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方法文章

体外培养H5N1特异性鸭T细胞及利用胞内细胞因子染色法检测免疫应答

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DOI：

10.3791/68291

⸱

2025年5月30日

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方案描述了一种禽类T细胞的培养方法 体外 通过分离感染鸭的记忆性T细胞，从而获得高纯度的特异性鸭T细胞。此外，建立了胞内细胞因子染色（ICS）方法，以准确检测鸭T细胞中IFN-γ的分泌情况。

摘要

该 体外 T细胞培养是研究免疫反应、病毒感染及潜在治疗策略的关键方法。然而，目前尚无建立完善的禽类T细胞培养方案。 体外 迄今为止尚未见相关报道。本研究首次建立了一种以高致病性禽流感（HPAIV）H5N1病毒为模型的研究方案。实验中，使用病毒感染4周龄鸭，并于感染后28天分离记忆性T淋巴细胞，以培养H5N1特异性的鸭T淋巴ocytes，从而探究针对H5N1病毒的特异性免疫应答。该方案的关键步骤包括：从感染鸭中分离记忆性外周血单个核细胞（PBMCs），以最佳感染复数（MOI = 5）激活抗原呈递细胞（APCs）6小时，以及配制含有重组IL-2及其他特定添加剂的T细胞培养基。在整个过程中密切监测T细胞增殖、细胞因子分泌及细胞毒活性。此外，我们建立了一种胞内细胞因子染色方法，用于定量检测鸭T细胞中IFN-γ的分泌。该方法包括构建表达针对鸭IFN-γ特异性IgG3κ抗体的杂交瘤细胞系，并成功纯化抗体。纯化后的抗体以1:10稀释后用于流式细胞术，精确测定IFN-γ的分泌水平。该方法为评估鸭T细胞免疫应答提供了可靠工具，并为今后禽类病毒免疫学研究奠定了基础。

引言

T细胞的活化、增殖、分化以及转化为记忆T细胞的过程是抗原特异性免疫应答的核心1。最初，当T细胞的T细胞受体（TCR）识别由抗原呈递细胞（APC）表面主要组织相容性复合体（MHC）分子所呈递的抗原肽时，T细胞被激活2,3。这一激活过程不仅需要TCR与MHC分子的结合，还需要共刺激信号的协同作用，这些共刺激信号对于完全激活T细胞功能至关重要4。一旦被激活，T细胞迅速进入增殖阶段，产生大量与原始T细胞具有相同抗原特异性的克隆。在此增殖过程中，T细胞进一步根据其功能分化为CD8+ T细胞和CD4+ T细胞5，分别介导细胞毒性杀伤作用和辅助免疫应答。在初次感染结束后，一部分活化的T细胞转化为长寿的记忆T细胞6。这些记忆T细胞可在免疫系统中长期存留，并在再次接触相同病原体时迅速作出反应，从而产生更强且更高效的免疫应答，为宿主提供长期的免疫保护7。整个过程对于T细胞疫苗的设计至关重要，有助于提升疫苗的有效性和持久性8。

在此背景下，培养抗原特异性T细胞 体外 变得至关重要。本实验方案基于已建立的人类T细胞体外培养方法，并针对禽类免疫系统进行了必要的调整9通过在体外培养这些细胞，研究人员能够研究T细胞在不同免疫状态下的应答，例如活化、增殖、分化和记忆形成。10。这一点 体外 该方法对于理解T细胞在免疫应答中所起的作用具有重要价值。此外， 体外条件下 培养条件下，可监测T细胞分泌细胞因子（如IFN-γ）的情况11,12这对于评估免疫反应的质量、强度和持久性，以及研究T细胞与其他免疫细胞之间的相互作用至关重要。此外， 体外 抗原特异性T细胞的扩增可实现大规模富集，提高检测灵敏度，并增强对T细胞应答水平的评估13因此， 体外 抗原特异性T细胞的培养是一种强有力的工具，有助于更深入地理解家禽T细胞在免疫应答中的作用，从而提高检测的敏感性，并增强对T细胞应答水平的评估。尽管类似的体外培养方法在哺乳动物系统中已较为成熟，但在鸟类物种中的应用仍十分有限。这一问题在家禽免疫学领域尤为突出，目前用于分析T细胞应答的技术手段尚不完善。特别是鸭子，作为多种禽流感病毒的天然宿主，其抗原特异性T细胞免疫的研究仍十分匮乏。因此，建立一套适用于鸟类系统的标准化体外T细胞培养方案，对于推动家禽基础研究和应用免疫学的发展至关重要。

