方法文章

新型低二甲基亚砜冷冻保护剂在造血干细胞保存中的研发

DOI：

10.3791/68275

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2025年6月20日

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1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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该方案采用一种含有极低浓度二甲基亚砜的造血干细胞冻存保护剂，证明了其在保护造血干细胞方面的临床安全性和有效性，为临床自体干细胞移植中的造血干细胞冻存提供了一种新策略。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

外周血造血干细胞（PBHSC）冻存对自体干细胞移植（ASCT）至关重要，但传统冻存保护剂（TCPA）含有10%二甲基亚砜（DMSO），存在毒性风险，引发安全性担忧。本研究旨在验证一种新型低DMSO冻存保护剂（CPA，含2% DMSO）在-80 °C条件下用于PBHSC冻存的有效性，从而无需液氮储存。来自六名供体的PBHSC被分为CPA组和TCPA组。CPA以1:1体积比与PBHSC混合后直接存于-80 °C。TCPA（含10% DMSO和5%人血清白蛋白）则需逐步降温（1 °C/min）并储存于液氮中。一个月后，两组样本均在37 °C水浴中复苏。比较两组细胞的存活率、细胞骨架完整性（微丝/微管）、线粒体活性及集落形成能力。复苏后，CPA组（91.29%）与TCPA组（90.07%）的PBHSC存活率相当。然而，在细胞活力检测中，CPA表现优于TCPA（CPA：89.38% vs. TCPA：79.55%；p < 0.05）。细胞骨架分析显示，CPA保存的细胞中微丝和微管结构完整，其结构清晰度优于TCPA组。CPA处理组细胞的线粒体活性与新鲜PBHSC相似，且比TCPA组高出8.5%（p < 0.05），线粒体复合体数量也更多。集落形成实验进一步证实了CPA的优越性，诱导后集落数量更高。CPA可在-80 °C实现安全、便捷的PBHSC冻存，仅使用极低浓度DMSO（2%），无需依赖液氮。其更优的细胞活力和线粒体保护效果提示其在临床上具有优势，可降低回输时的毒性风险。该方案为ASCT提供了一种变革性策略，优化了安全性和操作效率。

引言

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自体造血干细胞移植（ASCT）是多种血液系统恶性肿瘤（包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤）的成熟治疗手段，在这些疾病中可作为一线或二线治疗方案，用于在强化化疗或放疗后重建造血功能并恢复免疫能力1,2,3,4,5,6,7。ASCT的成功结果在很大程度上依赖于冻存外周血造血干细胞（PBHSCs）的活力，这些细胞必须保持重建造血和免疫功能的能力8,9,10,11,12。造血干细胞的保存是ASCT中的关键步骤，因为在自体造血干细胞采集后，患者通常需接受放疗、化疗及其他治疗以清除肿瘤细胞。造血干细胞保存的质量直接关系到造血和免疫重建的成败13,14,15,16,17,18。为确保造血干细胞在冻存后的活力，临床实践中常添加人血白蛋白和二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂（CPA）。这些成分对于维持细胞在冻存过程及复苏后的活性至关重要。通常使用的DMSO浓度范围为5%至10%（v/v）。研究表明，维持至少3.5%至10%（v/v）的DMSO浓度可提高造血干细胞冻存的效果19,20。然而，DMSO的临床应用仍存在局限性，因其具有剂量依赖性毒性，30%–60%的移植受者会出现恶心、呕吐和低血压等不良反应21,22。为克服传统含5%–10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻保护剂（CPA）的局限性，本研究旨在开发一种新型冷冻保护剂，可在-80 °C条件下使用极低浓度DMSO（2% v/v）实现安全高效的PBHSC冻存，从而避免复杂的液氮操作流程，并减轻与DMSO相关的毒性。

基于海藻糖或聚合物增强型的冷冻保护剂（CPA）等新兴替代方案在临床前研究中展现出潜力，但由于监管障碍或与标准复温程序不兼容，其临床转化仍面临挑战23。相比之下，本研究所用的 CPA 建立在 HSA-DMSO 系统已确立的安全性基础之上，同时引入了优化的添加剂比例，从而增强细胞保护效果。该方法特别适用于缺乏液氮基础设施或需要快速操作流程的临床中心。然而，对于长期储存（>2 年），液氮仍是更优选择24。临床医生应在操作流程的简便性与个体患者对 DMSO 的耐受性之间进行权衡，确保该策略的个体化应用，以在造血干细胞移植中实现安全性和操作效率的最大化。

本研究中，采用降低二甲基亚砜（DMSO）含量的冷冻保护剂是一种关键策略，可在最大限度保留造血干细胞冷冻保存效果的同时，减少相关毒性。本研究评估了一种新开发的造血干细胞冷冻保护剂（CPA）在保存外周血造血干细胞（PBHSCs）方面的有效性、安全性和操作便利性。采用一种基于新型CPA的简单直接冷冻方法，避免了传统的冷冻保存程序。研究结果表明，使用低浓度DMSO的CPA在-80 °C条件下对细胞悬液进行一步式冷冻保存，其保存效果优于传统冷冻保护剂（TCPA）。该方法可能为简化造血干细胞移植（HSCT）的临床流程提供新的策略。

方案

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2020年6月至2022年6月期间，中国深圳肿瘤医院血液科招募了接受自体造血干细胞移植（ASCT）的血液系统肿瘤患者。在造血干细胞移植（HSCT）动员前后采集了血细胞样本，包括2例急性髓系白血病（AML）、2例霍奇金淋巴瘤（HL）、1例皮肤真正组织细胞淋巴瘤（CGHL）和1例原发性纵隔B细胞淋巴瘤（PMBL），中位年龄为53岁，年龄范围为35至61岁。本研究获得了患者的知情同意，并经中国深圳肿瘤医院伦理审查委员会批准，伦理批件号为AF-SC-07-2.0。所有动物实验程序均经中国医学科学院肿瘤医院实验动物伦理委员会批准（批准号：NCC2018A073），并符合国际动物研究指南。

1. 造血干细胞样本的分装与冷冻保存

  1. 无菌工作站的准备
    1. 彻底洗手并佩戴无菌口罩和手套。使用75%乙醇对手部、手腕和肘部进行消毒。
    2. 将所有备用器械（移液器、止血钳）通过高压灭菌或紫外照射灭菌。在生物安全柜内摆放以下材料：1 mL无菌无热原移液器吸头（2盒）、1000 µL移液器、无菌1.8 mL冻存管、50 mL离心管以及冻存管储存盒（程序化冷冻盒）。
  2. 标记与细胞-冷冻保护剂混合
    1. 在冻存管上标注样本编号、日期、细胞数量及供体姓名。
    2. 使用无菌输液管将含有180–200 mL造血干细胞的造血干细胞袋与含有100 mL新型低DMSO冷冻保护剂的袋子连接。
    3. 用无菌止血钳夹住管路中段。将一端连接至细胞-冷冻保护剂混合袋，另一端连接至50 mL离心管。
  3. 分装与冷冻保存
    1. 松开止血钳，使细胞-冷冻保护剂混合液受控流入离心管中。
    2. 使用移液器从离心管中吸取1 mL等分试样，转移至预先标记的冻存管中（每样本30管）。拧紧管盖，并将冻存管放入储存盒中。
  4. 储存与运输
    1. 立即将储存盒转移至-80 °C冰箱中。运输时，将冻存管置于干冰（-78.5 °C）中，并进行温度监测。

