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特定外源DNA的蓝光诱导半随机突变 大肠杆菌 BL21菌株

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DOI：

10.3791/68283

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2025年6月20日

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

本文内容

摘要

本方案概述了一种简化的方法，可在大肠杆菌（Escherichia coli）中特异性识别外源DNA，并仅对外源DNA引入突变。

摘要

诱变技术已广泛应用于变异育种、定向进化和蛋白质工程。然而，大多数方法只能诱导随机的基因组DNA突变，这些突变难以控制，可能导致畸形甚至致死效应。本文通过整合三种系统：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、蓝光诱导型p-Mag/n-Mag元件以及分裂型T7 RNA聚合酶，建立了一种可由蓝光控制、针对特定DNA区域的半随机诱变方法。

该系统可对起始于T7启动子并终止于T7终止子的DNA上的胞嘧啶（cytosine）进行突变为胸腺嘧啶（thymine）。位于T7启动子下游的任何外源基因均可能被突变。这些工具还被设计为两个部分，以实现蓝光可控。第一部分通过将CBE与n-Mag及N端-T7 RNA聚合酶基因融合而成；第二部分则通过将p-Mag与C端-T7 RNA聚合酶融合而成。在蓝光照射下，这两个部分会组装起来，作为T7启动子与T7终止子之间DNA区域的突变生成器发挥作用。在无蓝光条件下，p-Mag会从n-Mag上解离，从而释放CBE，使其停止对DNA的编辑。

本实验方案的目的是在特定区域产生随机突变 大肠杆菌 通过蓝光控制并进一步验证突变质粒。该系统可适配于 体内 进化系统，其中可以筛选目的基因的功能，并收集所需的突变用于进一步研究。

引言

随机突变和自然选择是推动进化的关键力量，它们在物种间产生了广泛的遗传变异。进化过程已被用作一种强大工具，用于设计具有优化或全新功能的蛋白质1。据估计，在多种原核生物和真核生物中，DNA复制带来的自然突变率约为每次细胞分裂每109个碱基中发生一次2。由于自然突变率较低，在实验室中产生大量遗传多样性是不现实的。因此，研究集中于开发能够提高突变率的方法，以在合理的时间内对特定基因的尽可能多的位点进行突变。

为了在实验室进化研究中实现更高的突变率，已开发出多种系统3,4,5,6,7,8,9,10。体外进化系统利用易错PCR、定点饱和诱变或计算辅助文库设计，在目标基因中引入突变1。将DNA文库转化至宿主细胞中，对表达的蛋白质产物进行筛选或选择。体外进化中的诱变与筛选步骤彼此解耦，限制了可生成群体的效率和规模11。体内进化系统通过将诱变系统引入细胞，并将诱变与筛选步骤耦合，实现了连续进化，从而克服了上述局限。早期的体内诱变方法采用化学诱变剂3,4和突变株5,6，但这些方法存在突变率低、缺乏控制以及突变谱狭窄或不均匀等问题12。近期研究开发了多种新型且改进的体内进化系统，代表性系统包括OrthoRep（一种正交的易错DNA复制系统）7,8；MutaT7（胞苷脱氨酶与T7 RNA聚合酶的融合蛋白）9；以及EvolvR（切口酶Cas9与易错DNA聚合酶的融合蛋白）10。这些方法在宿主细胞、靶标背景及实施难易程度方面各不相同。

T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）是MutaT7系统的关键组分，在合成生物学领域已被广泛研究和改造。研究人员在不同时间点以不同表达水平共表达了T7 RNAP的多个片段，构建出一种资源分配器13。通过构建具有不同启动子特异性C端片段的分裂型T7 RNAP，实现了AND逻辑门的创建14。T7 RNAP片段能够自组装并重建功能性聚合酶，这一特性推动了光控和小分子激活型生物传感器的发展：当分别融合至T7 RNAP N端和C端的相互作用蛋白发生二聚化时，即可触发转录输出15。分裂型T7 RNAP还被分别与n-Mag和p-Mag结构域融合，用于在Escherichia coli16中构建光诱导基因表达控制系统。在蓝光激活下，Magnet结构域发生二聚化，使分裂的T7 RNAP两个部分在空间上靠近，从而恢复聚合酶功能。该系统可实现对基因表达的精确时空控制，具有低基础表达水平和高动态响应范围。