在这些过程中起关键作用的细胞因子是IFN-γ，这是一种主要由CD8+ T细胞、1型CD4+ T细胞和NK细胞产生的II型干扰素14。IFN-γ在抑制病毒复制和调节免疫反应中发挥重要作用15。IFN-γ的表达水平反映了机体的免疫状态，可作为T细胞活化的标志物，使研究人员能够通过其表达水平评估T细胞的反应程度16,17。检测免疫细胞中细胞因子表达的常用方法之一是胞内细胞因子染色法（ICS）18,19。然而，由于实验材料和技术的限制，对鸭类的研究落后于哺乳动物5。目前，许多研究人员依赖qPCR来测定IFN-γ的表达水平，但该方法存在一定局限性11。在本实验室，我们成功开发了一种适用于流式细胞术的鸭IFN-γ抗体。在此基础上，本研究建立了一种ICS方法，用于检测鸭T细胞中IFN-γ蛋白的表达，为深入研究鸭T细胞免疫反应提供了可靠的技术工具。

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方案

所有涉及可获得的禽流感A（H5N1）病毒的实验均按照华南农业大学（CNAS BL0011）的规程，在生物安全三级动物实验室及动物设施中进行。所有动物研究项目均经华南农业大学机构动物护理与使用委员会批准（批准编号：2021f154，2021年7月29日）。所有动物操作均遵循该委员会制定的法规和指南以及国际动物福利标准。本研究使用的动物为4周龄的家养绿头鸭（Anas platyrhynchos domestica），包括雄性和雌性个体，体重范围为500至600 g。

1. 鸭外周血单个核细胞的分离与单细胞悬液的制备

  1. 从每只鸭子的颈静脉采集 2 mL 肝素抗凝血，并转移至含有 EDTA 的试管中，以防止每只鸭子的血液凝固
  2. 使用淋巴细胞分离试剂盒提供的样本稀释液或 PBS 稀释血液。用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。通常血液与稀释液的稀释比例为 1:1。
  3. 将与稀释后血液等体积的淋巴细胞分离液转移至离心管中。小心地将血液悬液叠加在淋巴细胞分离液上方。将混合物在 25 °C 下以 400 × g 离心 15 分钟，离心下降加速度设置为 1。
    注意：淋巴细胞分离液的用量不应少于 4 mL。淋巴细胞分离液试剂盒的组分见材料表。
  4. 离心后，从上至下观察离心管中出现的四个明显分层。最上层为样本稀释液，其下为环状乳白色的淋巴细胞层，接着是分离液层，最底层为红细胞。
  5. 小心使用移液器吸取第二层，即环状乳白色的淋巴细胞层，并转移至新的离心管中。加入 10 mL 清洗液与细胞混匀。
  6. 在室温下以 440 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，然后将细胞沉淀重悬于 10 mL RPMI 1640 培养基中用于细胞计数。
  7. 可选步骤）为进一步纯化样本，在以 440 × g 离心 5 分钟后，使用红细胞裂解缓冲液去除可能残留的混合血细胞。