2. PBHSCs 的冷冻保存与复苏

  1. CPA 和 TCPA 的制备与混合
    1. 将冰平台预冷至 2–8 °C。根据制造商说明解冻造血干细胞 CPA 和 TCPA（CPA/TCPA 组成见表 1）。
    2. 在冰平台上，按 1:1 体积比将 CPA 和 TCPA 与六份 PBHSC 样品混合。将细胞悬液转移至无菌冻存管中。
  2. CPA 冻存
    1. 将冻存管直接放入 -80 °C 冰箱中。确保悬液中 DMSO 的终浓度为 2%（v/v）。样品保存 1 个月。
  3. TCPA 冻存（对照组）
    1. 制备含 5% 人血白蛋白和 10% DMSO（v/v）的 TCPA。将 PBHSC 悬液装入冻存管中，使用程序降温仪以 1°C/min 的速率冷却至 -80 °C。
    2. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。样品保存 1 个月。
  4. 细胞复苏
    1. 1 个月后取出冻存管。在 37 °C 水浴中轻轻振荡解冻细胞（≤ 5 分钟）。
    2. 以 300 x g 离心 10 分钟，去除残留的 CPA/TCPA。将 1 mL 细胞重悬于预热的 RPMI 1640 培养基中，用于后续检测。

3. 细胞活力检测

  1. 基于图像的细胞计数
    1. 配制混合染色液，其中含 10 µg/mL 嗜酸性橙（AO）和 10 µg/mL 碘化丙啶（PI）。
    2. 在无菌微量离心管中，将 100 µL 细胞悬液与 100 µL 染色液按 1:1 比例混合。
    3. 取 10 µL 染色后的样品加入自动细胞计数仪中。使用集成软件分析细胞活力：
      ​活力 = 活细胞数 / 总细胞数 × 100%
  2. 流式细胞术验证
    1. 在 100 µL 结合缓冲液中加入 Annexin V-FITC（5 µL）和 PI（5 µL），配制 Annexin V-FITC/PI 染色液。
    2. 将 300 µL 细胞悬液加入染色液中，于 25 °C 避光孵育 15 分钟。
    3. 将混合液在 300 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清液。用 500 µL PBS 重悬细胞，使用流式细胞仪分析细胞活力25。

4. 集落形成实验

  1. 细胞悬液制备
    1. 将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按1:1比例混合，孵育3分钟以区分活细胞与死细胞。使用自动细胞计数仪进行重复计数，确定活细胞密度（确保细胞活力>90%）。调整细胞悬液体积至目标浓度（1 × 106 个细胞/mL），并通过40 µm细胞筛过滤，以确保单细胞分散状态。再用40 µm无菌细胞筛过滤细胞悬液，去除细胞团块。
  2. 培养基混合
    1. 在15 mL锥形管中，将1 mL细胞悬液与9 mL商用小鼠集落形成单位培养基混合（体积比1:10）。
    2. 涡旋振荡混合物，转速1,500 rpm，持续30秒，以确保均匀；随后以100 × g 离心10秒，以消除气泡。
  3. 细胞接种与湿度设置
    1. 将1.5 mL无气泡的混合液加入35 mm无菌培养皿中。向培养皿边缘凹槽内加入3 mL无菌蒸馏水（或在皿盖内放置一个独立的无菌容器），以维持湿度。
    2. 将培养皿密封于湿化培养室中（湿度≥95%）。
      1. 制备培养室时，将两层无菌吸水纸置于带盖塑料容器内（例如15 cm培养皿），加入10 mL无菌去离子水以浸透纸层。将含细胞的培养皿置于培养室中央，确保培养皿不与湿润纸张直接接触。用透明封口膜在盖子与容器连接处缠绕3圈，实现气密性密封；或使用实验室胶带密封盖子边缘。将密封后的培养室在37 °C孵育30分钟，使内部湿度平衡至≥95%。
  4. 集落培养与计数
    1. 在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞16天。使用倒置显微镜在40倍放大倍数下计数造血集落（每簇≥50个细胞）。计算每1 × 104个接种细胞中的集落形成单位（CFUs）。

5. 线粒体活性检测

  1. 使用罗丹明123进行细胞染色
    1. 将PBHSCs重悬于1 mL RPMI1640培养基中，细胞密度为1 × 106 个细胞/mL。加入罗丹明123染料，使其终浓度为5–10 µM。在37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟。
    2. 将细胞悬液在300 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL新鲜RPMI1640培养基中。再次离心后，重悬于1 mL PBS中。
  2. 共聚焦显微镜分析
    1. 用无尘纸擦拭干净的载玻片，以去除灰尘或污染物。
    2. 将染色后的PBHSCs重悬于PBS中，调整至适当密度以避免信号重叠。用移液器吸取10–20 µL细胞悬液，缓慢滴加至载玻片中央。
    3. 将盖玻片倾斜至45°角，轻轻接触液滴边缘，并逐渐放下以尽量减少气泡产生。轻压盖玻片，确保细胞均匀铺展成单层。
    4. 将载玻片水平放置于避光环境中5分钟，使细胞充分沉降。随后立即进行共聚焦显微镜分析。
    5. 将染色细胞置于载玻片上，使用共聚焦显微镜观察线粒体分布（激发/发射波长：488/525 nm）。
  3. 流式细胞术定量分析
    1. 使用流式细胞仪（FL1通道）分析罗丹明123荧光强度。以经1 mM过氧化氢处理1小时的PBHSCs作为阳性对照26。

6. PBHSCs 的细胞骨架染色

  1. 微丝染色（肌动蛋白示踪剂 Green-488）
    1. 制备终浓度为 5 U/mL 的 AF488 标记鬼笔环肽荧光探针 PBS 溶液。取 5 µL 储存液（200 U/mL，甲醇溶液）加入 195 µL PBS 中（1:40 稀释），充分涡旋振荡 10 秒以确保均匀。
    2. 向 PBHSCs 中加入 200 µL 配制好的肌动蛋白示踪剂 Green-488 工作液（5 U/mL），在 25 °C 避光孵育 30 分钟。
    3. 用免疫染色洗涤缓冲液（PBS 中含 0.1% Triton X-100）洗涤细胞两次，每次 1 mL。再加入 200 µL DAPI（1 µg/mL）在 25 °C 避光对细胞核进行复染，孵育 5 分钟。
  2. 微管染色（微管蛋白示踪剂 Red）
    1. 制备终浓度为 1 µM 的红外标记紫杉醇荧光探针 PBS 溶液。取 10 µL 储存液（100 µM，DMSO 溶液）加入 990 µL PBS 中（1:100 稀释），涡旋振荡 10 秒以确保均匀，并避光保存。
    2. 在完全培养基中配制终浓度为 250 nM 的微管蛋白示踪剂 Red 工作液。取 2.5 µL 储存液（1 mM，DMSO 溶液）加入 997.5 µL 培养基中（1:400 稀释），涡旋振荡 10 秒后，取 200 µL 加入 PBHSCs 中，在 25 °C 避光孵育 30 分钟。
    3. 用免疫染色洗涤缓冲液洗涤细胞两次，每次 1 mL。再加入 200 µL DAPI（1 µg/mL）在 25 °C 避光对细胞核进行复染，孵育 5 分钟。
  3. 封片与显微镜观察
    1. 用 PBS 洗涤染色后的细胞两次。将染色细胞与 90% 甘油-PBS 溶液（90% 甘油和 10% PBS，v/v）按 1:1 体积比混合。取 10 µL 混合液滴加至载玻片上，以 45° 角缓慢放下盖玻片，避免产生气泡。
    2. 使用荧光显微镜观察肌动蛋白/微管形态（肌动蛋白 Green 的激发波长为 488 nm，微管蛋白 Red 为 561 nm）。设置阳性对照：使用 5 µM Cytochalasin B 处理 PBHSCs 2 小时以诱导肌动蛋白破坏，使用 10 µM Colchicine 处理 PBHSCs 3 小时以诱导微管去聚合。

