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方法文章

微图案化磁流变弹性体驱动心肌细胞排列变化

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DOI：

10.3791/68271

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2025年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Cardiovascular Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Materials Science and Engineering, University of Delaware, 4Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children

本文内容

摘要

我们介绍一种利用嵌入铁颗粒的超软硅胶弹性体（聚二甲基硅氧烷，PDMS）制备的动态且可逆刚度检测平台。该新型检测方法适用于研究细胞表型中出现的时间依赖性物理变化，包括接触引导效应。在此，我们通过磁力作用诱导基质刚性化，测量新生大鼠心肌细胞的排列情况。

摘要

基底相关的线索（如力学和拓扑结构）对细胞反应具有深远影响。然而，大多数基础研究采用的是静态或孤立的效应。这些力学效应在细胞响应中的作用方向和时间尺度仍 largely 未被探索。用于研究时变性基底相关刺激如何驱动生理和病理过程的工具，可揭示下一层次的力学生物学机制。本文中，我们使用微图案化的磁流变弹性体（MREs），该材料可在外加磁场作用下快速变硬或软化，从而更严格地探究力学（刚度）和接触引导（拓扑）刺激对新生大鼠心肌细胞取向与排列的影响。通过整合可随时间调节并可逆的动态力学刚度控制，我们能够严格检验负荷的影响：（1）在相同条件下进行预处理；（2）急性改变体外（in vitro）生物力学环境，以准确模拟心肌梗死等具有临床相关性的现象。该方法使我们能够以更真实且可控的方式研究负荷对细胞反应的影响。

引言

心脏高效泵血的能力依赖于心肌的结构及其力学特性（刚度），其中细胞和组织的精确排列对于协调收缩和整体功能至关重要。心肌主要由心肌细胞（CMs）构成，在成人体内，这些细胞呈细长的、近乎杆状的形态，其肌节（心肌细胞的收缩单位）沿细胞长轴方向有序排列。相比之下，胎儿来源或诱导性多能干细胞（iPSC）分化而来的心肌细胞与成人心肌细胞存在显著差异：它们通常形态更趋圆形，仅含一个细胞核，肌节结构紊乱或未对齐，且搏动频率不规则。体内心肌组织的结构相似性有助于实现收缩同步和力的传递；这对于通过体外模型重现天然心肌功能极为关键。为了获得结构特征接近成熟心肌的心肌细胞，既往研究已证明多种促进细胞成熟的策略具有成效，包括调控基底刚度1,2、施加机械应变3、利用接触引导效应4,5，或采用电刺激起搏6,7。

长期以来，人们认识到细胞外环境的刚度会影响细胞行为。人体内存在广泛的刚度差异，从脑组织的数百帕斯卡（Pa）到骨组织的数十吉帕斯卡（GPa）不等8,9,10。研究发现，在发育过程中，组织的刚度会发生变化，这种改变可调控细胞水平的分化和成熟，进而形成维持正常功能所必需的成年表型11,12,13,14。刚度的变化也与疾病状态及特定病理的进展相关15,16,17,18。具体而言，心肌组织的刚度会随着疾病的产生和发展而改变；例如，健康心肌的弹性模量约为10 kPa，而衰竭心脏的弹性模量则可达35–70 kPa甚至更高19。此外，大量体外（in vitro）研究表明，在刚度接近天然心肌的基底上培养的心肌细胞具有更佳的肌节排列结构20，能够产生最佳的收缩力1,19，并表现出最长的动作电位时程21。

此外，人们越来越认识到细胞 体内 在它们的微环境中会接触到多种复杂的拓扑信号，这些信号调控着细胞的形态与功能。这些拓扑信号具有不同的尺寸和几何特征，其尺度范围从分子水平上整合素的随机排列，到肌肉组织中细胞在微米尺度上的有序排列。22,23与其它机械调控因素类似，拓扑结构对细胞形态具有重要影响，例如细胞铺展、伸长、排列、迁移、分化和凋亡24,25,26随着合成培养基质的引入，已开发出多种方法用于构建可控的细胞与组织培养表面形貌27,28,29例如，已采用微图案化的纳米和微米级沟槽为哺乳动物细胞提供接触引导，使细胞定向并重塑其细胞骨架，以沿培养基底的拓扑结构排列。