2. 体外 H5N1禽流感病毒特异性T细胞培养

  1. 从养鸭场购买2周龄健康绿头鸭（Sheldrake），饲养于负压隔离器中。实验前通过血凝抑制（HI）试验确认鸭子禽流感病毒（AIV）呈阴性。用H5N1亚型AIV以每只0.2 mL含1 × 106 50%鸡胚感染剂量[EID50]经鼻腔感染4周龄鸭子。
  2. 在感染后第28天，按照步骤1所述方法分离H5N1感染鸭的记忆性外周血单个核细胞（PBMCs）。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞悬液与0.08%台盼蓝按1:1比例稀释，在光学显微镜下手动计数活细胞（未染色细胞）。
    注意：根据我们先前发表的研究20，感染后28天分离的外周血单个核细胞（PBMCs）富含记忆T细胞。此时效应阶段已消退，记忆细胞群体占主导地位。
  3. 将细胞浓度调整为3 × 106 个/mL，确保每孔加入1 mL培养基至48孔板中。
  4. 用H5N1禽流感病毒（AIV）共感染分离的PBMCs，作为抗原呈递细胞（APCs）。病毒感染复数（MOI）为5。将PBMCs与病毒在37 °C共培养1小时，每15分钟手动轻轻摇动一次。
  5. 感染1小时后，用PBS洗涤细胞两次，以去除未结合的病毒颗粒。将洗涤后的PBMCs重悬于1 mL T细胞培养基中，并在37 °C继续孵育5小时。
  6. 在室温下以440 × g 离心5分钟。随后将孵育后的抗原呈递细胞（APCs）重悬于100 µL T细胞培养基中，并加入效应细胞中。抗原呈递细胞与效应细胞的比例应为1:5。
  7. 将细胞置于37 °C、5% CO2环境中孵育14天。每隔2天，小心吸取并更换一半细胞培养上清液，补充等体积新鲜T细胞培养基，确保分布均匀。弃去含细胞的一半培养基后，加入等量新培养基。
  8. 第7天，在光学显微镜下以100倍放大观察细胞。
  9. 使用PBS处理的记忆性PBMCs作为未刺激对照组。

3. 使用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）监测T细胞增殖

  1. 调整细胞密度至 0.5–1 × 107 细胞/mL，离心后用5 mL PBS重悬细胞 g 5 分钟。
  2. 将10 mM储备液用5 mL预冷的PBS稀释至1 µM CFSE；操作过程避光。
  3. 将两个离心管倾斜至45°，用巴斯德吸管将CFSE稀释液加入细胞悬液中，充分混匀，置于37 °C水浴中避光孵育15 min。
  4. 用含5% FBS的预冷PBS按10倍体积稀释细胞，440 x g离心沉淀 g 5 分钟，弃去上清液。重复洗涤 2 次。
  5. 刺激用CFSE标记的细胞 体外 按照步骤2操作。增殖实验结束后，收集细胞并用流式细胞术分析。

4. CD8+ T细胞和CD4+ T细胞增殖的流式细胞术分析

  1. 培养 7 天后，收集每个孔中的全部细胞，并将其分成两份，分别转移至两个流式管中进行分析。
  2. 将细胞转移至新的离心管中，在室温下以 440 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  3. 加入 100 µL 抗体混合液（小鼠抗鸭 CD8 抗体，1:50 或小鼠抗鸭 CD4 抗体，1:50），在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  4. 将细胞转移至新的离心管中，在室温下以 440 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  5. 加入 100 µL 抗体混合液（FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG2b 抗体，1:50），在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  6. 用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。使用 FlowJo 软件分析数据。门控策略见补充图 1。