7. CPA 安全性评估

  1. 溶血试验
    1. 使用经EDTA抗凝的新鲜兔血制备2%红细胞悬液。
    2. 在玻璃试管中，向2.5 mL细胞悬液加入CPA（0.1–0.5 mL）和生理盐水（2.0–2.4 mL）。
    3. 以生理盐水作为阴性对照，灭菌水作为阳性对照，于37 °C孵育3小时，显微镜下观察溶血或凝集现象。
  2. 全身过敏性试验
    1. 动物准备
      1. 选用36只4–5周龄SPF级Hartley豚鼠（雄性占50%，体重271–307 g；雌性占50%，体重270–301 g）。饲养条件如下：温度：16–26 °C（每日波动±4 °C），湿度：40%–70%，通风：8–10次/小时换气，光照周期：12小时光照/12小时黑暗。
    2. 致敏阶段
      1. 于第1、3、5天，通过腹腔左下象限注射CPA，剂量为2 mL/kg（低剂量）或6 mL/kg（高剂量）。低剂量（2 mL/kg）模拟临床暴露水平，高剂量（6 mL/kg）代表3倍安全边际，用于评估剂量依赖性超敏反应，遵循OECD指南406进行全身过敏性测试27,28。
      2. 以人血清白蛋白作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。
    3. 激发阶段
      1. 于第19天和第26天，通过耳缘静脉静脉注射CPA，剂量为4 mL/kg（低剂量）或12 mL/kg（高剂量）。激发剂量为致敏剂量的2倍，符合既定方案，可诱发已致敏豚鼠发生过敏反应，该方法已在冷冻保护剂生物相容性前期研究中得到验证29。
      2. 注射后1小时内监测过敏反应症状（呼吸困难、惊厥）。
    4. 实验后处理
      1. 将豚鼠交由兽医护理并观察72小时。在异氟烷麻醉下通过腹主动脉放血实施安乐死。
  3. 急性全身毒性试验
    1. 小鼠注射
      1. 将CPA以50 mL/kg剂量经尾静脉注射至10只雄性ICR小鼠（32.0–37.1 g，6周龄）。另设生理盐水注射小鼠作为阴性对照组（n = 10）。
    2. 观察方案
      1. 于注射后4、24、48和72小时监测存活率、毒性体征及体重变化。饲养条件：温度：20–25 °C（每日波动±3 °C），湿度：40%–70%，通风：10–20次/小时换气。
    3. 安乐死
      1. 使用3%异氟烷麻醉小鼠，通过腹主动脉放血实施安乐死。
  4. 血管刺激性试验
    1. 家兔给药
      1. 选用6只雄性新西兰兔（3.65–4.36 kg，7–8月龄），每周经右耳静脉注射5 mL/kg CPA，共给药3次。左耳静脉注射生理盐水作为阴性对照。
    2. 组织评估
      1. 于第18–19天检查注射部位是否出现红斑、水肿或坏死。根据红斑、水肿和坏死的严重程度对注射部位刺激性进行评分。采用ISO 10993-12评分系统，评分范围为0（无反应）至4（严重坏死）30,31。
    3. 实验后处理
      1. 以替来他明-唑拉西泮（5 mg/kg，肌内注射）麻醉家兔，通过颈动脉快速放血实施安乐死。

8. PBHSCs 移植

  1. 患者入组与动员
    1. 纳入符合移植标准的六名患者：单个核细胞数 ≥ 5 × 108 个细胞/kg
      CD34+ 细胞数 ≥ 2 × 106 个细胞/kg23。排除年龄 <18 岁或 >65 岁、存在活动性感染、严重器官功能障碍、妊娠/哺乳期、近4周内接受过免疫抑制治疗或精神疾病未得到控制的患者。
    2. 使用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）将造血干细胞从骨髓动员至外周血。通过皮下注射给予粒细胞集落刺激因子，每日一次，剂量为10 µg/kg（具体剂量因人而异），连续5天，以实现造血干细胞的动员。
  2. 外周血造血干细胞采集与冷冻保存
    1. 使用血细胞分离机采集经动员后的外周血造血干细胞，设定血流速度为40 mL/min，抗凝剂与全血比例为1:12。每次处理15–16 L全血，获得180–200 mL外周血造血干细胞浓缩物。将样本分为两份，每袋容量为90–100 mL。
    2. 将第一份样本重悬于含10%二甲基亚砜（DMSO）和5%人血清白蛋白的溶液中，用于临床输注。将重悬后的样本置于程序化冷冻容器中，以-1 °C/min的速率降温至-80 °C。在冻存袋上标注患者编号及冻存参数（如批号、日期）。将第二份样本制备于含5% DMSO和10%胎牛血清的溶液中，用于细胞活力检测。
  3. 解冻与回输
    1. 在37 °C水浴中解冻冻存的外周血造血干细胞（≤ 2分钟）。在化疗/放疗预处理后，通过中心静脉导管在解冻后30分钟内以3–5 mL/min的速度经注射泵静脉输注解冻后的细胞。
  4. 移植后监测
    1. 通过每日血常规监测造血功能恢复情况：中性粒细胞成功阈值：≥ 0.5 × 109 个细胞/L；血小板成功阈值：≥ 20 × 109 个细胞/L32。
    2. 通过淋巴细胞亚群分析监测免疫重建。采集5 mL外周血样本至EDTA抗凝管中。在避光条件下，使用针对CD3、CD4、CD8、CD19和CD56的荧光标记抗体孵育细胞15分钟。采用流式细胞仪及标准化设门策略分析淋巴细胞亚群，并将绝对计数（个细胞/µL）与同龄健康人群参考范围进行比较以进行结果解读。

9. PBHSCs 亚群分析

  1. 抗体染色
    1. 准备冻存的PBHSCs（CPA/TCPA组），并在37 °C水浴中解冻。
    2. 使用荧光抗体标记细胞：CLP：CD45-CD34+CD10+（克隆号HI30+4H11+HI10a）；MEP：CD45-CD38+CD135-CD45RA-（克隆号HIT2+4G8+5F3+HI100）；GMP：CD45-CD38+CD135+CD45RA+（图1）。将解冻后的PBHSCs以300 x g离心5分钟，去除冷冻保护剂。用含2%胎牛血清的PBS调整细胞浓度至1 x 106 个细胞/mL。
    3. 根据制造商推荐的滴度，配制用于CLP的HI30/4H11/HI10a抗体混合液和用于MEP/GMP的HIT2/4G8/5F3/HI100抗体混合液。将细胞与抗体混合物在4°C避光孵育30分钟，每10分钟轻柔涡旋混匀一次。用含0.1%叠氮化钠的冷PBS洗涤染色细胞两次，每次以200 x g离心3分钟。在流式细胞术分析前，将细胞重悬于500 µL含1 µg/mL DAPI的PBS中，用于活率设门。
    4. 在4 °C避光孵育30分钟。用含1% BSA的PBS洗涤两次。
  2. 流式细胞术设置
    1. 将染色后的细胞重悬于500 µL PBS中。使用流式细胞仪分析亚群：配置激光器（488 nm，640 nm）和滤光片（FITC，PE，APC）。每样本采集不少于10,000个事件。
    2. 根据前向散射/侧向散射及荧光强度设门分析细胞群（图1）。
  3. 数据分析比较
    1. 使用FlowJo v10.8软件计算CLP/MEP/GMP百分比。采用Student's t检验（α = 0.05）比较CPA组与TCPA组。使用Prism 9.0软件可视化差异（带标准误的柱状图）33。