本文介绍一种体外（in vitro）培养方法，该方法结合了结构引导（接触提示）与力学引导（刚度），利用一种可调控的磁流变弹性体（MRE）基底材料实现。该材料可通过调节磁场强度实现刚度的增强或减弱17,30,31,32。通过将磁体置于培养基底附近，可提高基底刚度，且通过调节样品与磁体之间的距离，可灵活控制刚度增强的程度；反之，移除磁体即可降低基底刚度。该方法提供了一种稳定、动态且可控的手段，用于模拟体内（in vivo）类似的力学环境，同时通过表面微图案化引入各向异性，从而构建更接近生物真实状态的二维细胞培养基底。

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方案

1. 图案化PDMS印章的制备

注意：PDMS印章因其柔韧性至关重要，便于操作并在制备图案化MRE表面时实现精确接触。印章的柔性特性还可在不损坏图案的前提下轻松从MRE PDMS层上剥离，确保图案的准确转移以及MRE表面的完整保留。

  1. 准备10 g的10:1（基础剂：固化剂）184 PDMS。
  2. 将5 g的184 PDMS倒入一个35 mm的培养皿中，并在干燥器中脱气约5–10分钟，直至所有气泡完全消失。
  3. 将184 PDMS置于60 °C的烘箱中部分固化30分钟。
  4. 当184 PDMS还剩5分钟完成部分固化时，向衍射光栅上添加一层薄薄的额外184 PDMS，并在干燥器中脱气约5分钟。
  5. 从烘箱中取出带有部分固化184 PDMS的35 mm培养皿。
  6. 将带有PDMS的衍射光栅翻转，贴合到35 mm培养皿中部分固化的184 PDMS上。
    注意：确保衍射光栅朝下，与35 mm培养皿中部分固化的184 PDMS接触。
  7. 轻轻按压衍射光栅，直到有少量184 PDMS包围光栅边缘。
  8. 使用剩余未固化的184 PDMS填充光栅周围的培养皿区域，以确保其在固化过程中保持固定。
  9. 将含有衍射光栅的培养皿放入设定为60 °C的烘箱中加热1.5小时。
  10. 待184 PDMS完全固化后，从烘箱中取出带有衍射光栅的35 mm培养皿。
  11. 用手术刀在衍射光栅周围划痕。
  12. 滴加少量异丙醇（IPA），使其渗入衍射光栅下方。
  13. 沿光栅图案的平行方向将光栅从184 PDMS上剥离。
  14. 去除多余的184 PDMS，仅保留带有图案的区域。
  15. 将184 PDMS印章切割至所需尺寸。
    注意：本研究中器件使用的印章尺寸为1 cm × 1 cm。

2. PDMS印章的表面包被

注意：硅烷处理会在表面形成一层涂层，防止在压印过程中PDMS层之间发生非预期的粘连，确保顺利分离并保持图案转移的质量。

  1. 硅烷处理（推荐方法）
    1. 将制备好的184 PDMS印章图案面朝上放入O2等离子体清洗仪中，用45 W的O2等离子体处理30秒。
      注意：从等离子体清洗仪取出后，应立即用盖子（或覆盖物）盖住印章，以确保无灰尘或其他微粒落在已清洁的印章表面。
    2. 将184 PDMS印章放入通风橱内的干燥器中。
    3. 撕下微量离心管管盖。
    4. 将微量离心管管盖放置在干燥器内184 PDMS印章旁。
    5. 向微量离心管管盖中加入20 µL三氯(1H, 1H, 2H, 2H-全氟辛基)硅烷。
      注意：该化学品对健康有害，必须仅在化学通风橱内操作。
    6. 关闭干燥器并抽真空。
    7. 使硅烷蒸汽对印章进行包覆处理，处理时间从1小时至过夜。

3. 磁流变弹性体的制备

注意：通过精确控制羰基铁颗粒与弹性体的比例，并结合施加磁场，可实现可调且可逆的磁流变弹性体（MRE）。通过调节颗粒含量、基体弹性体模量以及磁场强度，可精细调控材料的刚度，以满足特定需求。

