体外培养H5N1特异性鸭T细胞及利用胞内细胞因子染色法检测免疫应答

摘要

该方案描述了一种禽类T细胞的培养方法 体外 通过分离感染鸭的记忆性T细胞，从而获得高纯度的特异性鸭T细胞。此外，建立了胞内细胞因子染色（ICS）方法，以准确检测鸭T细胞中IFN-γ的分泌情况。

摘要

该 体外 T细胞培养是研究免疫反应、病毒感染及潜在治疗策略的关键方法。然而，目前尚无建立完善的禽类T细胞培养方案。 体外 迄今为止尚未见相关报道。本研究首次建立了一种以高致病性禽流感（HPAIV）H5N1病毒为模型的研究方案。实验中，使用病毒感染4周龄鸭，并于感染后28天分离记忆性T淋巴细胞，以培养H5N1特异性的鸭T淋巴ocytes，从而探究针对H5N1病毒的特异性免疫应答。该方案的关键步骤包括：从感染鸭中分离记忆性外周血单个核细胞（PBMCs），以最佳感染复数（MOI = 5）激活抗原呈递细胞（APCs）6小时，以及配制含有重组IL-2及其他特定添加剂的T细胞培养基。在整个过程中密切监测T细胞增殖、细胞因子分泌及细胞毒活性。此外，我们建立了一种胞内细胞因子染色方法，用于定量检测鸭T细胞中IFN-γ的分泌。该方法包括构建表达针对鸭IFN-γ特异性IgG3κ抗体的杂交瘤细胞系，并成功纯化抗体。纯化后的抗体以1:10稀释后用于流式细胞术，精确测定IFN-γ的分泌水平。该方法为评估鸭T细胞免疫应答提供了可靠工具，并为今后禽类病毒免疫学研究奠定了基础。

引言

T细胞的活化、增殖、分化以及转化为记忆T细胞的过程是抗原特异性免疫应答的核心¹。最初，当T细胞的T细胞受体（TCR）识别由抗原呈递细胞（APC）表面主要组织相容性复合体（MHC）分子所呈递的抗原肽时，T细胞被激活^2,3。这一激活过程不仅需要TCR与MHC分子的结合，还需要共刺激信号的协同作用，这些共刺激信号对于完全激活T细胞功能至关重要⁴。一旦被激活，T细胞迅速进入增殖阶段，产生大量与原始T细胞具有相同抗原特异性的克隆。在此增殖过程中，T细胞进一步根据其功能分化为CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞⁵，分别介导细胞毒性杀伤作用和辅助免疫应答。在初次感染结束后，一部分活化的T细胞转化为长寿的记忆T细胞⁶。这些记忆T细胞可在免疫系统中长期存留，并在再次接触相同病原体时迅速作出反应，从而产生更强且更高效的免疫应答，为宿主提供长期的免疫保护⁷。整个过程对于T细胞疫苗的设计至关重要，有助于提升疫苗的有效性和持久性⁸。

在此背景下，培养抗原特异性T....

方案

所有涉及可获得的禽流感A（H5N1）病毒的实验均按照华南农业大学（CNAS BL0011）的规程，在生物安全三级动物实验室及动物设施中进行。所有动物研究项目均经华南农业大学机构动物护理与使用委员会批准（批准编号：2021f154，2021年7月29日）。所有动物操作均遵循该委员会制定的法规和指南以及国际动物福利标准。本研究使用的动物为4周龄的家养绿头鸭（Anas platyrhynchos domestica），包括雄性和雌性个体，体重范围为500至600 g。

1. 鸭外周血单个核细胞的分离与单细胞悬液的制备

1. 从每只鸭子的颈静脉采集 2 mL 肝素抗凝血，并转移至含有 EDTA 的试管中，以防止每只鸭子的血液凝固
2. 使用淋巴细胞分离试剂盒提供的样本稀释液或 PBS 稀释血液。用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。通常血液与稀释液的稀释比例为 1:1。
3. 将与稀释后血液等体积的淋巴细胞分离液转移至离心管中。小心地将血液悬液叠加在淋巴细胞分离液上方。将混合物在 25 °C 下以 400 × g 离心 15 分钟，离心下降加速度设置为 1。
   注意：淋巴细胞分离液的用量不应少于 4 mL。淋巴细胞分离液试剂盒的组分见材料表。
4. 离心后，从上至下观察离心管中出现的四个明显分层。最上层为样本稀释液，其下....

结果

本方案基于先前关于鸭子抗原特异性T细胞效应反应检测的研究而开发²⁰实验的第一步包括 体外 病毒特异性T细胞的培养，这些细胞是后续效应反应研究的基础。首先，将抗原呈递细胞与效应细胞进行孵育并共培养。形态学观察显示，细胞增殖后呈现出集落生长的特征（图 2A）。CFSE 标记进一步证实了细胞成功增殖，显示出多次细胞分裂的峰群（图2B最后，我们使用鸭特异性的细胞标志物 CD8/CD4 来评估细胞的比例和绝对数量²⁰，证实了成功的 体外 抗原特异性T细胞的培养图2C).