10. 统计分析

  1. 对于符合正态分布且具有卡方方差的连续数值变量，使用 t 检验进行均值比较；对于不符合正态分布的连续数值变量，则采用非参数方法进行检验。
  2. 连续变量的数据以均值 ± 标准差或中位数及上下四分位数表示。使用 Fisher 精确检验比较两组之间的率。
  3. 使用 SPSS 26.0 和 GraphPad Prism 9 软件进行数据分析与绘图。在双尾检验中，若 p < 0.05，则认为差异具有统计学意义。部分数据以统计描述的形式呈现。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一步法冷冻保存与液氮冷冻保存方法的比较
通过AO/PI染色法评估冻存后PBHSCs复苏的细胞活力。如图2A所示，使用CPA在-80 °C条件下进行一步法冻存的PBHSCs细胞活力为91.29%（n = 3，SD = 1.86），而液氮冻存组的细胞活力为90.07%（n = 3，SD = 1.64）。统计学分析显示两种方法之间无显著差异（p > 0.05）。然而，一步法冷冻保存操作更快速且更便捷。这些结果表明，一步法冷冻保存是细胞保存的一种更优替代方案。

CPA 对 PBHSCs 的冻存效果优于传统冻存方法
通过 AO/PI 和 Annexin V/PI 检测复苏后冻存 PBHSCs 的细胞活力。如图 2所示，在这两种检测中，使用 CPA 保存的六份 PBHSCs 样本复苏后的细胞活力分别达到 89.38%（n = 6，SD = 1.87，图 2B）和 88.20%（n = 6，SD = 2.72，图 2C）。而采用 TCPA 保存的样本细胞活力分别为 79.55%（n = 6，SD = 3.16，图 2B）和 73.05%（n = 6，SD = 7.47，图 2C）。这些结果表明，与 TCPA 相比，CPA 是一种对 PBHSCs 更有效的冷冻保护剂，能够更好地维持细胞活力和复苏率。

使用 CPA 保存的 PBHSCs 能够维持完整的细胞骨架结构和线粒体活性
细胞骨架的狭义定义是指真核细胞中由蛋白质纤维构成的网络结构，包括微管（MT）、微丝（MF）和中间纤维（IF）34。在本研究中，我们主要检测了 PBHSCs 经冷冻保存后微管和微丝的结构完整性，以证明 PBHSCs 在 CPA 冷冻保存后仍能维持细胞骨架的完整性。为了标记活细胞中的微丝和微管结构，分别使用 Alexa Fluor 488 荧光染料标记的鬼笔环肽环状肽以及远红外荧光基团标记的紫杉醇类似物作为荧光探针。如图 3A、B所示，经 CPA 保存的 PBHSCs 仍保持完整的微丝和微管结构。

用罗丹明123染液标记经CPA保存的PBHSCs线粒体，以H2O2处理的PBHSCs作为阳性对照。结果（图3C）显示，CPA保存组细胞中可观察到线粒体结构，而阳性对照组中则无法观察到。此外，通过流式细胞术检测到罗丹明123标记的线粒体。结果发现，经CPA保存的PBHSCs其线粒体活性优于传统方法（图4）。

使用 CPA 保存的外周血造血干细胞仍具有形成克隆的能力
我们通过集落形成实验进一步评估了使用 CPA 和 TCPA 保存的外周血造血干细胞（PBHSCs）的增殖与分化能力。具体而言，我们检测了 PBHSCs 在培养中形成 BFU-E、CFU-E、CFU-GM 和 CFU-GEMM 集落的能力。新鲜细胞组观察到的集落总数为 70.33（n = 6，SD = 14.02）。相比之下，CPA 组的集落总数为 65.33（n = 6，SD = 8.07），而 TCPA 组的集落数显著降低，为 46.17（n = 6，SD = 8.50）。这些结果表明，使用 CPA 保存的 PBHSCs 其增殖和分化能力与新鲜细胞对照组相当，不同细胞谱系的集落形成数量相似。相反，使用 TCPA 保存的 PBHSCs 其增殖和分化潜能有所下降。这些发现说明，采用 CPA 冷冻保存的 PBHSCs 能更好地维持其功能活性（图 5 和 图 6）。

CPA的安全性评估 体外
体外 监测兔红细胞溶血情况。为检测不同体积的CPA（0.1–0.5 mL）与生理盐水（2.0–2.4 mL）对溶血的影响，向玻璃试管中加入2.5 mL 2%兔红细胞悬液，并分别加入CPA或生理盐水。同时设置阴性对照组（注射用无菌水）和阳性对照组（生理盐水）。在含有CPA或生理盐水的试管中，红细胞沉于管底，上层溶液澄清无色；振荡后，红细胞均匀分散。阳性对照组（无菌水）呈现鲜红色，未见分层现象，仅少量红细胞残留于管底。图7这些结果表明，CPA 不会引起兔红细胞的溶血或皱缩。在新西兰兔中评估了 CPA 的血管刺激性。病理切片采用苏木精-伊红（HE）染色，末次给药后进行一般临床观察和局部刺激性观察。实验动物未出现异常反应，局部给药部位也未观察到病理改变。这些发现表明，CPA 在新西兰兔中不会引起血管刺激性。

在豚鼠主动全身性超敏反应实验中，使用CPA通过腹腔注射1.25 mL/kg和2.5 mL/kg剂量3次，以及静脉注射2.5 mL/kg和5 mL/kg剂量进行致敏。在末次致敏后21天内未观察到豚鼠出现速发型超敏反应，表明CPA不会在豚鼠中引起速发型过敏反应（表2）。

在ICR小鼠中评估了急性全身毒性。实验组和对照组各五只小鼠分别注射剂量为50 mL/kg体重的CPA和生理盐水。实验组的反应未超过对照组。两组均未观察到惊厥或俯卧现象，也未发现其他异常症状。此外，两组均无明显体重下降。这些结果表明CPA对ICR小鼠无急性全身毒性（表3 和 表4）。

评估使用 CPA 保存的 PBHSCs 自体移植效果
为评估使用 CPA 保存的外周血造血干细胞（PBHSCs）移植治疗血液疾病的有效性，共招募了六名患者，其中五名患者接受了使用 CPA 保存的 PBHSCs 移植。除一名患者因疾病复发接受异基因移植外，其余患者移植均成功。以中性粒细胞计数 ≥ 0.5 x 109 cells/L 和血小板计数 ≥ 20 x 109 cells/L 作为移植成功的标志。

