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方法文章

用于移植的鼠肾常温机械灌注

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DOI：

10.3791/68251

⸱

2026年1月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Organ Donation and Transplant Immunology, 3Sun Yat-sen University & Huayue Bio-Artificial Kidney and Renal Regeneration Research Laboratory, 4Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, 5Yuxi Zhongshan Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了 离体 大鼠肾脏的常温机械灌注及其后续移植至受体大鼠

摘要

常温机械灌注（NMP）技术是一种有前景的器官保存技术，可提供一个 离体 器官评估与干预平台。由于临床废弃器官来源有限且大型动物模型成本高昂，小型动物常温机械灌注（NMP）模型已成为相关研究中颇具前景的替代方案。本文建立了一套标准化的大鼠肾脏NMP及移植操作流程，提供了肾脏获取、NMP保存及移植的逐步操作指南。记录了NMP过程中的各项细节与参数。所有接受移植的大鼠均成功存活，且移植后肾移植物功能正常。术后第7天，NMP组的存活率与移植物组织学表现与静态冷保存（SCS）组相比无显著差异。该小型动物模型中的新型NMP策略，有望为未来器官保存、评估及干预相关的基础研究提供支持。此外，该模型还为治疗药物、影像技术及灌注相关干预措施的临床前测试提供了一个成本较低、可扩展的实验平台。

引言

终末期肾病（ESKD）正迅速成为全球卫生和医疗系统的沉重负担1,2,3。尽管在大多数国家，透析是治疗ESKD的主要手段，肾移植仍是金标准疗法，与透析相比，肾移植可提高患者生活质量，并改善生存率和预后1,3,4,5。然而，供体肾脏的短缺限制了肾移植的进一步推广，导致越来越多地使用循环死亡后捐献（DCD）或扩展标准供体（ECD）的移植物6,7,8。

目前，静态冷保存（SCS）是器官保存的标准方法，但长时间的冷缺血会增加移植物功能延迟（DGF）的风险，并引发急性和慢性排斥反应，尤其是在DCD或ECD移植物中9,10,11,12。因此，寻找一种能够最大限度减少冷缺血损伤并改善移植物预后的器官保存方法至关重要。常温机械灌注（NMP）是一种新兴的器官保存技术，通过在器官内循环加温且含氧的灌注液来模拟生理条件12,13,14,15。该方法还能维持接近生理状态的代谢水平，从而实现对器官活力的评估，减轻冷缺血性损伤，甚至修复器官损伤16,17,18,19,20。与SCS相比，NMP在DCD和ECD移植物中均能降低DGF的发生率，并改善移植物预后17,21,22。

目前，猪肾脏和临床废弃的人体肾脏已用于基础常温机械灌注（NMP）研究20,23,24。然而，应当注意的是，猪模型存在显著局限性，包括高昂的饲养成本、较大的药物剂量需求以及物种特异性试剂的缺乏25。此外，使用废弃的人体器官受限于供体数量有限以及复杂的伦理审查流程。这些限制因素共同制约了它们在基础研究中的广泛应用。相比之下，啮齿类小动物模型（尤其是大鼠模型）尽管在现有文献中报道较少，但具有显著更低的运行成本以及大量可商业获取的试剂。这些优势使其成为推进基础研究的有前景平台26,27,28。基于上述理由，本文中我们建立并验证了一种基于大鼠的常温机械灌注及移植模型。

本文展示了一种建立大鼠肾脏离体机械灌注（NMP）及移植的详细方案。内容包括灌注液和灌注系统的准备，以及供体和受体肾脏手术操作的全面描述。该模型显示出作为研究肾移植的理想动物模型的潜力，尤其可作为评估相关药物疗效的平台19,29,30,31。

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方案

动物实验方案经中山大学实验动物中心动物护理与使用委员会批准（编号：SYSU-IACUC-2023-000717）。本研究中所有动物均为7–8周龄的雄性Sprague–Dawley大鼠（250–300 g），特定病原体阴性（SPF级），符合实验室动物安全的标准要求（参见补充表S1中的病原体排除清单）。动物饲养于中山大学实验动物中心的无病原体环境中，并给予标准饮食。
实验前需通过高压灭菌（121 °C，30 min）对所有外科器械进行灭菌处理。操作过程中仅使用一次性无菌耗材，并在所有操作中严格遵守无菌操作规程。