5. 使用qPCR通过特征性基因表达检测T细胞应答

  1. 在T细胞培养结束时计数细胞，收集至1.5 mL离心管中，在400 × g条件下离心5分钟，小心弃去上清液。
  2. RNA提取
    注意：可在通风橱或超净工作台中进行提取，以防止RNA污染。
    1. 按照试剂盒说明书提供的裂解缓冲液裂解细胞。将裂解后的样品转移至gDNA过滤柱（预先置于收集管中），在13,400 × g条件下离心30秒，弃去滤柱，收集滤液。向滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇，充分混匀。
      注意：加入乙醇后出现浑浊或沉淀属正常现象，振荡混匀后继续下一步操作。
    2. 将混合液转移至RNA柱中，在13,400 × g条件下离心30秒。弃去滤液，加入700 µL RW1缓冲液，再次离心。
    3. 弃去滤液，加入700 µL RW2缓冲液（含无水乙醇），离心。弃去滤液，再加入500 µL RW2缓冲液（含无水乙醇），离心2分钟。小心将柱子从管中取出，避免滤液污染。确保彻底去除所有洗涤液，以防干扰后续反应。
    4. 将柱子转移至新的无RNase收集管中，加入50–200 µL无RNase的ddH2O，室温静置1分钟，然后在13,400 × g条件下离心1分钟以洗脱RNA。测定RNA纯度和浓度。
      注意：为提高得率，可将无RNase的ddH2O预热至65 °C，必要时可进行第二次洗脱。
  3. 按照试剂盒说明书合成cDNA。根据制造商说明合成cDNA，加入5倍量的逆转录酶。在37 °C逆转录15分钟，然后85 °C 5秒，冷却至4 °C。
  4. 根据制造商说明书配制PCR反应体系。
    1. 在qPCR管中加入10 µL 2× PCR反应酶混合液、0.4 µL引物1、0.4 µL引物2、1 µL cDNA模板和8.2 µL ddH2O，总体积为20 µL。
    2. 在实时定量PCR仪中运行以下程序：
      第一阶段：95 °C 30秒，循环1次
      第二阶段：95 °C 3秒，60 °C 30秒，循环35次
      第三阶段：95 °C 15秒，60 °C 60秒，95 °C 15秒，循环1次

6. 胞内细胞因子染色（ICS）

注意：本方案旨在通过检测鸭体内抗H5N1特异性CD8+ T细胞的细胞内IFN-γ分泌情况，评估其效应功能。

  1. 培养H5N1特异性T细胞 体外 按照步骤2中所述程序操作。在培养开始7天后，收集所有细胞（来自每个孔）。
  2. 按照步骤2所述孵育抗原呈递细胞（APCs）。将孵育后的APCs与布雷菲德林A（Brefeldin A，1:1,000）加入效应细胞中，在39 °C培养箱中共同孵育6小时。
  3. 将细胞转移至新的离心管中，以440 x g 室温孵育5分钟，弃去上清液。
  4. 加入100 µL抗体混合液（小鼠抗鸭CD8抗体，1:50），4 °C避光孵育30分钟。
  5. 通过在 400 x g 条件下离心洗涤细胞 g 4 °C下离心5分钟，用1 mL PBS重悬。加入抗体混合液（FITC标记的山羊抗小鼠IgG2b，1:50），4 °C避光孵育30分钟。
  6. 再次以 400 x g 离心洗涤细胞 g 4 °C下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于100 µL固定缓冲液中，于4 °C避光孵育20–25分钟。
  7. 再次以 400 x g 离心洗涤细胞 g 4 °C下离心5分钟。加入1 mL 1x破膜缓冲液，通过在440 x g下离心洗涤细胞2次 g 4 °C下离心5分钟。
  8. 弃去上清液，将细胞重悬于100 µL透化缓冲液中，并向细胞中加入抗体（小鼠抗鸭IFN-γ，1:10）。固定和膜透化后，在4 °C避光孵育细胞-抗体混合物30分钟，期间偶尔振荡。
    注意：透化/洗涤液为10倍浓缩液，使用前须用PBS稀释。
  9. 用 1 mL PBS 再次洗涤细胞，400 x g 离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。加入 100 µL 抗体混合液（PE 标记的山羊抗小鼠 IgG3，1:250），4 °C 避光孵育 30 分钟。
  10. 使用 FlowJo 软件分析数据。门控策略如图所示 图1.

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结果

本方案基于先前关于鸭子抗原特异性T细胞效应反应检测的研究而开发20实验的第一步包括 体外 病毒特异性T细胞的培养，这些细胞是后续效应反应研究的基础。首先，将抗原呈递细胞与效应细胞进行孵育并共培养。形态学观察显示，细胞增殖后呈现出集落生长的特征（图 2A）。CFSE 标记进一步证实了细胞成功增殖，显示出多次细胞分裂的峰群（图2B最后，我们使用鸭特异性的细胞标志物 CD8/CD4 来评估细胞的比例和绝对数量20，证实了成功的 体外 抗原特异性T细胞的培养图2C).

在培养的第7天，我们收集了细胞并检测了免疫相关基因的表达。结果显示，增殖的T细胞主要表达与细胞毒性相关的基因，如颗粒酶A（Granzyme A）和IFN-γ11...