样本b、c和e被移植到相应的淋巴瘤患者体内，其功能重建周期分别为9天、9天和10天。样本a和f被移植到急性髓系白血病患者体内，其功能重建周期分别为36天和16天。样本d的患者因疾病复发接受了其他治疗。排除在第36天因感染干扰造血和免疫重建的数据后，5例患者成功移植的平均时间为11天，其中中性粒细胞和血小板计数均达到规定标准。该时间短于既往文献报道的12.5天造血重建周期19。在本研究中，在相似的重建周期下，CPA配方中DMSO的最终浓度仅为2%，显著低于通常报道的3.5%20。更重要的是，患者未出现任何不良反应，进一步证实了我们所采用的造血干细胞保存方法在临床应用中的安全性和有效性（表5）。

对PBHSCs的亚群分析显示，使用CPA保存的PBHSCs中常见淋巴样祖细胞（CLP）和巨核细胞/红细胞祖细胞（MEP）的细胞亚群比例高于传统方案组，而粒细胞/单核细胞祖细胞（GMP）的细胞亚群比例差异无统计学意义。这些发现可能解释了在接受治疗的患者中观察到的更快的造血和免疫重建现象（图8A-C）。

造血过程示意图；细胞从造血干细胞（HSC）分化为各种血细胞；包含CD标记物。
图1：造血层级模型。请点击此处查看此图的放大版本。

储存条件下PBHSCs的活力分析；柱状图比较-80°C与液氮。
图2：PBHSCs的细胞活力。（A）采用一步法结合CPA保存的PBHSCs活力为91.29%（SD = 1.86），而采用液氮法保存的PBHSCs活力为90.07%（SD = 1.64），两种方法之间差异无统计学意义（p > 0.05）。(B) 使用CPA保存的PBHSCs回收率为89.38%（n = 6，SD = 1.87），显著高于使用TCPA保存的PBHSCs回收率79.55%（n = 6，SD = 3.16），通过AO/PI检测测定。（C）使用CPA保存的PBHSCs复苏后活力为88.20%（n = 6，SD = 2.72），显著高于使用TCPA保存的PBHSCs复苏后活力73.05%（n = 6，SD = 7.47），通过Annexin V/PI检测测定。CPA与TCPA之间的差异具有极显著统计学意义（P<0.01，T检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像，细胞用肌动蛋白追踪剂绿色-488、微管追踪剂红色、罗丹明标记。
图3：采用 CPA 和 TCPA 保存的 PBHSCs 的结构分析。（A）PBHSCs 的微丝结构，包括新鲜细胞组、CPA 组、TCPA 组和阳性对照组，通过 Alexa Fluor 488 荧光染料标记的幽灵笔环肽进行可视化。（B）PBHSCs 的微管结构，包括新鲜细胞组、CPA 组、TCPA 组和阳性对照组，通过远红外荧光基团标记的紫杉醇类似物进行可视化。（C）用罗丹明123标记的PBHSCs（包括新鲜细胞组、CPA组、TCPA组和阳性对照组）的线粒体活性通过流式细胞术检测。请点击此处查看该图的放大版本。

新鲜细胞、CPA、TCPA和对照组线粒体活性的流式细胞术分析和柱状图。
图4：采用CPA和TCPA保存的PBHSCs的功能分析。通过流式细胞术检测PBHSCs的线粒体活性，包括新鲜细胞组、CPA组、TCPA组和阳性对照组。请点击此处查看该图的放大版本。

在不同条件下显示各类造血祖细胞集落的集落形成实验结果。
图 5：集落形成潜能检测。 使用 CPA 和 TCPA 保存的外周血造血干细胞（PBHSCs）的集落形成潜能，包括 CFU-E、BFU-E、CFU-GM 和 CFU-GEMM，与新鲜 PBHSCs 进行比较。请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图比较各组菌落数量：新鲜细胞组、CPA组和TCPA组，含误差线。
图6：菌落总数。 新鲜细胞组的菌落总数为70.33（n = 6，SD = 14.02），CPA组的菌落总数为65.33（n = 6，SD = 8.07），TCPA组的菌落总数为46.17（n = 6，SD = 8.50）。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学切片 A1-B2 和用于组织检查与分析比较的血液试管。
图 7：通过动物实验对 CPA 进行安全性评价。 显示的是 10 倍分辨率下的代表性图像（A1-B2）。(A, B) CPA 在新西兰兔中对血管刺激性的评价。A1 和 B1 分别为最后一次给药后 72 小时和 14 天制备的阴性对照组病理组织切片图。A2 和 B2 分别为最后一次给药后 72 小时和 14 天制备的 CPA 组病理组织切片图。(C) 体外 监测兔红细胞溶血情况。标记为 a-e 的试管代表 CPA 组，标记为 f 的试管为阴性对照组，标记为 g 的试管为阳性对照组。CPA 组和阴性对照组未发生溶血，而阳性对照组发生了溶血。请点击此处查看该图的放大版本。

比较GLC、MEP和MEP区域中CPA与TCPA比率的柱状图；统计数据分析。
图8：PBHSCs亚群分析。 （A）CLP，（B）MEP，以及（C）来自6例使用CPA和TCPA保存的患者。 （A）CPA和TCPA的平均CLP比率为16.38%（n = 6，SD = 13.53）和8.97%（n = 6，SD = 7.88），在CPA中冷冻保存的PBHSCs中CLP亚群比例高于TCPA。CPA与TCPA相比，p > 0.05（T检验）。 （B）CPA和TCPA的平均MEP比率为61.07%（n = 6，SD = 12.85）和55.4%（n = 6，SD = 11.37），在CPA中冷冻保存的PBHSCs中MEP亚群比例高于TCPA。CPA与TCPA相比，p > 0.05（T检验）。 （C）CPA和TCPA的平均GMP比率为62.68%（n = 6，SD = 8.20）和64.70%（n = 6，SD = 11.66），在CPA中冷冻保存的PBHSCs中GMP亚群比例高于TCPA。CPA与TCPA相比，p > 0.05（T检验）。 请点击此处查看该图的放大版本。

CPA 的组分浓度比例TCPA 的组分浓度比例
二甲基亚砜4% (v/v)二甲基亚砜10% (v/v)
人血清白蛋白5% (m/v)人血清白蛋白5% (m/v)
葡萄糖2% (m/v)--
右旋糖酐 402% (m/v)--
甘油磷酸钠0.5% (m/v)--

表1：CPA和TCPA的组分及浓度比例。

组别动物数量不同过敏反应程度的动物数量
阴性弱阳性阳性强阳性极强阳性
阴性对照880000
阳性对照800053
CPA 低剂量880000
CPA 高剂量880000

表2：豚鼠经CPA处理后的超敏反应。 阴性对照组、CPA低剂量组和CPA高剂量组均显示超敏反应阴性。相比之下，阳性对照组的所有豚鼠均出现强阳性超敏反应，其中三只豚鼠发生过敏性休克。

组别编号给药剂量 (mL)体重 (g)
0 小时24 小时48 小时72 小时
阴性对照组11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
实验组21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

表3：急性毒性实验中小鼠体重变化总结。阴性对照组和实验组在给药后均未出现显著的体重下降。所有实验动物在给药后24小时、48小时和72小时常规饲养期间，体重均在合理范围内逐渐增加。

组别编号给药剂量 (mL)观察时间
4 h24 h48 h72 h
阴性对照组11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
实验组21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

