本方案描述了 离体 大鼠肾脏的常温机械灌注及其后续移植至受体大鼠
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摘要
摘要
常温机械灌注（NMP）技术是一种有前景的器官保存技术，可提供一个 离体 器官评估与干预平台。由于临床废弃器官来源有限且大型动物模型成本高昂，小型动物常温机械灌注（NMP）模型已成为相关研究中颇具前景的替代方案。本文建立了一套标准化的大鼠肾脏NMP及移植操作流程，提供了肾脏获取、NMP保存及移植的逐步操作指南。记录了NMP过程中的各项细节与参数。所有接受移植的大鼠均成功存活，且移植后肾移植物功能正常。术后第7天，NMP组的存活率与移植物组织学表现与静态冷保存（SCS）组相比无显著差异。该小型动物模型中的新型NMP策略，有望为未来器官保存、评估及干预相关的基础研究提供支持。此外，该模型还为治疗药物、影像技术及灌注相关干预措施的临床前测试提供了一个成本较低、可扩展的实验平台。
引言
终末期肾病（ESKD）正迅速成为全球卫生和医疗系统的沉重负担1,2,3。尽管在大多数国家，透析是治疗ESKD的主要手段，肾移植仍是金标准疗法，与透析相比，肾移植可提高患者生活质量，并改善生存率和预后1,3,4,5。然而，供体肾脏的短缺限制了肾移植的进一步推广，导致越来越多地使用循环死亡后捐献（DCD）或扩展标准供体（ECD）的移植物6,7,8。
目前，静态冷保存（SCS）是器官保存的标准方法，但长时间的冷缺血会增加移植物功能延迟（DGF）的风险，并引发急性和慢性排斥反应，尤其是在DCD或ECD移植物中9,10,
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方案
动物实验方案经中山大学实验动物中心动物护理与使用委员会批准（编号：SYSU-IACUC-2023-000717）。本研究中所有动物均为7–8周龄的雄性Sprague–Dawley大鼠（250–300 g），特定病原体阴性（SPF级），符合实验室动物安全的标准要求（参见补充表S1中的病原体排除清单）。动物饲养于中山大学实验动物中心的无病原体环境中，并给予标准饮食。
实验前需通过高压灭菌（121 °C，30 min）对所有外科器械进行灭菌处理。操作过程中仅使用一次性无菌耗材，并在所有操作中严格遵守无菌操作规程。
1. 基础灌注液的制备
- 将 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）、50 mL RPMI 1640 培养基、2% 青霉素-链霉素和 0.6 mg 肌酐混合，制备基础灌注液（补充表 S2）。
- 加入 5% 碳酸氢钠溶液（0.5–1.2 mL），调节 pH 至约 7.3，碱剩余（BE，衡量灌注系统酸碱平衡的重要指标）至约 0，总体积约为 60 mL。
- 通过 0.22 µm 滤膜过滤溶液，以去除颗粒物和细菌。
注意：完全灌注液需包含 50 mL 基础灌注液和 10 mL 供体血液（见步骤 2.13）。
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结果
采用所述方法，分离的大鼠肾脏可保持活力 离体 常温机械灌注至少 3 小时。在 NMP 期间，肾脏的灌注阻力（图3A，完整的基础数据集 图3 和 图4 可获取 补充表 S6。) 在灌注期间稳定维持在 5.958 ± 1.106 mmHg/(mL/min)，表明我们建立的灌注系统具有良好的稳定性。肾脏在灌注期间正常产生尿液（图3B）且表现为低钠离子排泄分数和高钾离子排泄分数（图3C)，表明肾脏在灌注期间保持了良好的生理功能。
移植后的数据还证明了所建立模型的安全性和稳定性。与冷保存组（在冷灌注结束时于4 °C保存3小时后移植）相比，NMP组术后7天的存活率和尿量均无显著差异，表明我们所建立的模型具有良好的稳健性（
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讨论
常温机械灌注（NMP）可缩短移植物缺血时间，并能够在体外对移植物质量进行评估和干预ex vivo16,17,18,19,20,32,33。然而，目前尚无针对大鼠模型的常温机械灌注统一标准。本文建立了一种用于大鼠肾脏常温机械灌注及后续移植的动物模型，该模型可作为研究常温机械灌注在肾移植领域作用的重要工具。
目前，用于NMP研究的动物模型主要为猪模型，但高昂的成本限制了相关实验的广泛开展32,34
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得以下基金资助：国家自然科学基金面上项目（编号 82470778）；国家自然科学基金青年科学基金项目（编号 82201961）；广东省自然科学基金面上项目（编号 2024A1515011447）；广东省器官捐献与移植免疫重点实验室（编号 2023B1212060020）；中山大学 - ARM 肾脏再生项目 &；重建联合实验室（资助编号：SYSU-50000-20240428-0001）
作者感谢中山大学实验动物中心提供实验动物、场地和仪器设备。图1 和 图2 使用 FigDraw 制作；Graphpad Prism 提供数据绘图服务，湖北百奥赛图生物科技有限公司完成了石蜡切片和病理染色。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精（75 %） | MUSIYAN | JJ-75-1 | |
| 输血装置 | 佛山优展科技有限公司 | YZDW-15-5 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Aladdin Scientific Corp. | B265991-100g | |
| 细胞滤网（70 μm) | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | 352350 | |