1. 基础灌注液的制备

  1. 将 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）、50 mL RPMI 1640 培养基、2% 青霉素-链霉素和 0.6 mg 肌酐混合，制备基础灌注液（补充表 S2）。
  2. 加入 5% 碳酸氢钠溶液（0.5–1.2 mL），调节 pH 至约 7.3，碱剩余（BE，衡量灌注系统酸碱平衡的重要指标）至约 0，总体积约为 60 mL。
  3. 通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液，以去除颗粒物和细菌。
    注意：完全灌注液需包含 50 mL 基础灌注液和 10 mL 供体血液（见步骤 2.13）。

2. 肾脏获取

注意：所有结扎操作均使用8-0外科缝合线。

  1. 在麻醉舱中使用 3% 异氟烷诱导麻醉，并在手术过程中通过 1.5% 异氟烷维持全身麻醉。
  2. 术前准备。
    1. 向培养皿中加入 20 mL 预冷的生理盐水，用于保存步骤 2.12 中获取的肾脏。
    2. 用 10 mL 冷的高渗枸橼酸腺嘌呤（HCA）溶液和 1,250 U 肝素填充注射器。将注射器连接输液延长管和 24 G 留置针。
  3. 选择供体大鼠并用异氟烷进行麻醉。通过确认后肢无反射反应来判断麻醉深度是否足够。麻醉诱导后，使用电动剃毛器剃除腹部毛发（范围：从剑突至耻骨联合，两侧至腋中线）。
  4. 使用医用胶带将大鼠仰卧固定在带有加热垫的手术板上。先用碘伏棉球消毒腹部皮肤，再用酒精棉球进行二次消毒。将无菌纱布覆盖于已消毒的腹部皮肤上。
  5. 使用手术刀和镊子从剑突至膀胱做正中切口（长约 8 cm），依次切开腹壁皮肤和肌肉层。
    注意：必要时夹闭腹壁血管以防止出血。
  6. 使用拉钩牵开腹壁，暴露手术视野。
  7. 使用显微镊子分离结缔组织，游离左侧肾脏及输尿管。
  8. 在左输尿管上放置结扎线（结扎线 I）。在肾门远端 0.5–1.0 cm 处切断左肾输尿管，并插入一段长约 0.5 cm 的 26 G 套管，然后收紧结扎线 I（图 1A、B）。
  9. 分离左侧肾动静脉。在肾动脉上放置结扎线（结扎线 II），在肾静脉上放置结扎线（结扎线 III）（图 1A、B）。
  10. 依次收紧结扎线 II 和 III。在结扎部位远端切断血管和输尿管。剥离肾周结缔组织，将肾脏转移至准备好的培养皿中。
  11. 使用预装的 24 G 留置针插管左肾动脉。用结扎线（结扎线 IV）固定插管，并以 100 mL/h 的流速灌注，直至肾脏变为苍白（图 1A）。
    注意：灌注管路和留置针应预先充满液体，避免产生气泡。
  12. 将灌注后的肾脏置于盛有冰的培养皿中，直至开始常温机械灌注（NMP）（见步骤 2.1.1）。
    注意：对于静态冷保存（SCS）组，灌注后的肾脏置于含 HCA 溶液的 15 mL 离心管中，在 4 °C 下保存 3 小时；而 NMP 组则进行 3 小时的持续灌注。
  13. 通过连接 20 mL 注射器的 24 G 留置针，从腹主动脉注射 1,250 U 肝素。随后使用上述留置针采集 10 mL 抗凝血液，用于后续完整灌注液的配制。在持续气体麻醉下通过放血法处死供体大鼠。
    注意：完整灌注液可维持红细胞压积（HCT）水平在 6–8%。

