我们介绍一种利用嵌入铁颗粒的超软硅胶弹性体（聚二甲基硅氧烷，PDMS）制备的动态且可逆刚度检测平台。该新型检测方法适用于研究细胞表型中出现的时间依赖性物理变化，包括接触引导效应。在此，我们通过磁力作用诱导基质刚性化，测量新生大鼠心肌细胞的排列情况。
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本文内容
摘要
摘要
基底相关的线索（如力学和拓扑结构）对细胞反应具有深远影响。然而，大多数基础研究采用的是静态或孤立的效应。这些力学效应在细胞响应中的作用方向和时间尺度仍 largely 未被探索。用于研究时变性基底相关刺激如何驱动生理和病理过程的工具，可揭示下一层次的力学生物学机制。本文中，我们使用微图案化的磁流变弹性体（MREs），该材料可在外加磁场作用下快速变硬或软化，从而更严格地探究力学（刚度）和接触引导（拓扑）刺激对新生大鼠心肌细胞取向与排列的影响。通过整合可随时间调节并可逆的动态力学刚度控制，我们能够严格检验负荷的影响：（1）在相同条件下进行预处理；（2）急性改变体外（in vitro）生物力学环境，以准确模拟心肌梗死等具有临床相关性的现象。该方法使我们能够以更真实且可控的方式研究负荷对细胞反应的影响。
引言
心脏高效泵血的能力依赖于心肌的结构及其力学特性（刚度），其中细胞和组织的精确排列对于协调收缩和整体功能至关重要。心肌主要由心肌细胞（CMs）构成，在成人体内，这些细胞呈细长的、近乎杆状的形态，其肌节（心肌细胞的收缩单位）沿细胞长轴方向有序排列。相比之下，胎儿来源或诱导性多能干细胞（iPSC）分化而来的心肌细胞与成人心肌细胞存在显著差异：它们通常形态更趋圆形，仅含一个细胞核，肌节结构紊乱或未对齐，且搏动频率不规则。体内心肌组织的结构相似性有助于实现收缩同步和力的传递；这对于通过体外模型重现天然心肌功能极为关键。为了获得结构特征接近成熟心肌的心肌细胞，既往研究已证明多种促进细胞成熟的策略具有成效，包括调控基底刚度1,2、施加机械应变3、利用接触引导效应4,5，或采用电刺激起搏6,7。
长期以来，人们认识到细胞外环境的刚度会影响细胞行为。人体内存在广泛的刚度差异，从脑组织的数百帕斯卡（Pa）到骨组织的数十吉帕斯卡（GPa）不等
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方案
1. 图案化PDMS印章的制备
注意：PDMS印章因其柔韧性至关重要，便于操作并在制备图案化MRE表面时实现精确接触。印章的柔性特性还可在不损坏图案的前提下轻松从MRE PDMS层上剥离，确保图案的准确转移以及MRE表面的完整保留。
- 准备10 g的10:1（基础剂：固化剂）184 PDMS。
- 将5 g的184 PDMS倒入一个35 mm的培养皿中，并在干燥器中脱气约5–10分钟，直至所有气泡完全消失。
- 将184 PDMS置于60 °C的烘箱中部分固化30分钟。
- 当184 PDMS还剩5分钟完成部分固化时，向衍射光栅上添加一层薄薄的额外184 PDMS，并在干燥器中脱气约5分钟。
- 从烘箱中取出带有部分固化184 PDMS的35 mm培养皿。
- 将带有PDMS的衍射光栅翻转，贴合到35 mm培养皿中部分固化的184 PDMS上。
注意：确保衍射光栅朝下，与35 mm培养皿中部分固化的184 PDMS接触。 - 轻轻按压衍射光栅，直到有少量184 PDMS包围光栅边缘。
- 使用剩余未固化的184 PDMS填充光栅周围的培养皿区域，以确保其在固化过程中保持固定。
- 将含有衍射光栅的培养皿放入设定为60 °C的烘箱中加热1.5小时。
- 待184 PD....
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结果
基于硅胶的超软磁流变弹性体（MREs）具有可通过施加磁场精确调控的弹性模量。这使得其在生理范围内实现快速、双向的调节，并能精确控制变化的速率和幅度（图1）。凝胶力学性能通过测量弹性模量进行评估，方法如前所述。对于较软的动态范围MRE，有磁场时的平均弹性模量为36.3 ± 5.2 kPa，无磁场时为9.3 ± 1.2 kPa；而对于较硬的MRE，有磁场时为51.3 ± 7.0 kPa，无磁场时为40.2 ± 3.7 kPa（图1）30,33,34。MRE微结构图案采用商用衍射光栅作为模具，通过模塑技术制备，其特征高度约为5.5 µm，节距（峰间距离）约为10 µm。图2展示了母模与MRE基底的归一化特征高度比较图，以及平均特征高度和节距的对比结果。母模和最终MRE培养基底的平均.......