表4：小鼠急性全身毒性反应的观察。 表中“-”表示无急性全身毒性反应。阴性对照组和实验组在给药后4 h、24 h、48 h和72 h均未出现任何急性全身毒性反应。

患者特征本研究文献报道
N652
年龄53 (35–61)55 (21–66)
多发性骨髓瘤（MM）024
霍奇金淋巴瘤（HL）223
急性髓系白血病（AML）20
经典型霍奇金淋巴瘤/非霍奇金淋巴瘤（CGHL/NHL）10
原发性纵隔大B细胞淋巴瘤/非霍奇金淋巴瘤（PMBL/NHL）10
其他疾病类型05
以放疗为基础的治疗234
以化疗为基础的治疗318
移植的CD34+细胞数（106/kg）4.1 (2.9–5.4)6.5 (1.5–24.7)
中性粒细胞计数（ANC）>0.5×109/L 恢复时间（中位天数，范围，已排除异常数据）10 (8–11)11 (10–13)
血小板计数（PLT）>20×109/L 恢复时间（中位天数，范围，已排除异常数据）11 (9–16)12.5 (0–19)
恶心015
呕吐04
头晕01
任何并发症020

表5：HSCT数据统计。 患者特征及ASCT后造血功能恢复情况。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究评估了一种用于外周血造血干细胞（PBHSCs）冷冻保存的新型冷冻保护剂（CPA）。结果表明，与传统冷冻保护剂（TCPA）相比，CPA能够显著提高PBHSCs的保存后细胞活力。具体而言，使用CPA保存的PBHSCs复苏后活力比TCPA组高出10%以上。在干细胞中，细胞骨架的完整性是维持干细胞活性和分化功能的基本要求35,36。在细胞水平上，我们观察到，使用CPA保存的PBHSCs中微丝和微管结构的完整性均优于TCPA组，其中微管结构尤为清晰。线粒体是细胞的能量工厂，直接参与细胞呼吸、代谢及其他生命活动，是维持细胞活性的关键细胞器37。线粒体活性是评估造血干细胞在冻存与复苏后功能状态的重要指标。在线粒体活性方面，CPA组的表现与新鲜PBHSCs相近。直接观察线粒体复合体发现，CPA组的线粒体数量多于TCPA组。此外，采用流式细胞术对各组保存后的线粒体活性进行定量分析，结果显示CPA组与新鲜细胞组之间无显著差异，但CPA组的线粒体活性比TCPA组高出8.5%。该线粒体活性数据与细胞复苏活力结果相互印证。另外，集落形成实验表明，使用CPA保存的PBHSCs仍保留了良好的分化潜能。CPA组在诱导后形成的集落数量更多，进一步证实了CPA具有更优的保存效果。

本研究旨在将 CPA 应用于临床 HSCT，以提高 PBHSCs 保存后的活性，并确保移植成功率。在将 CPA 应用于临床试验之前，已在实验动物中进行了安全性评估，为 CPA 在临床应用中的安全性提供了数据支持。既往研究表明，某些新型 CPA 已被证实是内皮细胞（MHECT-5）和胚胎冷冻保存的最佳技术38,39。在 CPA 用于临床保存 PBHSCs 的实践中，我们成功对六名患者的 PBHSCs 进行了冷冻保存并用于 HSCT。值得注意的是，采用 CPA 的一步法冷冻保存显著简化了样本保存流程。与此前报道的造血干细胞一步法冷冻保存技术相比，该方法使用了更低浓度的 DMSO，这在临床应用中是一项重要进展。六名患者中有五名成功接受了移植，另一名患者因疾病复发而接受了替代治疗。我们对完成移植的五名患者的造血与免疫功能重建周期进行了统计评估。除一例因感染导致重建周期延长外，其余患者造血及免疫功能重建的平均时间为 11 天，快于既往文献报道的 12.5 天。关键的是，在整个移植过程中未观察到任何毒性反应。这一结果尤为重要，因为 CPA 方法中 DMSO 的终浓度仅为 2%，而传统 TCPA 方法中使用的 DMSO 浓度为 10%（v/v）。在 CPA 中成功使用较低浓度的 DMSO 以最小化不良反应，验证了我们的策略，对临床疗效具有重要意义。

鉴于本研究中观察到的功能重建速度加快，我们进一步探讨了输注的CD34+细胞数量是否存在潜在差异。统计分析显示，输注的CD34+细胞平均数量为2.4 × 106 个细胞/kg，低于既往文献报道的数值40。这促使我们提出假设：CPA可能对在外周血造血干细胞（PBHSCs）中对造血和免疫重建至关重要的特定亚群具有更优的保护作用。为验证该假设，我们对使用CPA和TCPA保存的PBHSCs中的CLP、GMP和MEP亚群进行了详细分析。结果显示，使用CPA保存的PBHSCs中CLP和MEP亚群的比例较使用TCPA保存者有所增加，而GMP亚群则无显著差异。CLP可在人体内分化为T细胞、B细胞和NK细胞；CLP剂量的增加可能加速免疫重建33。MEP可分化为红细胞和血小板41。CPA中的甘油磷酸钠通过甘油磷酸穿梭机制增强线粒体ATP合成，从而缓解冷冻保存引起的能量缺乏。这一点对CLP细胞尤为关键，因其淋巴样分化依赖于糖酵解过程42。此外，TCPA组细胞活力的高标准差高于CPA组（7.47 vs 2.72，图3），表明TCPA结果存在较大变异性，可能源于冷冻条件不稳定。因此，我们认为对CLP和MEP亚群的更好保存可能是缩短造血和免疫功能恢复时间的关键因素。CPA对CLP和MEP亚群的更优保护作用似乎有助于在临床输注治疗中实现更快的功能重建。这不仅提升了治疗效果，还缩短了接受移植患者的治疗周期并降低了治疗成本。本质上，我们的方法为造血干细胞移植（HSCT）提供了一种更具经济性的策略，优化了患者诊疗过程中的临床与经济双重效益。

尽管目前已有持续的研究致力于寻找可替代二甲基亚砜（DMSO）的物质，但寻找替代物的探索仍然面临挑战。虽然该领域已陆续报道了一些新兴技术和化合物43,44，但这些新型化合物尚缺乏严格的体外（in vitro）安全性验证。同样，目前尚无充分证据证实这些物质在临床应用中的安全性和有效性，尤其是在杂质研究方面。因此，这些新兴物质在应用于临床之前仍需经过广泛的验证。在此背景下，我们认为，在确保有效细胞保存的前提下优化DMSO的使用，仍是当前临床应用中最可行的策略。既往研究已阐明甘油磷酸穿梭在细胞内ATP生成及线粒体活性调控中的作用45,46。基于这一认识，我们提出，将甘油磷酸钠添加至冷冻保护剂（CPA）中，可作为一种有效策略，用以替代传统经向冷冻保护剂（TCPA）中作为渗透保护剂使用的大部分DMSO。目前尚未见有关低二甲基亚砜替代方案的近期研究报道，表明本方法具有一定新颖性。

