合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

摘要

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。

摘要

简单的巨大单层囊泡（sGUV）是一种微米尺度的球形囊泡，由脂双层构成，内部包裹着水溶液，并悬浮于另一种水性介质中。作为生物细胞的仿生模型，sGUV 已被广泛用于生物物理研究。然而，sGUV 主要模拟无核细胞，限制了其作为有核细胞模型的应用。我们提出复合型巨大单层囊泡（cGUV）作为更合适的有核细胞仿生模型。cGUV 是一种囊泡中包含囊泡的结构，其外层和内层囊泡的脂双层可分别模拟细胞的细胞膜和细胞核膜。

本研究中，我们描述了一种合成cGUV的简单方法。简言之，通过电形成法，在蔗糖介质中使用DMPC和胆固醇作为脂质成分，并将胆固醇摩尔分数控制在37–43%范围内，制备出sGUV。随后，通过引入高渗葡萄糖溶液对这些sGUV施加渗透冲击，诱导其迅速转变为类体细胞形态。该过程形成一种中间状态，其中外层囊泡与内层囊泡仍通过一个颈部结构相连，最终形成囊泡中囊泡结构，即cGUV。

此外，已知在双分子层中胆固醇含量较高的GUVs表现出降低的离子通透性。该特性可通过调节水合介质的电导率，来调控cGUV环形溶液中的电导率。 通过高渗葡萄糖调节内液，通过调节外液 稀释或添加导电介质，从而在外层、环形层和内层区域获得可控电导率的cGUV，适用于电场研究。我们提出这一高效且简便的复合囊泡合成方法，可作为真核有核细胞的仿生模型，推动其在生物物理研究中的应用。

引言

仿生模型已被广泛用于研究细胞膜复杂的生物物理现象。这些最简单的仿生模型通过最大限度减少生物细胞中众多变量的干扰，提供了有价值的研究视角。巨大单层囊泡（Giant Unilamellar Vesicles, GUVs）是研究膜生物物理学的基础性仿生体系^1,2。GUVs 已被公认为细胞膜的代表性模型，其结构由单层球形脂质双分子层构成，直径为 10–30 µm，并被包裹悬浮于水溶液中。本文将此类囊泡称为 sGUVs。这些体系采用自下而上的构建方法，将脂质、蛋白质和催化剂等基本细胞组分组装在一起，以模拟生物膜的结构与功能^3,4。

尽管简单的sGUV（仅包含内部水相核心）被广泛使用，但已开发出更先进的模型以模拟生物细胞的特定特征。例如，由肌动蛋白支撑的GUV可模拟细胞骨架^5,6,7，而高盐环境则用于模拟生理条件。高盐环境虽能更好地模拟生理状态，但在GUV中难以实现，因为传统方法（如电形成法^8,9）通常不适合在该条件下合成微米级GUV。较新的方法（如凝胶辅助法）通过使用聚合物或淀粉凝胶在水合过程中促进双层膜膨胀，从而克服了这些限制^10,11。类似地，sGUV的形态变化也已被研究¹²。封闭或开放的纤维结构（如包封的肌动蛋白、微管及其他细胞骨架组分）具有不同的刚性，其内部渗透压应力条件会影响这些因渗透作用而收缩、但初始呈准球形囊泡的形态转变。理论分析揭示了多种形态转变，包括管状、球状、拍子状、樱桃状及液滴状结构，与实验观察结果高度一致¹²。这些发现对于理解细胞和囊泡内纤维、微管及纳米环的组织方式具有重要意义。其他研究综述了蛋白质包封的方法，并探讨了包封的肌动蛋白、微管及细胞骨架组分如何调控渗透性收缩囊泡的形状^12,13。

此外，受真核细胞结构的启发，研究人员开发了基于GUV的复杂模型，旨在构建模拟真核细胞分裂与细胞分裂、繁殖能力、多区室特征、自复制细胞^14,15,16,17以及多区室细胞的人工模型。除了在结构上的应用外，GUV也是研究细胞电穿孔的理想模型——该过程指施加的电场因麦克斯韦应力而在脂质膜上诱导形成孔道。GUV的尺寸与生物细胞相当，在电场作用下可表现出电致变形和电穿孔现象。对GUV的此类研究有助于理解膜电容和弯曲刚度等机电特性¹⁸，以及电穿孔的机制^2,19,20。然而在实际应用中，这些研究最能代表无核细胞，例如红细胞（RBCs）。

