合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

摘要

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。

摘要

简单的巨大单层囊泡（sGUV）是一种微米尺度的球形囊泡，由脂双层构成，内部包裹着水溶液，并悬浮于另一种水性介质中。作为生物细胞的仿生模型，sGUV 已被广泛用于生物物理研究。然而，sGUV 主要模拟无核细胞，限制了其作为有核细胞模型的应用。我们提出复合型巨大单层囊泡（cGUV）作为更合适的有核细胞仿生模型。cGUV 是一种囊泡中包含囊泡的结构，其外层和内层囊泡的脂双层可分别模拟细胞的细胞膜和细胞核膜。

本研究中，我们描述了一种合成cGUV的简单方法。简言之，通过电形成法，在蔗糖介质中使用DMPC和胆固醇作为脂质成分，并将胆固醇摩尔分数控制在37–43%范围内，制备出sGUV。随后，通过引入高渗葡萄糖溶液对这些sGUV施加渗透冲击，诱导其迅速转变为类体细胞形态。该过程形成一种中间状态，其中外层囊泡与内层囊泡仍通过一个颈部结构相连，最终形成囊泡中囊泡结构，即cGUV。

此外，已知在双分子层中胆固醇含量较高的GUVs表现出降低的离子通透性。该特性可通过调节水合介质的电导率，来调控cGUV环形溶液中的电导率。 通过高渗葡萄糖调节内液，通过调节外液 稀释或添加导电介质，从而在外层、环形层和内层区域获得可控电导率的cGUV，适用于电场研究。我们提出这一高效且简便的复合囊泡合成方法，可作为真核有核细胞的仿生模型，推动其在生物物理研究中的应用。

引言

仿生模型已被广泛用于研究细胞膜复杂的生物物理现象。这些最简单的仿生模型通过最大限度减少生物细胞中众多变量的干扰，提供了有价值的研究视角。巨大单层囊泡（Giant Unilamellar Vesicles, GUVs）是研究膜生物物理学的基础性仿生体系^1,2。GUVs 已被公认为细胞膜的代表性模型，其结构由单层球形脂质双分子层构成，直径为 10–30 µm，并被包裹悬浮于水溶液中。本文将此类囊泡称为 sGUVs。这些体系采用自下而上的构建方法，将脂质、蛋白质和催化剂等基本细胞组分组装在一起，以模拟生物膜的结构与功能^3,4。

尽管简单的sGUV（仅包含内部水相核心）被广泛使用，但已开发出更先进的模型以模拟生物细胞的特定特征。例如，由肌动蛋白支撑的GUV可模拟细胞骨架^5,6,7，而高盐环境则用于模拟生理条件。高盐环境虽能更好地模拟生理状态，但在GUV中难以实现，因为传统方法（如电形成法^8,

方案

1. 脂质混合溶液的制备

1. 配制1 mL的DMPC和胆固醇溶液，摩尔比为63:37，终浓度为5 mg/mL。 具体操作为： 加入149 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），252 µL胆固醇（5 mg/mL 的胆固醇氯仿溶液），以及599 µL氯仿。
2. 另配制1 mL的DMPC:胆固醇溶液，摩尔比为57:43，浓度为5 mg/mL，混合139.8 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），301 µL胆固醇（5 mg/mL，由粉末溶于氯仿制备 而成），以及559.2 µL氯仿。
3. 为染色脂双层，向1 mL摩尔比为63:37的DMPC和胆固醇脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入100 µL Nile Red（来自5 mM的储备液）。或者，向1 mL已制备的脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入30 µL Liss Rhod-PE（1 mg/mL的Liss Rhod-PE储备液）。
   注意：由于溶剂（氯仿）具有高挥发性，在多次开启瓶装储备液（25 mg/mL DMPC）使用后，其浓度可能升高 ，从而改变溶液组成。

2. 合成简单巨大单层囊泡（sGUVs）的电形成方案

1. 用洗洁精溶液彻底清洗镀有氧化铟锡（ITO）的载玻片，并用去离....