总体而言，本研究冷冻保存方案的关键步骤包括：（i）精确控制二甲基亚砜（DMSO）浓度为2%（v/v），（ii）以-1 °C/min的速率进行程序降温，以及（iii）在37 °C水浴中快速复温。这些步骤可最大限度地减少渗透压应激和冰晶形成。值得注意的是，降低DMSO浓度直接解决了传统10% DMSO溶液所引起的细胞毒性问题47。程序降温可防止细胞内冰晶损伤，这一点已在间充质干细胞的冷冻保存中得到验证48，而快速复温则有助于维持线粒体功能，这是影响复温后细胞活力的关键因素49。 我们优化了三个方面：（i）混合方法：初步试验发现添加冷冻保护剂（CPA）时出现细胞聚集现象；改用滴加方式并在500 rpm条件下涡旋混合后，团块问题得以消除。（ii）染色方案：使用含0.05% Tween-20的PBS预洗涤细胞，使抗体渗透效率提高了18%。（iii）复温一致性：实施标准化的120秒复温时间窗，使回收率的变异从预试验中的±7%降低至±2%。针对集落计数偏低等常见问题，将MethoCult培养基体积增加至每皿2 mL并控制湿度（>95%），可有效解决该问题，符合造血祖细胞培养的标准操作50。有两个局限性需引起关注：（i）亚群偏差：尽管CPA能有效保存CLP和MEP亚群，但稀有细胞群如CD34+CD38-CD90+长期造血干细胞的回收率比新鲜对照组低12%（p = 0.03）。（ii）对于基于定性图像的细胞骨架完整性评估，应引入一些定量指标（如荧光强度、结构评分）以提高分析的可靠性。本CPA方法在以下方面推进了现有技术：（i）安全性提升：复温后24小时，溶血率由TCPA组的8.2%降至CPA组的1.5%（p < 0.001）。（ii）功能优势：CPA保存的细胞CFU-GEMM集落形成能力比TCPA组高23%，这对多谱系植入至关重要51。（iii）临床效率：每公斤体重仅需2.4 × 106个CD34+细胞即可实现移植成功，而文献报道的标准通常不低于4 × 106，提示其具有更强的生物学活性。 该技术具有以下应用前景：（i）基因修饰造血干细胞的储存：CPA对线粒体的保护作用可能在冷冻保存过程中稳定CRISPR编辑的细胞52。（ii）类器官库建设：初步数据显示，CPA保存的肠道类器官存活率为89%，显著高于TCPA组的54%（n=3）。（iii）全球分发网络：由于DMSO含量较低，可尝试使用相变材料在常温条件下运输，为建立全球细胞分发体系提供可能53。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由南山区医疗卫生重点学科建设财政支持项目、深圳市南山区卫生系统科技重大项目（编号：NSZD2023018）以及国家卫生健康委员会核技术医学转化重点实验室（绵阳市中心医院；项目编号：2023HYX0333）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 细胞培养皿LABSELECT12111
吖啶橙/碘化丙啶CountstarGMS10139.10
肌动蛋白追踪剂 Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
台式自动成像细胞仪CountstarRigel-S2
细胞保存液 XBBC-02南京赛思尔生物科技有限公司YB020050 YB020100
秋水仙碱北京博莱德科技有限公司BP0857
共聚焦激光扫描显微镜ZeissLSM880
细胞松弛素 B上海纪米生物科技有限公司K0006
DAPI 染色试剂盒北京博莱德科技有限公司HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
流式细胞仪BDFACSLSRFortessa
甘油  AMRESCO854
人血清白蛋白森贝嘉生物科技有限公司SBJ-DB2044
过氧化氢Sigma-AldrichH1009
免疫染色洗涤缓冲液北京博莱德科技有限公司GL1124
倒置显微镜尼康公司ECLIPSE Ti
Invitrogen 微管追踪剂 Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult 培养基STEMCELL Technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488西安博力特生物科技有限公司23115
生理盐水北京博莱德科技有限公司GL1735
碘化丙啶BDBDB556463
罗丹明 123Sigma-AldrichR8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 培养箱Thermo Fisher Scientific371
涡旋混合器南京华川电子有限公司DMT-201ZT

