式细胞仪不同而有所差异。
局限性
该技术的主要局限性之一是骨髓穿刺过程中提取的细胞数量。为确保结果可靠，必须对足够数量的细胞进行染色，以分析每个样本至少约 10,000 个细胞。分析的细胞数量过少可能导致样本间出现显著差异，从而影响数据的准确性和可解释性。确保获得足够的细胞数量对于开展稳健且可重复的机制研究至关重要。
进行数据分析时，采用图3A所示的设门策略。首先，在排除双联体后，使用偶联BUV395的抗人CD45抗体鉴定目标细胞。接着，利用Zombie NIR对活细胞进行设门。最后，计算每种磷酸化蛋白的中位荧光强度（MFI）（图3B）。所有磷酸化蛋白分析所涉及的细胞均采用相同的设门策略，以确保不同急性髓系白血病（AML）细胞群之间的结果具有一致性和可比性。
该方法的另一个局限性在于可能存在背景噪声，其来源包括非特异性抗体结合、洗涤不充分、细胞自发荧光或透化处理不当。这些因素可能影响信号的特异性，并降低磷酸流式细胞术分析的准确性。对于遇到此类问题的使用者，建议增加一次洗涤步骤以降低背景噪声，并可使用Fc阻断试剂以减少非特异性结合。此外，死细胞的荧光可能干扰实验结果，因此必须使用活率染料。重要的是，为了获得准确的分析结果，所分析的细胞数量不应少于500个急性髓系白血病（AML）细胞，以确保结果的可靠性和可重复性。同时，在染色过程中也应确保使用相似数量的细胞，以保持样本间的一致性。尽管存在这些局限性，但通过仔细优化对照设置和设门策略，仍可提高该方法的可靠性。
该技术的意义
骨髓穿刺技术已有文献报道3；然而，本方案中包含了一项更新的技术，并重点说明了其两个优势：改进的固定方法以及采用双针法，以提高骨髓穿刺的精确性和一致性，避免针头被骨碎片堵塞的问题。对于纵向研究，可在同一动物的股骨上多次进行穿刺，从而为追踪个体动物随时间推移的生物学变化提供有力手段。在同一根股骨上进行多次穿刺时，建议至少间隔一个月，以确保骨骼充分愈合及骨髓再生。当使用对侧股骨进行穿刺时，一周的间隔时间已足够，可确保小鼠从镇痛和麻醉的影响中恢复，同时不会引入过度的应激或生理变异。
总体而言，这种联合的小鼠骨髓穿刺与流式细胞术技术可深入揭示在急性髓系白血病（AML）治疗耐药中发挥重要作用的关键信号通路，包括 JAK/p-STAT5、mTORC1/p-4EBP1、mTORC1/p-RPS6 和 MEK/p-ERK1/2。该技术允许对同一动物进行多次取样，从而实现对疾病进展及治疗反应在单细胞水平上的实时监测。
磷酸化流式细胞术可捕获磷酸化事件并保留细胞异质性4,23,24。这使其在研究特定白血病亚群对治疗的动态细胞反应方面具有重要价值。
未来应用
本方案为研究急性髓系白血病（AML）治疗适应机制及耐药性的产生提供了有价值的工具，有助于深入理解相关机制并推动潜在的治疗进展。未来的研究可将该方法与单细胞转录组学或蛋白质组学相结合，以进一步解析驱动耐药性和疾病进展的分子机制25。此外，将该方法应用于其他血液系统恶性肿瘤或炎症性疾病，有望拓展其在转化医学研究中的影响。
通过优化本方案并解决其局限性，该方法有望成为研究血液系统疾病中磷酸化蛋白信号转导的标准方法，最终有助于开发更有效的治疗策略。总之，本方案为研究急性髓系白血病（AML）中治疗适应机制及耐药性的产生提供了有价值的工具，为进一步深入理解相关机制和潜在的治疗进展奠定了基础。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了科尔基金会为 LH 和 FEM 提供的过渡拨款，以及加拿大白血病与淋巴瘤协会和加拿大卫生研究院（PJT-186019）向 LH 和 FEM 提供的资助。FEM 是魁北克省健康研究基金会（FRSQ）Junior 2 级临床科学家，LH 是魁北克省健康研究基金会（FRSQ）Junior 2 级科学家。VG 获得了科尔基金会的博士研究生奖学金。图 1 使用 BioRender 在授权协议下制作。流式细胞术图谱采用 FlowJo 软件生成。 特别感谢 Colin Crist 博士和 Victoria Richard 允许使用他们的动物手术设施。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 25G x 5/8 TW | BD Biosciences | #309626 | 用于骨髓穿刺 |
| 1.7 mL 微量离心管 | FroggaBio | #LMCT1.7B | 用于分装骨髓穿刺回收的细胞 |
| BD Horizon Brilliant 染色缓冲液 | BD Biosciences | #563794 | 用于染色过程 |
| 布托啡诺 | Fidelis Animal Health | Ethiqa XR | 小鼠镇痛剂 |
| CellDrop FL Unlimited | FroggaBio | #CellDrop FL- UNLTD | 用于细胞计数 |
| D-PBS | Wisent Inc. | #311-425-CL | 用于骨髓穿刺回收细胞的培养基 |
| Eppendorf 离心机 5427 R | Millipore Sigma | #EP5429000260 | |
| 胎牛血清 热灭活 优质 CA | Wisent Inc. | #090-450 | 用于染色过程 |
| 甲醛溶液 | Millipore Sigma | #F1635 | 细胞通透化 |
| 人CD45 [HI30] 抗体 | BD Biosciences | #563792 | 与BUV395偶联的抗体 |
| ID7000 光谱细胞分析仪 | Sony | 光谱流式细胞仪分析仪 | |
| 异氟烷 99.9% 液体 | McKesson | #803250 | 小鼠麻醉剂 |
| Isospire（异氟烷）吸入麻醉剂 | Dechra | 小鼠麻醉剂 | |
| 活/死细胞 AO/PI 染色 | FroggaBio | CD-AO/PI-1.5 | 用于细胞计数 |
| 活/死细胞 Zombie NIR 染色 | BioLegend+B6:C12 | #423106 | 用于光谱流式细胞术 |
| 甲醇溶液 | Millipore Sigma | #179957 | 细胞固定 |
| P-4EBP1 (Thr37/46) [236B4] 抗体 | Cell Signaling Technology | #2846 | 与Alexa Fluor 488偶联的抗体 |
| p-Erk1/2 (Thr202/Tyr204) [197G2] 抗体 | Cell Signaling Technology | #13148 | 与Alexa Fluor 647偶联的抗体 |
| p-RPS6 (Ser240/244) [D68F8] 抗体 | Cell Signaling Technology | #9468 | 与Alexa Fluor 594偶联的抗体 |
| p-STAT5 (Tyr694) [D47E7] 抗体 | Cell Signaling Technology | #14603 | 与PE偶联的抗体 |
| 兔IgG对照 [DA1E] | Cell Signaling Technology | #2975 | 与Alexa Fluor 488偶联的抗体 |
| 兔IgG对照 [DA1E] | Cell Signaling Technology | #2985 | 与Alexa Fluor 647偶联的抗体 |
| 兔IgG对照 [DA1E] | Cell Signaling Technology | #8760 | 与Alexa Fluor 594偶联的抗体 |
| 兔IgG对照 [DA1E] | Cell Signaling Technology | #5742S | 与PE偶联的抗体 |
| 消毒湿巾 | United Canada | #UCDWPR-9022 | 用于骨髓穿刺的消毒 |
参考文献
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