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讨论

本方案提供了一种高效的方法 体外 培养鸭源抗原特异性T细胞，并建立了一种适用于鸭的细胞内细胞因子染色方案，可用于评估T细胞的效应反应。目前尚无关于 体外 鸭T细胞的培养方案。我们主要参考了人抗原特异性T细胞的方案，但致力于优化抗原呈递细胞（APCs）的孵育条件。我们正在考虑进一步优化分化方案。

本实验方案的成功依赖于两个关键步骤。首先，鸭T细胞的体外培养需要对刺激条件进行仔细优化，包括抗原剂量、抗原呈递细胞（APC）的活化状态以及培养时间，以确保T细胞充分扩增并保持其功能。这些参数的任何偏差都可能导致T细胞活化不充分或细胞死亡。其次，胞内细胞因子染色（ICS）法是功能性检测IFN-γ表达的关键技术。成功的ICS实验需要精确控制刺激时间、固定/通透步骤以及抗体的特异性。这两个步骤均极为敏感，必须谨慎操作，才能可靠且可重复地检测抗原特异性T细胞应答。

本研究中，我们采用流式细胞术检测细胞增殖，并通过qPCR分析特征性细胞因子的产生。尤为重要的是，我们成功表达并纯化了一株杂交瘤细胞系，该细胞系可产...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（32473060 和 32461120064）（资助对象：MD 和 ML）；广州市基础与应用基础研究项目（2025A04J5445）（资助对象：MD）；长江学者奖励计划青年学者项目（2024，Manman Dai）；以及珠江人才计划青年拔尖人才项目 "广东特支计划"（2024，Manman Dai）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管BiosharpCat#BS-15-M
15 mL 离心管LabselectCat#CT-002-15A
2-巯基乙醇（55 mM）Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48 孔组织培养板（未处理，平底）BiofilCat#TCP000048
50 mL 离心管LabselectCat#CT-002-50A
96 孔无裙边 qPCR 板LabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm 试剂盒BD BioscienceCat#BD 554714
布雷菲德菌素 A（BFA）BD BioscienceCat#347688
细胞培养 CO2 培养箱Thermo FisherHeracell 150i GP
离心机Eppendorf5810R
CFSE 标记试剂盒AbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR 预混液VazymeCat#Q341-02
鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒TbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV 逆转录预混液Accurate BiotechnologyCat#AG11706
FastPure 细胞/组织总 RNA 提取试剂盒 V2VazymeCat#RC112-01
胎牛血清GibcoCat#10437-028
流式细胞仪Beckman CoulterBA43347
流式管BeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
羊抗小鼠 488，1:50 稀释AbbkineCat#A23210
羊抗小鼠 IgG2b，FITC，1:50 稀释Southern BiotechCat#1091-31
羊抗小鼠 IgG3，PE，1:250 稀释Southern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Softwarehttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 亚型禽流感病毒株 DK383人兽共患病防控国家与地方联合工程实验室A/Duck/Guangdong/383/2008
L-谷氨酰胺（200 mM）GibcoCat#25030081
显微镜MoticAE2000
小鼠抗鸭 CD4，1:50 稀释Bio-RadCat#MCA2478
小鼠抗鸭 CD8α，1:50 稀释GeneTex Cat#GTX41834
小鼠抗鸭 IFN-γ 单克隆抗体，1:10 稀释本实验室制备 NA
NanoDrop One 分光光度计Thermo FisherAZY1603209
NEAA（非必需氨基酸）GibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR 扩增仪BiometraBiometra Tone 96G
青霉素-链霉素溶液GibcoCat#15070063
实时荧光定量 PCR 系统Applied BiosystemsABI7500
重组人 IL-2（10 μg）USCNKCat#RPA111Ga01
红细胞裂解液TbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640 培养基GibcoCat#11875-119
丙酮酸钠（100 mM）GibcoCat#11360-070
台盼蓝Sigma-AldrichCat#93595
两周龄绿头鸭（Sheldrake）广州某鸭场NA

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