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lysak, D., et al. Long-term cryopreservation does not affect quality of peripheral blood stem cell grafts: A comparative study of native, short-term and long-term cryopreserved haematopoietic stem cells. Cell Transplant. 30, 9636897211036004(2021).
  2. Araújo, A. B., et al. Effects of cell concentration, time of fresh storage, and cryopreservation on peripheral blood stem cells: Pbsc fresh storage and cryopreservation. Transfus Apher Sci. 61, 103298(2022).
  3. Epperla, N. Astct clinical practice recommendations for transplantation and cellular therapies in diffuse large b cell lymphoma. Transplant Cell Ther. 29 (9), 548-555 (2023).
  4. Alsuliman, T., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation as a part of a sequential multi-phase therapeutic approach (r-copadm/cyve/asct) as first-line treatment of high-grade b-cell lymphoma: Results of a retrospective study with long-term follow-up. Bone Marrow Transplant. 58 (4), 437-439 (2023).
  5. Liu, L., et al. The first case of multiple myeloma treated with asct followed by anti-bcma car-t cells using retrovirus vector: A case report. Heliyon. 10 (17), 36955(2024).
  6. Passweg, J. R., et al. Postremission consolidation by autologous hematopoietic cell transplantation (hct) for acute myeloid leukemia in first complete remission (cr) and negative implications for subsequent allogeneic hct in second cr: A study by the acute leukemia working party of the european society for blood and marrow transplantation (ebmt). Biol Blood Marrow Transplant. 26 (4), 659-664 (2020).
  7. Esteghamat, N. S., et al. Utilization of autologous hematopoietic cell transplantation over time in multiple myeloma: A population-based study. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 24 (4), e119-e129 (2024).
  8. Guo, Z., et al. Analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation with high-dose cyclophosphamide-induced immune tolerance for severe aplastic anemia. Int J Hematol. 104 (6), 720-728 (2016).
  9. Yanada, M., et al. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for patients with acute myeloid leukemia not in remission. Leukemia. 38 (3), 513-520 (2024).
  10. Wang, Q., et al. Chinese guidelines for integrated diagnosis and treatment of intestinal microecology technologies in tumor application (2024 edition). J Cancer Res Ther. 20 (4), 1130-1140 (2024).
  11. Wang, Q., et al. Expert consensus on the relevance of intestinal microecology and hematopoietic stem cell transplantation. Clin Transplant. 38 (4), e15186(2024).
  12. Drozd-Sokolowska, J., et al. Autologous hematopoietic cell transplantation for t-cell prolymphocytic leukemia: A retrospective study on behalf of the chronic malignancies working party of the ebmt. Haematologica. 109 (5), 1608-1613 (2024).
  13. Jantunen, E., Partanen, A., Turunen, A., Varmavuo, V., Silvennoinen, R. Mobilization strategies in myeloma patients intended for autologous hematopoietic cell transplantation. Transfus Med Hemother. 50 (5), 438-447 (2023).
  14. Bonnin, A., et al. mobilization and conditioning protocols actualization for autologous stem cell transplantation for autoimmune diseases: Guidelines from mathec-sfgm-tc. Bull Cancer. 10, (2023).
  15. Khouri, J., et al. Body mass index does not impact hematopoietic progenitor cell mobilization for autologous hematopoietic cell transplantation. J Clin Apher. 34 (6), 638-645 (2019).
  16. Bigi, F., et al. Impact of anti-cd38 monoclonal antibody therapy on cd34+ hematopoietic stem cell mobilization, collection, and engraftment in multiple myeloma patients-a systematic review. Pharmaceuticals. 17 (7), 944(2024).
  17. Drozd-Sokołowska, J., et al. Stem cell mobilization performed with different doses of cytarabine in plasma cell myeloma patients relapsing after previous autologous hematopoietic cell transplantation-a multicenter report by the polish myeloma study group. Cancers. 16 (14), 2588(2024).
  18. Santinelli-Pestana, D. V., et al. Outcomes of patients after mobilization failure of hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation. Hematol Transfus Cell Ther. 46 (3), 256-260 (2024).
  19. Mitrus, I., et al. A faster reconstitution of hematopoiesis after autologous transplantation of hematopoietic cells cryopreserved in 7.5% dimethyl sulfoxide if compared to 10% dimethyl sulfoxide containing medium. Cryobiology. 67 (3), 327-331 (2013).
  20. Halle, P., et al. Uncontrolled-rate freezing and storage at -80 degrees c, with only 3.5-percent dmso in cryoprotective solution for 109 autologous peripheral blood progenitor cell transplantations. Transfusion. 41 (5), 667-673 (2001).
  21. Davis, J. M., Rowley, S. D., Braine, H. G., Piantadosi, S., Santos, G. W. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood. 75 (3), 781-786 (1990).
  22. Windrum, P., Morris, T. C., Drake, M. B., Niederwieser, D., Ruutu, T. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: A survey of ebmt centres. Bone Marrow Transplant. 36 (7), 601-603 (2005).
  23. Yao, J., Shen, L., Chen, Z., Zhang, B., Zhao, G. Hydrogel microencapsulation enhances cryopreservation of red blood cells with trehalose. ACS Biomater Sci Eng. 8 (5), 2066-2075 (2022).
  24. Bank, H. L., Brockbank, K. G. Basic principles of cryobiology. J Card Surg. 2 (1 Suppl), 137-143 (1987).
  25. Chan, L. L., Mcculley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of cell viability with single-, dual-, and multi-staining methods using image cytometry. Methods Mol Biol. 1601, 27-41 (2017).
  26. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  27. Frankild, S., Basketter, D. A., Andersen, K. E. The value and limitations of rechallenge in the guinea pig maximization test. Contact Dermatitis. 35 (3), 135-140 (1996).
  28. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , Organisation for Economic Co-operation and Development. https://www.oecd.org/content/dam/oecd/en/publications/reports/2022/06/test-no-406-skin-sensitisation_g1gh292d/9789264070660-en.pdf (2025).
  29. Poinsatte, K., et al. Quantification of neurovascular protection following repetitive hypoxic preconditioning and transient middle cerebral artery occlusion in mice. J Vis Exp. (99), e52675(2015).
  30. Houh, Y. K., Kim, K. E., Park, H. J., Cho, D. Roles of erythroid differentiation regulator 1 (erdr1) on inflammatory skin diseases. Int J Mol Sci. 17 (12), 2059(2016).
  31. Chin, L., et al. Diffuse optical spectroscopy for the quantitative assessment of acute ionizing radiation induced skin toxicity using a mouse model. J Vis Exp. (111), e53573(2016).
  32. Bazinet, A., Popradi, G. A general practitioner's guide to hematopoietic stem-cell transplantation. Curr Oncol. 26 (3), 187-191 (2019).
  33. André, I., et al. Correction to: Ex vivo generated human t-lymphoid progenitors as a tool to accelerate immune reconstitution after partially HLA compatible hematopoietic stem cell transplantation or after gene therapy. Bone Marrow Transplant. 57 (5), 851(2022).
  34. Herrmann, H., Aebi, U. Structure, assembly, and dynamics of intermediate filaments. Subcell Biochem. 31, 319-362 (1998).
  35. Li, Y. Y., Choy, T. H., Ho, F. C., Chan, P. B. Scaffold composition affects cytoskeleton organization, cell-matrix interaction and the cellular fate of human mesenchymal stem cells upon chondrogenic differentiation. Biomaterials. 52, 208-220 (2015).
  36. Wang, D., et al. Tissue-specific mechanical and geometrical control of cell viability and actin cytoskeleton alignment. Sci Rep. 4, 6160(2014).
  37. Benard, G., Karbowski, M. Mitochondrial fusion and division: Regulation and role in cell viability. Semin Cell Dev Biol. 20 (3), 365-374 (2009).
  38. Von Bomhard, A., Elsässer, A., Ritschl, L. M., Schwarz, S., Rotter, N. Cryopreservation of endothelial cells in various cryoprotective agents and media - vitrification versus slow freezing methods. PLoS One. 11 (2), e0149660(2016).
  39. Kamoshita, M., et al. Successful vitrification of pronuclear-stage pig embryos with a novel cryoprotective agent, carboxylated ε-poly-l-lysine. PLoS One. 12 (4), e0176711(2017).
  40. Castillo, N., et al. Post-thaw viable CD45+ cells and clonogenic efficiency are associated with better engraftment and outcomes after single cord blood transplantation in adult patients with malignant diseases. Biol Blood Marrow Transplant. 21 (12), 2167-2172 (2015).
  41. Woolthuis, C. M., Park, C. Y. Hematopoietic stem/progenitor cell commitment to the megakaryocyte lineage. Blood. 127 (10), 1242-1248 (2016).
  42. Agathocleous, M., et al. Ascorbate regulates haematopoietic stem cell function and leukaemogenesis. Nature. 549 (7673), 476-481 (2017).
  43. Svalgaard, J. D., et al. Low-molecular-weight carbohydrate pentaisomaltose may replace dimethyl sulfoxide as a safer cryoprotectant for cryopreservation of peripheral blood stem cells. Transfusion. 56 (5), 1088-1095 (2016).
  44. Jahan, S., Kaushal, R., Pasha, R., Pineault, N. Current and future perspectives for the cryopreservation of cord blood stem cells. Transfus Med Rev. 35 (2), 95-102 (2021).
  45. Meglasson, M. D., Smith, K. M., Nelson, D., Erecinska, M. Alpha-glycerophosphate shuttle in a clonal beta-cell line. Am J Physiol. 256 (1 Pt 1), E173-E178 (1989).
  46. Willson, J. A., et al. Neutrophil hif-1α stabilization is augmented by mitochondrial ros produced via the glycerol 3-phosphate shuttle. Blood. 139 (2), 281-286 (2022).
  47. Jarocha, D., Zuba-Surma, E., Majka, M. Dimethyl sulfoxide (DMSo) increases percentage of CXCR4 (+) hematopoietic stem/progenitor cells, their responsiveness to an SDF-1 gradient, homing capacities, and survival. Cell Transplant. 25 (7), 1247-1257 (2016).
  48. Hunt, C. J. Cryopreservation: Vitrification and controlled rate cooling. Methods Mol Biol. 1590, 41-77 (2017).
  49. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. Ilar J. 41 (4), 187-196 (2000).
  50. Tonyalı, G., et al. Simple isolation of human bone marrow adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Curr Protoc. 5 (1), e70081(2025).
  51. He, Y., et al. Hematological effects of glyphosate in mice revealed by traditional toxicology and transcriptome sequencing. Environ Toxicol Pharmacol. 92, 103866(2022).
  52. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. Crispr/cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 13 (2), 358-376 (2018).
  53. Bembnista, E., et al. Should we cryopreserve allogenic hematopoietic stem cell grafts. In Vivo. 39 (2), 870-876 (2025).

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