  1. 较软动态范围磁流变弹性体（MRE）制备（示例重量参见表1）
    1. 称取所需量的硅胶稀释剂和Eco弹性体B组分，在高速混合器中以2500 rpm转速混合1分钟。
    2. 向溶液中加入Eco弹性体A组分和羰基铁颗粒，在高速混合器中以2500 rpm转速混合1分钟。
      注：混合顺序至关重要，以确保理想的聚合时间控制。
    3. 使用剪去尖端的移液管，将5 g MRE加入一个新的35 mm培养皿中，在真空干燥器中脱气约5分钟，然后在60 °C烘箱中部分固化约10分钟。
      注：确保烘箱和真空干燥器水平放置，对于获得平整样品至关重要，这直接影响成像的便利性。
    4. 当剩余5分钟时，使用移液管加入少量未固化的MRE，仅覆盖184 PDMS印章表面。将涂覆好的印章放入真空干燥器中脱气5分钟。
      注：注意不要使用过多MRE，否则若覆盖印章边缘，将导致MRE完全固化后难以移除印章。同时，务必在每一步骤中标明图案方向，以便在从MRE上取下印章时，能沿与图案平行的方向剥离。
    5. 将MRE从烘箱中取出，用一对镊子小心移动已涂覆的印章，将其翻转并正面朝下贴合到部分固化的MRE表面，轻轻按压。将MRE与印章一起放回60 °C烘箱中继续固化25分钟。
    6. 完全固化后，使用手术刀在印章底部垂直于图案方向划痕。
    7. 在印章周围的切口区域滴加少量异丙醇（IPA）。
      注：异丙醇应渗入切口并开始在印章下方扩散。
    8. 使用镊子沿与图案平行的方向将印章从MRE上剥离。
  2. 较硬动态范围MRE制备（示例重量参见表格）
    1. 制备30:1比例的184 PDMS。
      注：需多准备一些，因部分会残留在混合容器中。
    2. 按表格示例比例，加入所需量的527 PDMS A组分和B组分，随后加入羰基铁颗粒和30:1比例的184 PDMS。 
    3. 在高速混合器中以2500 rpm转速混合1分钟。
    4. 使用剪去尖端的移液管，将5 g MRE加入一个新的35 mm培养皿中，在真空干燥器中脱气约5分钟，然后在60 °C烘箱中部分固化约40分钟。
    5. 当剩余5分钟时，使用移液管加入少量未固化的MRE，仅覆盖PDMS印章表面。将涂覆好的印章放入真空干燥器中脱气5分钟。
      注：注意不要使用过多MRE，否则若覆盖印章边缘，将导致MRE完全固化后难以移除印章。同时，务必在每一步骤中标明图案方向，以便在从MRE上取下印章时，能沿与图案平行的方向剥离。
    6. 将MRE从烘箱中取出。
    7. 用一对镊子小心移动已涂覆的印章，将其翻转并正面朝下贴合到部分固化的MRE表面，轻轻按压。
    8. 将带有涂覆印章的MRE置于烘箱顶层架子上，在60 °C下过夜固化。
    9. 完全固化后，使用手术刀在印章底部垂直于图案方向切割MRE。
    10. 在印章周围的切口区域滴加异丙醇（IPA）。
      注：异丙醇应渗入切口并开始在印章下方扩散。
    11. 使用镊子沿与图案平行的方向将印章从MRE上剥离。
硬度范围材料示例用量
较软10–80 kPaEco (A+B)11.25 g (A)11.25 g (B)
硅油稀释剂22.5 g
铁颗粒45 g
较硬60–120 kPa527 PDMS (A+B)18.75 g (A)18.75 g (B)
铁颗粒37.5 g
184 PDMS (Base+Cure)14.5 g (Base)0.5 g (Cure)

表1：制备较软和较硬磁性橡胶执行器（MRE）所需所有材料的示例质量。 表中所列质量用于制备总共90 g的MRE材料。若需制备更少量，可按表中示例质量的比例混合所有组分。

4. 细胞培养准备

注意：细胞培养准备包括选择合适的细胞系、配制含有必要营养物质和生长因子的培养基，以及确保无菌条件以防止污染。将细胞接种于培养容器中，并在最佳条件下（通常为37 °C并控制CO2浓度）进行培养。通过定期观察、更换培养基和传代，以维持细胞的健康生长。