本文介绍了一种构建可由蓝光控制的 在体，半随机突变系统（图1）。该系统基于与n-Mag-N-T7 RNAP融合的rAPOBEC1脱氨酶构建而成。通过在同一质粒上共表达p-Mag-C-T7 RNAP，可实现对聚合酶活性和碱基编辑活性的蓝光调控。该系统将rAPOBEC1的碱基编辑能力与光控分裂型T7 RNAP相结合，已在 E. coli 以绿色荧光蛋白（GFP）为靶基因，通过荧光激活细胞分选（FACS）根据其荧光强度进行筛选。与原始的MutaT7系统相比，我们的蓝光控制系统通过调节光照间隔，在靶基因中引入半随机突变。该系统并非将靶基因中所有的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而是通过光控方式对部分核苷酸进行编辑，从而产生更丰富的突变谱型。该系统可轻松适配于 体内 进化系统，其中GFP可被其他目的基因替换，并通过细胞适应性或存活能力来筛选功能。

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方案

以下实验方案概述了如何使用CBE-Mag-T7聚合酶诱变系统进行外源DNA诱变设计（步骤1）。在外源DNA质粒构建完成后，描述了将两种质粒转化至大肠杆菌（E. coli）BL21菌株的步骤，通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） 诱导CBE-Mag-T7聚合酶诱变系统的表达，随后用蓝光照射以启动诱变过程（步骤2–9.2）。为评估在GFP或外源DNA上产生的突变数量，采用Sanger测序进行质量控制分析（步骤9.3–11.2）。

1. 设计外源DNA并构建CBE-Mag-T7聚合酶诱变系统

  1. 使用在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 或 https://www.uniprot.org/）查找外源DNA或cDNA序列。 
    注意：本实验中，我们以GFP序列作为胞嘧啶编辑的外源DNA。
  2. 使用合适的克隆试剂盒，将gfp DNA替换为目标DNA。
    注意：我们在DNA克隆组装试剂盒中使用NheI酶切去除原始质粒中的gfp DNA。另一种方法是委托公司进行DNA合成。质粒序列详见补充文件1。
  3. 将所有基因与CBE-Mag-T7聚合酶突变系统共同合成，并插入含有氨苄青霉素抗性的pET-11a载体骨架中。
    注意：我们委托DNA合成公司构建该质粒，并获得了含有目标质粒的甘油菌种。

2. 细菌菌株活化

  1. 用移液器将10 µL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板边缘加入甘油菌种，然后用无菌接种环从此处开始在平板表面划线接种细菌。
  2. 将平板倒置，于37 °C细菌培养箱中过夜培养。

3. 质粒扩增

  1. 从平板上挑取单个菌落，接种于含有100 µg/mL氨苄青霉素的15 mL LB培养基的50 mL锥形管中。
  2. 将培养物置于37 °C、180 rpm的摇床中培养14–16小时。