为弥合这一差距，我们提出将复合型巨大单层囊泡（cGUVs）作为一种新型的模拟有核真核细胞的生物仿生模型^21,22。这些囊泡具有囊泡内套囊泡的结构，其中内层双分子层模拟细胞核膜，外层双分子层代表细胞质膜。此外，我们展示了如何在无需微操作仪或微注射器等复杂仪器的情况下，调控内层、环形区域及外层区域的电导率。这种简化合成cGUVs的方法为推进有核细胞的生物物理研究提供了一个有前景的平台。

方案

1. 脂质混合溶液的制备

1. 配制1 mL的DMPC和胆固醇溶液，摩尔比为63:37，终浓度为5 mg/mL。 具体操作为： 加入149 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），252 µL胆固醇（5 mg/mL 的胆固醇氯仿溶液），以及599 µL氯仿。
2. 另配制1 mL的DMPC:胆固醇溶液，摩尔比为57:43，浓度为5 mg/mL，混合139.8 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），301 µL胆固醇（5 mg/mL，由粉末溶于氯仿制备 而成），以及559.2 µL氯仿。
3. 为染色脂双层，向1 mL摩尔比为63:37的DMPC和胆固醇脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入100 µL Nile Red（来自5 mM的储备液）。或者，向1 mL已制备的脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入30 µL Liss Rhod-PE（1 mg/mL的Liss Rhod-PE储备液）。
   注意：由于溶剂（氯仿）具有高挥发性，在多次开启瓶装储备液（25 mg/mL DMPC）使用后，其浓度可能升高 ，从而改变溶液组成。

2. 合成简单巨大单层囊泡（sGUVs）的电形成方案

1. 用洗洁精溶液彻底清洗镀有氧化铟锡（ITO）的载玻片，并用去离子水（0.055 µS/cm）冲洗。再用100%乙醇溶液清洗载玻片，再次用去离子水冲洗，然后在85 °C的烘箱中干燥。
2. 使用钳形电流表确定ITO镀膜载玻片的导电面。将清洗后的ITO镀膜载玻片固定在旋涂仪载物台上，利用真空吸附，使导电面朝上。
3. 取25 µL脂质溶液（按步骤1.1制备），在ITO载玻片的导电面上滴加四滴。另取一片ITO载玻片，同样在其导电面上滴加四滴25 µL的脂质溶液（按步骤1.2制备）。
4. 将两片涂有脂质的载玻片置于避光的干燥器中真空干燥至少2小时。
   注意：避光可防止脂质发生可能的化学变化。
5. 将一片涂有脂质的ITO载玻片（使用步骤1.1制备的脂质）与另一片洁净的ITO载玻片平行放置，使导电面相对，中间夹入厚度为3 mm的硅橡胶垫片。用夹具密封组装件，形成一个稳固的电形成腔室。
6. 对使用步骤1.2制备的脂质溶液涂覆的ITO载玻片，按照步骤2.5所述相同程序构建电形成腔室。
7. 将两个腔室置于温度维持在38–40 °C的培养箱中，使用2 mL注射器向腔室内注入100 mM蔗糖溶液。利用双通道函数发生器施加5 Vpp、频率10 Hz的交流电场，持续4小时。
   注意：确保ITO载玻片的导电面正确夹接到连接函数发生器的鳄鱼夹上。
8. 断开电形成腔室与函数发生器的连接。将腔室从培养箱中取出，静置冷却至室温。使用注射器分别从两个腔室中收集合成的sGUVs，并转移至两个2 mL微量离心管中，在室温（25–27 °C）下孵育1小时，随后进行渗透冲击处理。