3. NMP 系统的准备与灌注

  1. 组装灌流系统（图2).
  2. 将水浴设置为维持器官腔室温度在 37 °C。打开 90% O2 向动物膜式氧合器输送气体以进行氧合。
  3. 将10 mL供体血液（步骤2.13）与基础灌注液（步骤1）在器官腔内混合，混合前需经细胞滤网过滤，以获得完整的灌注液。留取约2 mL混合样品作为基线样本。
  4. 打开蠕动泵并开始灌注（3 mL/min），用混合液填充灌注管路。使用夹子将无菌圆形纱线固定在灌注腔室上方。
  5. 当混合液充满管道并开始流出后，将肾脏（步骤 2.12）连接至灌注系统并开始灌注。使用夹子固定管道图1A，C).
  6. 将输尿管插管与延长管连接。在灌注过程中，用微量离心管收集尿液。
  7. 灌流期间，维持灌流压力在约80 mmHg，肾脏温度在约37 °C。监测并记录灌流流量、压力及血管阻力（定义为灌流压力除以灌流流量）。
  8. 加入1.0 mL无菌水，以3 L/min流速充氧20秒（90% O₂）2每30分钟记录一次，每小时收集1 mL灌注液及所产生的尿液以保留样本，并检测灌注液的血气和血液生化指标。
  9. 灌注结束时，测定灌注液的血液生化指标，以计算钠和钾的排泄分数（FE）。上述指标的计算公式如下：
    Fractional excretion of sodium equation, showing variables for renal function assessment.
    Fractional excretion formula equation, chemistry or medical calculation, educational use.
    何处 PNa 表示灌注液中的钠离子浓度。 UCr 表示尿液中肌酐的浓度。 UNa 表示尿液中的钠浓度。 PCr 表示灌注液中的肌酐浓度。表示灌注液中的钾离子浓度。 UK 代表尿液中的钾离子浓度。
    1. 根据血气分析结果监测灌注期间的pH值。若出现呼吸性碱中毒（过度通气），应减少通气量。
    2. 在代谢性酸中毒的情况下，向灌注液中加入适量的碳酸氢钠溶液。
  10. 灌注3小时后，移除输尿管延长管并收集尿液样本。
  11. 将肾脏从灌注系统中取出，将留置管连接至微泵。用预冷的HCA溶液（储存在4 °C冰箱中，仅在使用前吸取所需体积）灌注肾脏，直至肾脏变为苍白。
  12. 将肾脏从留置针中取出，移植前于4 °C条件下保存在HCA溶液中。

4. 大鼠肾移植

注意：所有结扎操作均使用8-0缝线，肾血管和输尿管吻合使用11-0缝线，腹部皮肤和肌肉吻合使用3-0缝线。

  1. 手术前一天，对所有受体大鼠腹腔注射美洛昔康（2 mg/kg）以进行镇痛。在麻醉舱中使用3%异氟烷诱导麻醉，并在手术过程中以1.5%异氟烷维持全身麻醉。术后在腹部切口部位局部喷洒2%利多卡因喷雾以实现局部镇痛。
  2. 在麻醉舱中选择并麻醉受体大鼠。通过确认后肢无反射反应来判断麻醉深度是否足够。
  3. 麻醉诱导后，使用电动剃毛器剃除腹部毛发（范围：从剑突至耻骨联合，两侧至腋中线）。
  4. 使用医用胶带将大鼠仰卧位固定于带有加热垫的手术板上。先用浸碘棉球消毒腹部皮肤，再用酒精棉球进一步消毒。重复上述消毒步骤共三次。在已消毒的腹部皮肤上铺无菌纱布。
  5. 使用手术刀和镊子从剑突至膀胱处做正中切口（长约8 cm），依次切开腹壁皮肤和肌肉层。夹闭腹壁血管以防止出血。
  6. 使用牵开钩牵开腹壁以暴露手术视野。从结缔组织中分离并暴露右肾。分离并结扎右肾血管（结扎V）和输尿管（结扎VI）。在结扎V远端和结扎VI近端切除右肾（图1A，D）。
  7. 分离并暴露左肾血管。随后依次使用血管夹夹闭左肾动脉和静脉。切断肾血管和输尿管以切除左肾（图1A，E）。
  8. 完全暴露动脉和静脉的管腔。用肝素化生理盐水（补充表S2）冲洗受体大鼠的左肾动脉和静脉，直至无残留管腔液体。
  9. 将供体左肾（见步骤3.12）转移至受体大鼠左侧腹腔。转移后，每3–5分钟用冰盐水冲洗肾脏一次，以维持低代谢状态并减轻缺血性损伤。
  10. 使用11-0缝线对肾动脉（吻合I）和肾静脉（吻合II）进行端对端吻合。缝合过程中用冷盐水冲洗移植物表面。
    1. 对肾动脉的上极和下极进行间断缝合闭合。
    2. 对肾动脉腹侧进行连续缝合闭合。暴露肾动脉背侧，随后对背侧进行连续缝合闭合。
      注：收紧缝线以确保血管壁无间隙。每次缝合时应确保血管壁全层对合，同时避免穿透至对侧管壁。
    3. 对肾静脉的上极和下极进行间断缝合闭合。
    4. 对肾静脉背侧进行连续缝合闭合。在进行下一阶段闭合前，固定连续吻合缝线。随后对肾静脉腹侧进行连续缝合闭合。
  11. 松开血管夹，开放肾动脉和肾静脉。
    注：若出现少量出血，可用干净棉球压迫止血。
  12. 将供体输尿管的26 G输尿管导管插入受体输尿管中。固定左右两侧的输尿管残端（吻合III）。
  13. 通过将结缔组织缝合至肾周脂肪组织来固定移植物（图1A，F）。
  14. 在关闭腹腔前检查移植物外观（图1A，G）。手术结束后，依次缝合腹壁肌肉层和皮肤层，关闭腹腔。在吻合部位喷洒利多卡因喷雾。使用加热垫维持大鼠恢复期间的体温，并在大鼠可自主活动后将其置于代谢笼中进行监测。
    注：腹壁应分层缝合，确保组织精确对合，并在每一针缝合中施加适当的张力。缝合皮肤时应包含部分下方肌肉层，以防止死腔形成。