4. 质粒提取

  1. 取5-15 mL过夜培养的细菌菌液，转移至离心管中，在18,894 × g 条件下离心1分钟。
  2. 收集细菌沉淀，并小心吸除所有上清液。通过涡旋振荡或移液将细菌沉淀重悬于500 µL重悬缓冲液中。
  3. 向管中加入500 µL裂解缓冲液，通过反复倒置管子8-10次轻轻混匀，室温静置5分钟以裂解细胞。
    注意：通过确认无可见的白色絮状物残留，判断裂解是否完全。
  4. 将500 µL平衡缓冲液加入置于收集管中的离心柱内，在18,894 × g 条件下离心2分钟，弃去穿流液，将离心柱重新放回收集管中。
  5. 向细菌裂解液中加入500 µL中和缓冲液，通过倒置管子8-10次轻轻混匀，直至出现白色沉淀，室温静置5分钟。
  6. 在18,894 × g 条件下离心5分钟，将上清液转移至过滤柱中，在18,894 × g 条件下离心1分钟以过滤溶液。
  7. 向滤过的溶液中加入0.3倍体积的异丙醇，通过倒置混匀。将混合液转移至已平衡的离心柱中。
  8. 在18,894 × g 条件下离心1分钟，弃去穿流液，将离心柱重新放回收集管中。
  9. 用750 µL洗涤缓冲液洗涤离心柱，在18,894 × g 条件下离心1分钟，弃去穿流液。
  10. 再次在18,894 × g 条件下离心1分钟，以去除残留的洗涤缓冲液。
  11. 将离心柱放入新的离心管中。向柱膜中心加入100-200 µL洗脱缓冲液，室温静置2-5分钟，在18,894 × g 条件下离心2分钟。将质粒DNA保存于-20 °C。

5. 质粒转化（E. coli BL21 化学感受态细胞）

  1. 取50 µL解冻的BL21感受态细胞置于冰上，加入4.11步骤中的2 µL质粒DNA，轻轻混匀，冰上孵育30分钟。
  2. 42 °C热激45秒，立即转移至冰上冷却2分钟。
  3. 每管加入500 µL无菌LB培养基，37 °C、180 rpm振荡培养1小时，使细胞恢复生长。
  4. 1,000 × g 离心5分钟，弃去上清液，每管残留约100 µL。重悬菌体后涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，倒置平板于37 °C过夜培养。

6. 表达CBE-Mag-T7聚合酶突变生成器（非活性形式）

  1. 按照步骤 5.1-5.4 操作。在铺板前，将 1 mM IPTG 均匀涂布于含氨苄青霉素的 LB 琼脂表面。使用去离子水作为对照，与 IPTG 处理组进行比较。
  2. 待所有菌落生长完毕后，挑取 10-20 个菌落，接种于含有 1 mM IPTG 的 5 mL LB 培养基中，在 100 mL 带酚盖和橡胶衬垫的圆底玻璃试管中，于 16 °C、180 rpm 条件下培养 8 小时。
    注意：所有菌落可在进行第 7 步前短期保存于 4 °C。

7. 激活 CBE-Mag-T7 聚合酶突变生成器

  1. 将细菌收集到带有酚醛螺帽和橡胶衬垫的100 mL圆底玻璃管中，在18,894 × g 条件下离心2分钟。
  2. 更换为不含IPTG的LB培养基。
    注意：此步骤至关重要，以确保CBE-Mag-T7聚合酶突变生成器不会自我编辑。我们设计了lacI/O系统来保护CBE-Mag-T7聚合酶基因簇。
  3. 在37 °C培养的同时，使用一个蓝光照射器（470 nm，4 mW/cm2）对培养板进行照射，照射时间为预定时间。通过Sanger测序验证突变，并检测延长照射时间是否可提高突变频率。
    注意：此处我们设定蓝光照射时间为0、8、16和24小时。

8. 选择可增强蛋白质功能的突变并进行持续的诱变

注意：此处我们使用 gfp 基因作为外源 DNA 进行诱变，旨在筛选能够增强 GFP 蛋白荧光强度的突变。

  1. 挑取菌落，标记平板上的位置，并将收集的菌落接种到 100 µL 的 ddH2O 中。
  2. 将 100 µL 菌液转移至 96 孔板，于激发/发射波长 488/510 nm 处检测 GFP 荧光强度。
  3. 重复步骤 6.3 至 9.2，直至能够识别出一些明显的菌落。

9. 终止诱变并验证突变

  1. 经过数小时的蓝光照射后，将所有细菌转移至4 °C的暗处再放置15分钟。
  2. 按照步骤4中所述的相同质粒提取步骤进行操作。
  3. 设计用于Sanger测序的正向和反向引物。
    注意：此处，我们使用ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT作为Sanger测序的正向引物，使用TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG作为反向引物。