| 离心管（1.5 mL） | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | MCT-150-C-1 | |
| 离心管（15 mL） | ExCell Bio | CS015-0001 | |
| 棉球 | 河南飘安集团有限公司 | 尺寸小 | |
| 棉签 | 佛山顺德康正卫生材料有限公司 | KZ3-12 | |
| 肌酐 | 上海源叶生物科技有限公司 | S20198-100g | |
| 双环形针尼龙缝合线（11-0） | 宁波医用针业有限公司 | SYZ-11-0 | |
| 电子天平 | SENSSUN | EHA17 | |
| 液体分配器 | 志宇医疗 | YZ-00-0231 | |
| 纱布 | ZITTAR | C11001-001 | |
| 加热垫 | 广州德为生物科技有限公司 | DK0032 | |
| 肝素钠注射液（12500 U，2 mL） | 成都海普洛斯医药科技有限公司 | H51021209 | |
| 红外测温仪 | 德利 | DL333380 | |
| 注射器（1 mL） | Winner Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 1 ml | |
| 注射器（10 mL） | Winner Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 10 ml | |
| 注射器（20 mL） | Winner Medical (Human) Co, Ltd. | ZT-ZS 20 ml | |
| 异氟烷 | RWD生命科学有限公司 | R510-22-10 | |
| i-STAT 1 血细胞分析仪 | Abbott | 04P75-03（美国） | |
| i-STAT CG4+ 试剂盒 | Abbott | 03P85-25 | |
| i-STAT CHEM8+ 试剂盒 | Abbott | 09P31-25 | |
| 液体延长管 | 江西洪达医疗设备集团有限公司 | ZJ983 | |
| Micro-1 大鼠氧合器 | 东莞科威医疗器械有限公司 | 微运动器官 | |
| 微型泵 | EDCAPTAIN | SYS-3011 | |
| 针式滤器（0.22） μm) | 默克密理博 | SLGPR33RB | |
| 器官保存液 | 扬子江药业集团 | HCA II | |
| 氧合器 | Owgels | OZ-3-02HWO | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技公司 | 15140122 | |
| 蠕动泵 | Kamoer Fluid Tech (Shanghai) Co., Ltd. | LLS Plus V2 | |
| 蠕动泵管 | 佛山优展科技有限公司 | LG-1-14 | |
| 培养皿 | BKMAM | BKM001 | |
| 压力传感器 | 爱德华兹生命科学公司 | JIBPT-A-01-EDW | |
| 压力传感器接收器 | Singularity Medical | CB-202309001 | |
| RPMI 1640 (1×, 500 mL) | 康宁生命科学（吴江）有限公司 | R10-040-CV | |
| 生理盐水 | YXH 药房 | A1001346 | |
| SD 大鼠 | 中山大学实验动物中心 | NA | |
| 夏弗 | Beyotime | FS600 | |
| 单角针尼龙缝线（3-0） | 宁波医用针业有限公司 | DJZ-3-0 | |
| 单根圆形针尼龙缝合线（8-0） | 宁波医用针业有限公司 | DYZ-8-0 | |
| 小型动物麻醉机 | RWD生命科学有限公司 | R500 | |
| 小型动物多器官灌注机 | 生命 Perfusor 医学 | PU-100 | 包括金属皿、水浴锅、加热泵和温度传感器 |
| 小型动物手术器械包 | Beyotime | FS500 | |
| 碳酸氢钠溶液（NaHCO₃）3, 5 %) | 东莞普济医疗科技有限公司 | H20064480 | |
| 无菌手术单 | HengAo Technology | SKR-BY-DD0001 | |
| 无菌水 | Haiwang Bio | H35021140 | |
| 直柄静脉留置针（24 G） | 佛山优展科技有限公司 | 20230816-1 | |
| 手术显微镜 | Murzider | MSD203 | |
| 胶带 | 明尼苏达矿业及制造有限公司 | 1527C-0 | |
| 三通接头 | 佛山优展科技有限公司 | WGST-10 | |
| Y型留置静脉导管针（24 G） | JIANGXI FENGLIN | YZDW-7-5 | |
| Y型留置静脉导管针（26 G） | JIANGXI FENGLIN | YZDW-7-6 |
参考文献
- Collins, A. J., et al. Excerpts from the US Renal Data System 2009 Annual Data Report. Am J Kidney Dis. 55 (1 Suppl 1), A6-A7 A1-A420 (2010).
- Skorecki, K., Chertow, G. M., Marsden, P. A., Taal, M. W., Yu, A. S. L. Brenner & Rector's The Kidney. , 10th ed, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Thurlow....
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重印与许可