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讨论
该技术虽已经过严格验证，但要成功完成实验，必须仔细关注多个步骤。
在本实验方案中，我们使用商用衍射光栅作为图案化的主模具。然而，也可采用其他图案化模具（如硅或SU8微加工模具），以制备不同尺寸的多种图案33,35。一些市售的PDMS材料已预先制备好图案36,37，也可作为有效印章用于构建力学调控环境。虽然使用高速混合器可简化PDMS或硅胶与羰基铁颗粒的混合过程，但通过手动混合结合涡旋振荡，且将振荡时间延长至高速混合器所需时间的约两倍，也可达到相同效果。
许多实验室可能无法获得等离子氧（O2）清洗仪，因此我们提供一种替代的表面处理方法，以更便于分离聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章。该方法无需使用硅烷处理，而可有效采用异丙醇（IPA）与普通洗洁精的混合液。具体操作为配制体积比为2.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分得到了特拉华大学肌肉骨骼研究中心COBRE（P20 GM139760）的支持，资助机构为美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所以及特拉华州政府。我们诚挚感谢特拉华大学复合材料中心（CCM）的Sagar Doshi以及特拉华大学Dhong实验室的Ashika Singh，感谢他们允许我们使用其激光共聚焦显微镜，并为我们材料的表面表征提供了必要的专业技术支持。他们的贡献显著提升了本研究的质量。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 555 Alexa Fluor 山羊抗小鼠二抗 | 赛默飞世尔科技 | A-21422 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗多克隆/A-21422 |
| 20倍浸入式物镜 | Zeiss | 421452-9800-000 | https://www.micro-shop.zeiss.com/zh/us/shop/objectives/421452-9800-000/Objective-W-Plan-Apochromat-20x-1.0-DIC-M27-75mm |
| 35 mm 培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 130180 | https://www.thermofisher.com/search/results?query=130180&研究领域=搜索全部 |
| 抗α-肌动蛋白素一抗 | abcam | EP2528Y | https://www.abcam.com/zh-cn/products/primary-antibodies/alpha-actinin-actn1-antibody-ep2528y-ab81265?srsltid=AfmBOoq4HwHixqCheQwwq VVbjJ3ogKUmZxa4GtG 3SyllFzWvb5XPnwgB |
| 羰基铁粉微球 | chemicalstore.com | CIPMS | https://ironpowders.com/types-of-iron-powder/cipms-carbonyl-iron-powder/ |
| DAPI 染色 | ThermoFisher Scientific | D1306 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D1306 |
| 干燥器 | Fisher Scientific | 08-642-7 | https://www.fishersci.com/shop/products/nalgene-transparent-polycarbonate-classic-design-desiccator/086427#?keyword= |
| 衍射光栅 | Thor Labs | GR2550-45031 | https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=GR2550-45031 |
| Ecoflex Gel 组分 A & B | Smooth On | Ecoflex 凝胶 | https://www.smooth-on.com/products/ecoflex-gel/ |
| 扩展型台式等离子清洗机 | Sigma Aldrich | Z561657-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/z561657 |
| 牛血浆来源的纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F1141 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f1141 |
| Flacktek DAC150 SpeedMixer | Flacktek | DAC150 | https://flacktek.com/products/small-flacktek/ |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.net/ij/download.html | |
| 异丙醇 | 亚马逊 | https://www.amazon.com/Isopropyl-Alcohol-Grade-Anhydrous-gallon/dp/B01M6YK5I4/ref=sr_1_1_sspa?dib=eyJ2IjoiMSJ9.xiBzaAiE5lSJqXz ZhS_JhDh8zEHgkMzrbsyosvyBpS Jjufk90Gt79vk1jOZxq_mG3GKeN8 KT1ulag3ZuMShbWoEOCQUy6txx uGz4709PyUY5YWyeR2GS0PBNx dbmEdWvgmCYiDBLf8E2prhImZW l98MoWlVDU4lg1BtcHTTSOwdg87 5l6Ia3YLPs_0alILBXFsizwwnJodR 8D60ZggK5AHBfCfPadXgfJ-9hUE7 uIto.V3Vf62Lnprtq2u5PRO SbUFHnPOj1FvD7np7uBge6NuU& dib_tag=se&hvadid=598724400239 &hvdev=c&hvlocphy=9007460&hvn etw=g&hvqmt=e&hvrand=1609157 209668794739&hvtargid=kwd-3203 62094308&hydadcr=5273_13 227703&关键词=异丙醇 亚马逊&mcid=9f9d3252906531 3ea89ab7766d9c244c&qid=1740 675756&sr=8-1-spons&sp_csd=d2l kZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1 | |
| 磁性 | CMS磁学 | ND05578-45N | https://www.magnet4sale.com/n45-neodymium-disc-magnet-1-1-2x1-4-35-lb-pull-strong-magnet/ |
| 尼康Eclipse 80i正置显微镜 | 尼康 | Eclipse 80i | |
| 烘箱 | Fisher Scientific | 15-103-0503 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-isotemp-general-purpose-heating-drying-ovens/p-4935382 |
| 硅油稀释剂 | Smooth On | 硅油稀释剂 | https://www.smooth-on.com/products/silicone-thinner/ |
| SiR-肌动蛋白染色 | 细胞骨架 | CY-SC001 | https://www.cytoskeleton.com/sir-actin |
| Sylgard 184 PDMS（基础剂 + 固化剂） | 艾利斯沃斯胶粘剂 | 2065622 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-3.9-kg-kit/ |
| Sylgard 527 PDMS A 组分 & B | 艾尔斯沃思胶粘剂 | 1696742 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-527-silicone-dielectric-gel-clear-0.9-kg-kit/ |
| 移液管 | Fisher Scientific | 13-711-5AMMD | https://www.fishersci.com/shop/products/transfer-pipette-32/137115AMMD?searchHijack=true&13 -711-5AMMD&searchType= 快速&目录号匹配=13 -711-5AMMD |
| 三氯-(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | 448931 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/448931 |
参考文献
- Jacot, J. G., McCulloch, A. D., Omens, J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes. Biophys J. 95 (7), 3479-3487 (2008).
- Körner, A., Mosqueira, M., Hecker, M., Ullrich, N. D.
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