在培养的第7天，我们收集了细胞并检测了免疫相关基因的表达。结果显示，增殖的T细胞主要表达与细胞毒性相关的基因，如颗粒酶A（Granzyme A）和IFN-γ^11.......

讨论

本方案提供了一种高效的方法 体外 培养鸭源抗原特异性T细胞，并建立了一种适用于鸭的细胞内细胞因子染色方案，可用于评估T细胞的效应反应。目前尚无关于 体外 鸭T细胞的培养方案。我们主要参考了人抗原特异性T细胞的方案，但致力于优化抗原呈递细胞（APCs）的孵育条件。我们正在考虑进一步优化分化方案。

本实验方案的成功依赖于两个关键步骤。首先，鸭T细胞的体外培养需要对刺激条件进行仔细优化，包括抗原剂量、抗原呈递细胞（APC）的活化状态以及培养时间，以确保T细胞充分扩增并保持其功能。这些参数的任何偏差都可能导致T细胞活化不充分或细胞死亡。其次，胞内细胞因子染色（ICS）法是功能性检测IFN-γ表达的关键技术。成功的ICS实验需要精确控制刺激时间、固定/通透步骤以及抗体的特异性。这两个步骤均极为敏感，必须谨慎操作，才能可靠且可重复地检测抗原特异性T细胞应答。

本研究中，我们采用流式细胞术检测细胞增殖，并通过qPCR分析特征性细胞因子的产生。尤为重要的是，我们成功表达并纯化了一株杂交瘤细胞系，该细胞系可产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Biosharp	Cat#BS-15-M
15 mL 离心管	Labselect	Cat#CT-002-15A
2-巯基乙醇（55 mM）	Sigma-Aldrich	Cat#M6250-100ML
48 孔组织培养板（未处理，平底）	Biofil	Cat#TCP000048
50 mL 离心管	Labselect	Cat#CT-002-50A
96 孔无裙边 qPCR 板	Labselect	Cat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm 试剂盒	BD Bioscience	Cat#BD 554714
布雷菲德菌素 A（BFA）	BD Bioscience	Cat#347688
细胞培养 CO2 培养箱	Thermo Fisher	Heracell 150i GP
离心机	Eppendorf	5810R
CFSE 标记试剂盒	Abcam	Cat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR 预混液	Vazyme	Cat#Q341-02
鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒	Tbdscience	Cat#LTS1090D
Evo M-MLV 逆转录预混液	Accurate Biotechnology	Cat#AG11706
FastPure 细胞/组织总 RNA 提取试剂盒 V2	Vazyme	Cat#RC112-01
胎牛血清	Gibco	Cat#10437-028
流式细胞仪	Beckman Coulter	BA43347
流式管	Beyotime	Cat#FFC005
FlowJo v10.8.1	Tree Star	https://www.flowjo.com
羊抗小鼠 488，1:50 稀释	Abbkine	Cat#A23210
羊抗小鼠 IgG2b，FITC，1:50 稀释	Southern Biotech	Cat#1091-31
羊抗小鼠 IgG3，PE，1:250 稀释	Southern Biotech	Cat#1100-09S
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software	https://www.graphpad-prism.cn
H5N1 亚型禽流感病毒株 DK383	人兽共患病防控国家与地方联合工程实验室	A/Duck/Guangdong/383/2008
L-谷氨酰胺（200 mM）	Gibco	Cat#25030081
显微镜	Motic	AE2000
小鼠抗鸭 CD4，1:50 稀释	Bio-Rad	Cat#MCA2478
小鼠抗鸭 CD8α，1:50 稀释	GeneTex	Cat#GTX41834
小鼠抗鸭 IFN-γ 单克隆抗体，1:10 稀释	本实验室制备	NA
NanoDrop One 分光光度计	Thermo Fisher	AZY1603209
NEAA（非必需氨基酸）	Gibco	Cat#11140-050
PBS	Gibco	Cat#10010023
PCR 扩增仪	Biometra	Biometra Tone 96G
青霉素-链霉素溶液	Gibco	Cat#15070063
实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	ABI7500
重组人 IL-2（10 μg）	USCNK	Cat#RPA111Ga01
红细胞裂解液	Tbdscience	Cat#NH4CL2009
RPMI 1640 培养基	Gibco	Cat#11875-119
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	Cat#11360-070
台盼蓝	Sigma-Aldrich	Cat#93595
两周龄绿头鸭（Sheldrake）	广州某鸭场	NA