3. 渗透休克中的形态转变（sGUV 转 Stomatocyte 再转 cGUV）

1. 将200 µL悬浮于含100 mM蔗糖溶液的水合介质中的sGUVs转移至观察室。
2. 向观察室中含200 µL 100 mM蔗糖的sGUVs悬浮液中加入125 µL葡萄糖溶液（300 mM），以诱导渗透冲击，启动sGUVs的形态转变。
   注意：对于由步骤1.1和1.2中给出的脂质组成合成sGUVs以进行渗透冲击驱动的形态转变，请遵循步骤3中所述的相同程序。
3. 将经历渗透冲击的sGUVs置于显微镜载物台上的观察室内静置1小时。
4. 为进行并观察sGUVs的形态转变，将 观察室（电融合室、培养皿、凹面载玻片或任何可用于显微观察的腔室）放置在倒置显微镜的载物台上，并让囊泡沉降。
5. 监测观察室内发生的形态转变。使用微分干涉差（DIC）显微镜和落射荧光显微镜，配备Plan fluor ELWD 20x/0.45和Plan fluor ELWD 40x/0.60物镜，观察sGUVs的形态变化。
6. 观察转变过程中口形囊泡的形成。随时间推移持续监测观察室，较大的囊泡首先沉降至底部，随后出现数量增多的小型囊泡。

4. 改变cGUVs内层、环形及外层区域的导电性

1. 通过在不同区域（内腔、环形区域和外侧）的cGUVs中加入适量（µL）的7.5 mM储备盐溶液，调节各区域溶液的电导率 对sGUVs施加渗透冲击。
   1. 例如，为了使外层和内层的导电性高于环形区域，将200 µL蔗糖溶液转移至电融合室中，再向室内加入20 µL 7.5 mM盐溶液。通过加入125 µL 300 mM葡萄糖溶液以诱导渗透冲击。
   2. 让经渗透休克处理的sGUVs静置3-4小时。 在此情况下，cGUVs 的外侧和内侧区域的电导率高于末端环形区域。
2. 使用函数发生器在含有间距为500 µm导线电极的电融合室中施加7.5 Vpp、100 kHz的交流电场，对cGUVs进行电致变形。
3. 施加交流电场后，以每秒10帧的速度采集视频，观察到外层囊泡呈扁球形形变，内层囊泡呈长球形形变，表明在cGUV结构域中，外层和内层区域的电导率高于环形区域。

5. cGUVs 的显微镜分析

1. 倒置显微镜成像：使用倒置显微镜结合单色相机进行微分干涉差（DIC）和落射荧光显微镜观察。采用平场萤石、超长工作距离（ELWD）20倍/0.45和40倍/0.60物镜，观察sGUVs的形态转变。在落射荧光研究中，对尼罗红染色的双分子层使用绿色滤光片（激发波长510-560 nm，二向色镜575 nm，吸收波长590 nm）。
   注意：DIC图像可提供连接颈状态的重要信息，确认其是否保持完整或已融合形成cGUVs。
2. 使用ImageJ软件插入比例尺并对显微图像进行裁剪。添加比例尺时，依次选择 分析 | 设置比例尺 对图像进行校准，然后选择 分析 | 工具 | 比例尺 插入比例尺。
3. 共聚焦显微镜用于形态学观察：为更清晰地了解cGUVs的形态结构， 采用激光扫描共聚焦显微镜进行z轴扫描，步长为1 µm。共聚焦显微成像：使用配备平场复消色差40倍/1.3油镜DIC物镜的激光扫描共聚焦显微镜对cGUVs进行成像。采用红色单通道模式对尼罗红或罗丹明-PE染色的cGUVs进行成像，激发波长为561 nm，发射波长范围为561-695 nm。
4. 在显微镜配套软件中修改并导出图像的.czi文件，插入比例尺等图形，并启用 2D、3D视图，然后进入 处理 | 方法 | 参数，点击 应用 以获得JPG格式图像。
5. 共聚焦显微镜样品准备：将含有cGUVs的水溶液注入经改装的定制样品腔（底部玻璃替换为盖玻片），用于共聚焦成像。静置样品10-15分钟，使cGUVs充分沉降；将cGUVs混合液加入凹面载玻片腔室，并用盖玻片密封，以固定cGUVs的运动。随后，通过共聚焦显微镜进行z轴扫描（间隔1 µm）分析cGUVs。