5. 围手术期给药与术后检测

  1. 围手术期药物管理：以下药物通过腹腔注射每日给药：美洛昔康，剂量为 2 mg/kg，用于围手术期镇痛，从术前 1 天开始至术后第 3 天；甲基泼尼松龙琥珀酸钠，剂量为 4 mg/kg，用于预防同种异体移植物排斥反应，从手术当天开始至术后第 7 天。术后密切观察并记录受体大鼠的存活情况及每日尿量。
  2. 术后第 7 天，对大鼠实施麻醉，经腹主动脉采血用于生化指标检测，并取出移植肾组织。在组织取材完成后，于持续气体麻醉状态下通过放血法处死大鼠。
  3. 将肾脏样本固定于 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中，随后按照标准流程进行脱水、透明和石蜡包埋（补充表 S3）。将石蜡包埋组织切片至厚度为 4 µm，随后进行苏木精-伊红染色（H&E，补充表 S4）和过碘酸-雪夫染色（PAS，补充表 S5），以进行组织学评估。
    注：详细的染色操作步骤见 补充表 S3、补充表 S4 和 补充表 S5。

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结果

采用所述方法，分离的大鼠肾脏可保持活力 离体 常温机械灌注至少 3 小时。在 NMP 期间，肾脏的灌注阻力（图3A，完整的基础数据集 图3 和 图4 可获取 补充表 S6。) 在灌注期间稳定维持在 5.958 ± 1.106 mmHg/(mL/min)，表明我们建立的灌注系统具有良好的稳定性。肾脏在灌注期间正常产生尿液（图3B）且表现为低钠离子排泄分数和高钾离子排泄分数（图3C)，表明肾脏在灌注期间保持了良好的生理功能。

移植后的数据还证明了所建立模型的安全性和稳定性。与冷保存组（在冷灌注结束时于4 °C保存3小时后移植）相比，NMP组术后7天的存活率和尿量均无显著差异，表明我们所建立的模型具有良好的稳健性（

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讨论

常温机械灌注（NMP）可缩短移植物缺血时间，并能够在体外对移植物质量进行评估和干预ex vivo16,17,18,19,20,32,33。然而，目前尚无针对大鼠模型的常温机械灌注统一标准。本文建立了一种用于大鼠肾脏常温机械灌注及后续移植的动物模型，该模型可作为研究常温机械灌注在肾移植领域作用的重要工具。