结果

使用电形成法（如图1所示）合成了sGUVs，并用注射器从腔室中收集。收集后的sGUVs首先在倒置显微镜下观察，并施加渗透冲击以诱导其转变为口形体形态。经过进一步的膜重塑后，该口形体转化为一种称为复合型巨大单层囊泡（cGUV）的囊泡中囊泡结构（图1）。进一步通过共聚焦显微镜对cGUVs进行分析（图2），采用微分干涉差（DIC）和荧光成像技术。通过以1 µm为间隔进行z轴扫描，构建了cGUVs的三维重建图像。三维图像清晰显示，内层囊泡完全与外层囊泡分离，并位于较高的z平面。内层囊泡的这一位置归因于内层囊泡溶液（蔗糖+葡萄糖）的密度低于环形区域溶液（蔗糖）的密度。

在中间状态，当sGUV转变为凹形体（stomatocyte）形状时，外部溶液被包裹并成为内层囊泡内部溶液的一部分。然而，内层和外层囊泡仍通过一个狭窄的连接颈保持连通（图3 和

讨论

脂质的组成和类型在很大程度上决定了构成大单层囊泡（GUV）的双层膜的力学性质。由DMPC/Chol组成的双层膜在受到渗透冲击时会表现出独特的形态转变。在强烈的高渗渗透冲击下，小GUV（sGUV）内部的水相液体被排出，导致GUV双层膜发生形变。所观察到的形态转变主要受水分外流速率和双层膜弯曲刚性的共同影响。这些形变可呈现多种形式，包括星形和哑铃形，具体形态取决于渗透冲击的强度以及双层膜的脂质组成。

有趣的是，DMPC-胆固醇双分子层的固有特性有利于在室温下诱导sGUV转变为口形体（stomatocyte）形态。在此转变过程中，颈部区域的收缩导致形成囊泡中囊泡（VIV）结构。在最终的VIV结构中，内层囊泡与外层囊泡完全分离。先前的研究报道，当使用纯水制备囊泡并利用葡萄糖诱导渗透冲击时，对于DMPC/Chol摩尔比为70:30的双分子层组成，内层囊泡可在约30秒内实现完全分离¹⁵。相比之下，我们采用67:37 DMPC:Chol摩尔比的组分，在蔗糖溶液中合成sGUV，并通过在外层悬浮液中添加葡萄糖以产生密度差异，使囊泡沉降至观察腔底部，便于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胆固醇（Sigma 级，99%）	Avanti Polar Lipids, Inc.	C8667	用于 sGUV 合成
氯仿	Merck Life Science Pvt. Ltd.	DA2P711602	用于配制脂质储备液的溶剂
DMPC	Avanti Polar Lipids, Inc.	850345C	用于 sGUV 合成
乙醇	Hayman	F204325	用于清洁 ITO 载玻片
荧光素标记葡聚糖（4 Kda 分子量）	Sigma-Aldrich	466994	用于包封在 cGUV 内囊泡中
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-7021	用于配制葡萄糖溶液，对悬浮于蔗糖溶液中的 sGUV 进行渗透冲击
Liss Rhod PE	Sigma-Aldrich	810150C-1MG	用于染色脂质分子
尼罗红	Sigma-Aldrich	72485	用于染色 cGUV 和 sGUV 膜
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	1936060521	用于配制盐储备液，以改变 cGUV 腔室的电导率
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378	用作电形成腔室的水合介质的蔗糖溶液
仪器设备
凹面载玻片	Blue star		用于显微镜观察 cGUV 悬液
cMOS pco.edge 4.2 相机	Excelitas	61009524	用于获取荧光单色 图像和微分干涉相差（DIC）图像
盖玻片（22 × 60 mm）	Blue star		用于覆盖凹面载玻片
Eppendorf 电融合腔室	Sigma-Aldrich		将 sGUV 悬液置于腔室内进行渗透和显微观察，也可使用其他简易腔室
函数发生器（双通道）	Tektronix	AFG3022C	用于向电形成 腔室施加交流电场
培养箱	本地定制		将电形成腔室置于 40?
ITO 载玻片	Sigma-Aldrich	576352-10PAK	电形成法中使用的 ITO 载玻片
Nikon Eclipse 倒置显微镜	Nikon	TE2000-U	用于观察 sGUV 和 cGUV
硅胶垫片（3 mm  厚度）	Sigma-Aldrich	GF49463141	用于电形成腔室中的间隔
注射器（2 mL）	Becton Dickinson India Pvt Ltd.	300844	用于注入水合介质以及从电形成腔室中收集 sGUV
蔡司共聚焦显微镜系统	印度理工学院孟买分校中心设施