  1. 用70%乙醇清洗MRE表面3次以进行表面灭菌，并让第三次清洗液静置20分钟。
  2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗MRE表面3次，每次加入足量液体完全覆盖培养皿，随后吸除所有液体。
  3. 在37 °C条件下，用含纤维连接蛋白（10 µg/mL）的PBS溶液对MRE表面进行包被处理1小时，以促进细胞在装置上的黏附。
  4. 用PBS清洗MRE表面3次，操作方式同步骤4.1.2。
  5. 以20,000个细胞/cm2的密度接种新生大鼠心肌细胞。
  6. 在培养过程中暂时将磁铁添加到装置上，以增加基质刚度。
    注意：将带有磁铁的装置放入培养箱时需小心操作。装置之间应保持足够距离，以确保磁铁不发生相互作用。本研究建议使用不锈钢内衬培养箱而非铜内衬培养箱，因前者磁干扰更小。

5. 染色与成像

  1. 固定细胞成像
    注意：固定细胞成像包含多个关键步骤，用于可视化特定的细胞组分。首先，对细胞进行固定以保存其结构。接着，对细胞膜进行通透处理，以便染料能够进入细胞，然后进行封闭步骤，防止抗体或染料非特异性地结合到非目标位点（如其他蛋白质或细胞碎片）。随后，使用靶向特定分子的染料或抗体对细胞进行染色，并通过洗涤去除多余的染料。最后，利用荧光显微镜对染色后的细胞进行成像，以分析细胞结构。
    1. 加入足量的1× PBS，完全覆盖培养皿，洗涤一次，随后吸去所有液体。
    2. 使用4%（v/v）多聚甲醛固定细胞10分钟。
    3. 用1× PBS洗涤三次（操作同步骤5.1.1）。
    4. 加入含0.1% Triton X的1× PBS，孵育5分钟以实现通透。
    5. 用1× PBS洗涤三次（操作同步骤5.1.1）。
    6. 加入含50 mM NH4Cl的1× PBS，孵育15分钟以淬灭背景。
    7. 用1× PBS洗涤三次（操作同步骤5.1.1）。
    8. 加入封闭缓冲液（含5% BSA的1× PBS），室温（RT）孵育1小时。
    9. 将抗α-肌动蛋白（Anti-α-Actinin）一抗按1:200比例加入含5% BSA的1× PBS中。
      注意：充分混匀抗体溶液。
    10. 将一抗溶液加入样本中。
      注意：加入足量溶液以完全覆盖整个样本。
    11. 在4 °C下孵育过夜。
      注意：可考虑将样本置于摇床上以低速轻轻振荡，有助于溶液混合。
    12. 用1× PBS洗涤三次（操作同步骤5.1.1）。
    13. 将二抗（555 Alexa Fluor山羊抗小鼠）用1× PBS稀释至1:2000。
      注意：二抗含有对光敏感的荧光基团。未使用时应避光保存，避免暴露于光照下。
    14. 将二抗溶液加入样本中。
    15. 室温孵育2小时。
    16. 用1× PBS洗涤三次（操作同步骤5.1.1）。
    17. 加入DAPI（1 µg/mL溶于无菌去离子水），避光孵育5–10分钟。
    18. 使用配备20倍浸入式物镜的正置显微镜对细胞进行成像。
    19. 每个装置采集50张图像。
    20. 使用ImageJ插件“Directionality”处理图像。
      注意：Directionality参数设置：本研究采用45个角度区间（n = 45），范围从0°至176°，以避免角度环绕效应；方法选择局部梯度方向（local gradient orientation），并启用结果显示表格。方向输出值对应平均矢量角度（表示排列方向），而优度输出值代表平均矢量长度（表示排列程度）。
  2. 活细胞成像
    注意：活细胞成像可在细胞保持自然、活性状态的前提下，实时追踪动态的细胞过程。该技术利用配备培养箱的荧光显微镜，对细胞在生长、分裂或响应刺激过程中的行为进行高分辨率图像或视频采集，从而实现对细胞行为和相互作用的动态研究，为理解细胞功能与动态提供重要信息。
    1. 将SiR-actin以1:1000的比例加入培养基中，37 °C孵育1小时。
    2. 吸去原培养基，更换为1:2000（SiR-actin: 培养基）的稀释液。
      注意：此稀释比例旨在降低长期活细胞成像过程中的细胞毒性。
    3. 在配备培养箱、自动载物台和20倍浸入式物镜的正置显微镜上，每15分钟采集一次免疫荧光图像，持续5小时。
      注意：在活细胞成像实验中，一旦将MRE放入活细胞成像系统，立即加入磁铁。