10. 数据分析与突变频率计算

  1. 通过打开 .ab1 文件并手动检查峰图来查看突变。
  2. 使用在线工具（例如 Mutation Surveyor 工具）分析突变频率。
  3. 将 Sanger 数据文件上传至在线工具，并开始突变率分析。

11. 细菌甘油菌种保存液的制备

  1. 挑取单菌落接种于含有5 mL LB培养基（含100 µg/mL氨苄青霉素）的试管中，37 °C、180 rpm振荡培养12–16小时。
  2. 将菌液与50%甘油按1:1体积比混合，分装至1.5 mL离心管中，-80 °C保存。

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结果

本方案中所述方法用于利用分裂的CBE-Mag-T7 RNA聚合酶突变生成系统在外源DNA上引入突变。构建CBE-Mag-T7 RNA聚合酶突变系统的基因以及用于诱变的靶基因均被插入至pET-11a质粒骨架中。成功转化并进行蓝光照射后，未对细菌基因组DNA造成任何损伤，这通过LB-琼脂平板上正常且相当的菌落数量得以证实（图2）。

使用Sanger测序检测外源DNA上的突变。图3所示的色谱图在80 bp位点显示一个红色峰，表明在蓝光照射后，胞嘧啶碱基编辑器通过CBE-Mag-T7 RNA聚合酶突变系统成功引入了突变。图4中实验组的GFP荧光强度变化表明，可能已产生增强GFP功能的正向突变。

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讨论

聚合酶引导的碱基编辑工具最初由 Cravens 等人于 2021 年通过蛋白质融合策略创建17。四种 DNA 核苷酸的突变成功被引入，突变率超过每碱基对 10-4。然而，由于在 T7 启动子和终止子之间持续引入突变，且研究人员无法进行额外控制18，"有益"突变无法在持续的编辑过程中得以保留。为克服这一局限性，我们引入了一种基于两个关键组分的分裂系统。第一个组分是 p-Mag 和 n-Mag 系统，该系统已在多项研究中被广泛应用19。第二个组分依赖于一个可被 p-Mag 和 n-Mag 控制的分裂型 T7 RNA 聚合酶20。这种构型使得诱变的时间和持续时长可通过蓝光照射实现精确调控。在无蓝光照射的情况下，p-Mag 和 n-Mag 发生解离，系统在黑暗环境中失活，从而有效终止诱变过程。

此外，我们通过添加一种无偏倚的选择策略，在特定条件下富集有益突变，从而...

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披露

作者声明无利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 圆锥形离心管FalconCLS352070
氨苄青霉素Thermo Scientific ChemicalsJ60977.14
蓝光照射器ThorlabsLIU470A
DNA 组装克隆试剂盒 NEBE5520S
DNA/引物合成BGI Genomics
内毒素去除型质粒中量提取试剂盒 CWBIOCW2106S缓冲液 P1：重悬缓冲液，缓冲液 P2：裂解缓冲液，缓冲液 E3：平衡缓冲液，缓冲液 PS：中和缓冲液，缓冲液 PW：洗涤缓冲液，内毒素去除型缓冲液 EB：DNA 纯化缓冲液，RNase A 内毒素去除剂 FM：内毒素去除缓冲液，带收集管的离心柱 DM
甘油Fisher ChemicalG33-4
恒温摇床Thermo ScientificSK2001CPKG
IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷）Invitrogen15529019
酶标仪Thermo ScientificVarioskan LUX
显微镜 LeicaDMI 4000B
Multiskan FCThermo Scientific Chemicals
One Shot BL21(DE3) 化学感受态大肠杆菌InvitrogenC600003
PureLink 快速低内毒素质粒中量纯化试剂盒InvitrogenA36227
Pyrex 重型圆底离心管，带酚醛树脂螺旋盖和橡胶衬垫Corning 8422CLS8422100

参考文献

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