目前，用于NMP研究的动物模型主要为猪模型，但高昂的成本限制了相关实验的广泛开展32,34

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得以下基金资助：国家自然科学基金面上项目（编号 82470778）；国家自然科学基金青年科学基金项目（编号 82201961）；广东省自然科学基金面上项目（编号 2024A1515011447）；广东省器官捐献与移植免疫重点实验室（编号 2023B1212060020）；中山大学 - ARM 肾脏再生项目 &；重建联合实验室（资助编号：SYSU-50000-20240428-0001）

作者感谢中山大学实验动物中心提供实验动物、场地和仪器设备。图1 和 图2 使用 FigDraw 制作；Graphpad Prism 提供数据绘图服务，湖北百奥赛图生物科技有限公司完成了石蜡切片和病理染色。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精（75 %）MUSIYANJJ-75-1
输血装置佛山优展科技有限公司YZDW-15-5
牛血清白蛋白（BSA）Aladdin Scientific Corp.B265991-100g
细胞滤网（70 μm)康宁生命科学（吴江）有限公司352350
离心管（1.5 mL）康宁生命科学（吴江）有限公司MCT-150-C-1
离心管（15 mL）ExCell BioCS015-0001
棉球河南飘安集团有限公司尺寸小
棉签佛山顺德康正卫生材料有限公司KZ3-12
肌酐上海源叶生物科技有限公司S20198-100g
双环形针尼龙缝合线（11-0）宁波医用针业有限公司SYZ-11-0
电子天平SENSSUNEHA17
液体分配器志宇医疗YZ-00-0231
纱布ZITTARC11001-001
加热垫广州德为生物科技有限公司DK0032
肝素钠注射液（12500 U，2 mL）成都海普洛斯医药科技有限公司H51021209
红外测温仪德利DL333380
注射器（1 mL）Winner Medical (Human) Co, Ltd.ZT-ZS 1 ml
注射器（10 mL） Winner Medical (Human) Co, Ltd.ZT-ZS 10 ml
注射器（20 mL）Winner Medical (Human) Co, Ltd.ZT-ZS 20 ml
异氟烷RWD生命科学有限公司R510-22-10
i-STAT 1 血细胞分析仪Abbott04P75-03（美国）
i-STAT CG4+ 试剂盒Abbott03P85-25
i-STAT CHEM8+ 试剂盒Abbott09P31-25
液体延长管江西洪达医疗设备集团有限公司ZJ983
Micro-1 大鼠氧合器东莞科威医疗器械有限公司微运动器官
微型泵EDCAPTAINSYS-3011
针式滤器（0.22） μm)默克密理博SLGPR33RB
器官保存液扬子江药业集团HCA II
氧合器OwgelsOZ-3-02HWO
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技公司15140122
蠕动泵Kamoer Fluid Tech (Shanghai) Co., Ltd.LLS Plus V2
蠕动泵管佛山优展科技有限公司LG-1-14
培养皿BKMAMBKM001
压力传感器爱德华兹生命科学公司JIBPT-A-01-EDW
压力传感器接收器Singularity MedicalCB-202309001
RPMI 1640 (1×, 500 mL)康宁生命科学（吴江）有限公司R10-040-CV
生理盐水YXH 药房A1001346
SD 大鼠中山大学实验动物中心NA
夏弗BeyotimeFS600
单角针尼龙缝线（3-0）宁波医用针业有限公司DJZ-3-0
单根圆形针尼龙缝合线（8-0）宁波医用针业有限公司DYZ-8-0
小型动物麻醉机RWD生命科学有限公司R500
小型动物多器官灌注机生命 Perfusor 医学PU-100包括金属皿、水浴锅、加热泵和温度传感器
小型动物手术器械包BeyotimeFS500
碳酸氢钠溶液（NaHCO₃）3, 5 %)东莞普济医疗科技有限公司H20064480
无菌手术单HengAo TechnologySKR-BY-DD0001
无菌水Haiwang BioH35021140
直柄静脉留置针（24 G）佛山优展科技有限公司20230816-1
手术显微镜MurziderMSD203
胶带明尼苏达矿业及制造有限公司1527C-0
三通接头佛山优展科技有限公司WGST-10
Y型留置静脉导管针（24 G）JIANGXI FENGLINYZDW-7-5
Y型留置静脉导管针（26 G）JIANGXI FENGLINYZDW-7-6

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