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结果

基于硅胶的超软磁流变弹性体（MREs）具有可通过施加磁场精确调控的弹性模量。这使得其在生理范围内实现快速、双向的调节，并能精确控制变化的速率和幅度（图1）。凝胶力学性能通过测量弹性模量进行评估，方法如前所述。对于较软的动态范围MRE，有磁场时的平均弹性模量为36.3 ± 5.2 kPa，无磁场时为9.3 ± 1.2 kPa；而对于较硬的MRE，有磁场时为51.3 ± 7.0 kPa，无磁场时为40.2 ± 3.7 kPa（图1）30,33,34。MRE微结构图案采用商用衍射光栅作为模具，通过模塑技术制备，其特征高度约为5.5 µm，节距（峰间距离）约为10 µm。图2展示了母模与MRE基底的归一化特征高度比较图，以及平均特征高度和节距的对比结果。母模和最终MRE培养基底的平均...

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讨论

该技术虽已经过严格验证，但要成功完成实验，必须仔细关注多个步骤。

在本实验方案中，我们使用商用衍射光栅作为图案化的主模具。然而，也可采用其他图案化模具（如硅或SU8微加工模具），以制备不同尺寸的多种图案33,35。一些市售的PDMS材料已预先制备好图案36,37，也可作为有效印章用于构建力学调控环境。虽然使用高速混合器可简化PDMS或硅胶与羰基铁颗粒的混合过程，但通过手动混合结合涡旋振荡，且将振荡时间延长至高速混合器所需时间的约两倍，也可达到相同效果。

许多实验室可能无法获得等离子氧（O2）清洗仪，因此我们提供一种替代的表面处理方法，以更便于分离聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章。该方法无需使用硅烷处理，而可有效采用异丙醇（IPA）与普通洗洁精的混合液。具体操作为配制体积比为2...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分得到了特拉华大学肌肉骨骼研究中心COBRE（P20 GM139760）的支持，资助机构为美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所以及特拉华州政府。我们诚挚感谢特拉华大学复合材料中心（CCM）的Sagar Doshi以及特拉华大学Dhong实验室的Ashika Singh，感谢他们允许我们使用其激光共聚焦显微镜，并为我们材料的表面表征提供了必要的专业技术支持。他们的贡献显著提升了本研究的质量。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
555 Alexa Fluor 山羊抗小鼠二抗 赛默飞世尔科技A-21422https://www.thermofisher.com/antibody/product/山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗多克隆/A-21422
20倍浸入式物镜Zeiss421452-9800-000https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm
35 mm 培养皿赛默飞世尔科技130180https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&研究领域=搜索全部
抗α-肌动蛋白素一抗abcamEP2528Yhttps://www.abcam.com/zh-cn/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq
VVbjJ3ogKUmZxa4GtG
3SyllFzWvb5XPnwgB
羰基铁粉微球chemicalstore.comCIPMShttps://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/
DAPI 染色ThermoFisher ScientificD1306https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306
干燥器Fisher Scientific08-642-7https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword=
衍射光栅Thor LabsGR2550-45031https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031
Ecoflex Gel 组分 A & BSmooth OnEcoflex 凝胶https://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/
扩展型台式等离子清洗机Sigma AldrichZ561657-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657
牛血浆来源的纤连蛋白Sigma AldrichF1141https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141
Flacktek DAC150 SpeedMixer FlacktekDAC150https://flacktek.com/products/small-flacktek/
ImageJ 软件美国国立卫生研究院https://imagej.net/ij/download.html
异丙醇亚马逊https://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz
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227703&关键词=异丙醇
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675756&sr=8-1-spons&sp_csd=d2l
kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1
磁性CMS磁学ND05578-45Nhttps://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/
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烘箱Fisher Scientific15-103-0503https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382
硅油稀释剂Smooth On硅油稀释剂https://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/
SiR-肌动蛋白染色细胞骨架CY-SC001https://www.cytoskeleton.com/sir-actin
Sylgard 184 PDMS（基础剂 + 固化剂）艾利斯沃斯胶粘剂2065622https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/
Sylgard 527 PDMS A 组分 & B艾尔斯沃思胶粘剂1696742https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/
移液管Fisher Scientific13-711-5AMMDhttps://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&13
-711-5AMMD&searchType=
快速&目录号匹配=13
-711-5AMMD
三氯-(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 Sigma Aldrich448931https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931

参考文献

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  4. Abadi, P. P. S. S., et al. Engineering of mature human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes using substrates with multiscale topography. Adv Funct Mater. 28 (19), 1707378(2018).
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