结果

使用电形成法（如图1所示）合成了sGUVs，并用注射器从腔室中收集。收集后的sGUVs首先在倒置显微镜下观察，并施加渗透冲击以诱导其转变为口形体形态。经过进一步的膜重塑后，该口形体转化为一种称为复合型巨大单层囊泡（cGUV）的囊泡中囊泡结构（图1）。进一步通过共聚焦显微镜对cGUVs进行分析（图2），采用微分干涉差（DIC）和荧光成像技术。通过以1 µm为间隔进行z轴扫描，构建了cGUVs的三维重建图像。三维图像清晰显示，内层囊泡完全与外层囊泡分离，并位于较高的z平面。内层囊泡的这一位置归因于内层囊泡溶液（蔗糖+葡萄糖）的密度低于环形区域溶液（蔗糖）的密度。

在中间状态，当sGUV转变为凹形体（stomatocyte）形状时，外部溶液被包裹并成为内层囊泡内部溶液的一部分。然而，内层和外层囊泡仍通过一个狭窄的连接颈保持连通（图3 和

讨论

脂质的组成和类型在很大程度上决定了构成大单层囊泡（GUV）的双层膜的力学性质。由DMPC/Chol组成的双层膜在受到渗透冲击时会表现出独特的形态转变。在强烈的高渗渗透冲击下，小GUV（sGUV）内部的水相液体被排出，导致GUV双层膜发生形变。所观察到的形态转变主要受水分外流速率和双层膜弯曲刚性的共同影响。这些形变可呈现多种形式，包括星形和哑铃形，具体形态取决于渗透冲击的强度以及双层膜的脂质组成。

有趣的是，DMPC-胆固醇双分子层的固有特性有利于在室温下诱导sGUV转变为口形体（stomatocyte）形态。在此转变过程中，颈部区域的收缩导致形成囊泡中囊泡（VIV）结构。在最终的VIV结构中，内层囊泡与外层囊泡完全分离。先前的研究报道，当使用纯水制备囊泡并利用葡萄糖诱导渗透冲击时，对于DMPC/Chol摩尔比为70:30的双分子层组成，内层囊泡可在约30秒内实现完全分离¹⁵。相比之下，我们采用67:37 DMPC:Chol摩尔比的组分，在蔗糖溶液中合成sGUV，并通过在外层悬浮液中添加葡萄糖以产生密度差异，使囊泡沉降至观察腔底部，便于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胆固醇（Sigma 级，99%）	Avanti Polar Lipids, Inc.	C8667	用于 sGUV 合成
氯仿	Merck Life Science Pvt. Ltd.	DA2P711602	用于配制脂质储备液的溶剂
DMPC	Avanti Polar Lipids, Inc.	850345C	用于 sGUV 合成
乙醇	Hayman	F204325	用于清洁 ITO 载玻片
荧光素标记葡聚糖（4 Kda 分子量）	Sigma-Aldrich	466994	用于包封在 cGUV 内囊泡中
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-7021	用于配制葡萄糖溶液，对悬浮于蔗糖溶液中的 sGUV 进行渗透冲击
Liss Rhod PE	Sigma-Aldrich	810150C-1MG	用于染色脂质分子
尼罗红	Sigma-Aldrich	72485	用于染色 cGUV 和 sGUV 膜
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	1936060521	用于配制盐储备液，以改变 cGUV 腔室的电导率
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378	用作电形成腔室的水合介质的蔗糖溶液
仪器设备
凹面载玻片	Blue star		用于显微镜观察 cGUV 悬液
cMOS pco.edge 4.2 相机	Excelitas	61009524	用于获取荧光单色 图像和微分干涉相差（DIC）图像
盖玻片（22 × 60 mm）	Blue star		用于覆盖凹面载玻片
Eppendorf 电融合腔室	Sigma-Aldrich		将 sGUV 悬液置于腔室内进行渗透和显微观察，也可使用其他简易腔室
函数发生器（双通道）	Tektronix	AFG3022C	用于向电形成 腔室施加交流电场
培养箱	本地定制		将电形成腔室置于 40?
ITO 载玻片	Sigma-Aldrich	576352-10PAK	电形成法中使用的 ITO 载玻片
Nikon Eclipse 倒置显微镜	Nikon	TE2000-U	用于观察 sGUV 和 cGUV
硅胶垫片（3 mm  厚度）	Sigma-Aldrich	GF49463141	用于电形成腔室中的间隔
注射器（2 mL）	Becton Dickinson India Pvt Ltd.	300844	用于注入水合介质以及从电形成腔室中收集 sGUV
蔡司共聚焦显微镜系统	印度理工学院孟买分校中心设施