全身体积描记法和多普勒超声研究小鼠肺腺癌进展过程中肺功能和血流的动态变化

摘要

该方案使用小鼠肺功能和多普勒超声作为调查技术，为研究肺腺癌提供了一种无创、简单且有效的方法。

摘要

肺腺癌 （LUAD） 是一种常见的恶性肺肿瘤，其进展导致通气和血流改变，突出了病理条件下肺部独特的功能特征。无创全身体积描记法 （WBP） 系统能够实时监测清醒小鼠的肺功能和气道反应性，避免了气管切开术和麻醉的干扰。小动物多普勒超声 （DU） 利用高频成像技术，无创捕捉微血管结构和肺血流速度的变化，为调查与 LUAD 相关的通气和灌注异常提供重要支持。在本研究中，使用 100 mg/kg 4-（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮 （NNK） 在 A/J 小鼠中建立了 LUAD 模型。采用 WBP 联合 DU 监测小鼠的肺功能和血流动力学参数。结果显示，关键指标显着下降 （p < 0.05），包括 50% 呼气流量 （EF50）、分钟通气量 （MV）、呼气峰流量 （PEF）、吸气峰流量 （PIF）、增强暂停 （Penh） 和潮气量 （TV），以及肺动脉血流速度 （p < 0.05） 在肿瘤进展期间。这种组合方法有效地捕获了小鼠 LUAD 病理发展过程中发生的功能破坏，为推进呼吸系统疾病的研究提供了一种非侵入性和有效的方法。

引言

肺腺癌 （LUAD） 是非小细胞肺癌中最常见的亚型¹。随着环境污染、烟草使用和人口老龄化的增加，LUAD 的全球患病率每年都在上升 ^2,3,4。目前的研究表明，随着 LUAD 的进展，患者的肺功能进行性下降和血流动力学紊乱 5,6,7,8。开发无创、高效且具有成本效益的方法来跟踪和评估肺功能和肺动脉血流波动，可以为临床 LUAD 管理提供关键证据。

现有研究表明，LUAD 肿瘤生长会逐渐阻塞气道，降低肺活量和通气⁹，并触发炎性细胞因子分泌，通过局部慢性炎症加剧气道狭窄¹⁰。因此，肺功能下降会导致缺氧加重和血流异常^11,12。这些病理变化通常在临床上表现为进行性呼吸困难和胸闷。虽然 CT 成像无法捕捉到 LUAD 进展引起的实时肺功能参数异常或血流动力学改变，但重复的短期 CT 扫描也会增加辐射暴露¹³。相比之下，全身体积描记法 （WBP） 和多普勒超声血流测定法是动态监测的无创、作友好且可重复的补充方法。整合这些技术来监测肺功能和血流动力学可以改善疾病进展评估和治疗决策。

在这项研究中，我们在 A/J 小鼠中使用 4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮 （NNK） 来模拟 LUAD 的发生和进展。在第 4 周、第 10 周和第 20 周通过 WBP 和多普勒超声 （DU） 纵向监测肺功能和血流动力学变化。这种方法旨在为 LUAD 病理生理学和治疗策略提供新的见解。

方案

本研究中描述的所有动物实验均经成都中医药大学动物福利伦理委员会批准，并按照动物研究伦理相关法律和标准（20240616IV）进行。雌性近交 A/JGpt 小鼠 （7-8 周龄） 维持在 20-24 °C 和相对湿度 40%-70%。在整个 12 小时的光暗循环中，为小鼠提供标准动物饲料和纯净水。动物在实验开始前 7 天适应了这种环境。

1. 动物模型的创建和准备

1. 将 NNK 溶解在生理盐水中，制备浓度为 10 mg/mL 的储备液。
2. 在第 4 周（建模后第 28 天）、第 10 周（建模后第 70 天）和第 20 周（建模后第 140 天）使用 WBP 测量肺功能。在第 20 周 （建模后第 140 天） 使用 DU 测量肺动脉血流速度。每次测量前，将小鼠置于适当的环境中，以尽量减少压力。

2. 无创肺功能检查

注意：WBP 系统使用专门设计的测量室测量清醒、自由移动的动物的呼吸功能。腔室配有气动滤网，允许空气进出腔室。气动筛网产生的空气阻力会导致腔室中相对于环境空气的压力发生微小的变化。连接一个灵敏的压力传感器来测量腔室内的这些压力变化，从中可以得出流量（称为箱流）。该软件提供呼吸参数，例如流量和容量，以及实时报告。

1. 获取以下主要部件：WBP 控制器、控制器电源变压器、控制台条、长控制台条电缆和短控制台条电缆、校准柱、WBP 体积描记器、流量传感器、温度和湿度探头、雾化器头（紫色）、偏流过滤器和管道、PC。
2. 如下所述组装硬件。
   1. 如下所述执行后面板连接。
      1. 使用 USB 2.0 电缆将控制器单元连接到计算机，并确保连接稳定。
      2. 将自来水注满柱到注水管线，连接到控制器背面的端口，并确保管线干燥。
      3. 将电源变压器插入控制器的背面，确保其连接良好。
      4. 根据控制台条的放置位置，选择长或短的控制台条电缆以连接到控制器的背面。
      5. 将控制器单元推入到位，并布置校准柱和电源变压器。
   2. 如下所述执行前面板连接。
      1. 将每个流量传感器插入标有 Sensor 的端口。将每个偏置流过滤器和管路插入前面板上标有 Bias Flow 的控制器端口。将偏置流隔离电阻器连接到偏置流管的开口端。
   3. 如下所述执行腔室连接
      1. 将暗室放在控制器单元的前面，确保将其放置在无振动的坚固、稳定表面上。
      2. 将流量传感器连接到腔室并调整传感器的方向，使 DSI 标志朝上。
      3. 将偏流管（带隔离电阻器）连接到体积描记器的底部端口。
      4. 取下体积描记器顶部的塞子，换上雾化器头（紫色）。
3. 如下所述设置软件。
   1. 启动控制程序软件并登录。在 Controller 主页上，单击 Hardware Configuration。单击 New Configuration 启动配置向导，然后选择 WBP （Serial Number： DEMO-061） 并单击 Next。
   2. 在 Species 下拉菜单中，选择 Mouse。将流速设置为默认值。选择 4 个站点 （每个站点对应一个腔室，每个会话最多 4 个腔室）。确保所有活性位点的偏压流速一致。将软件中的站点与 WBP 控制器上的实际端口相匹配。最后，单击 Finish 完成配置。
4. 数据采集
   1. 打开主程序并校准腔室，因为此步骤很关键。将鼠标悬停在硬件上可显示黄色工具图标。单击图标进入校准界面，然后单击 全部 同时校准所有四只动物的腔室。
   2. 通过在 Create Study Options 中选择 Dose Response Study （剂量反应研究 ） 来创建所需的研究方案。将 GLP 配置设置为 不遵循 GLP。
   3. 要配置测量参数和任务序列，请单击 New Parameter 打开 Parameter Builder 并添加要测量的参数。使用任务序列的默认设置。
   4. 要开始数据收集，请导航到工作站中的 “我的实验室 ”页面，然后将准备好的研究方案拖放到 WBP for mouse 中。
   5. 单击每个站点的红色三角形按钮以开始数据采集。要同时启动所有四个站点，请单击 Session > Acknowledge all sites。开始采集后，工作站将打开 Configure Acquisition 页面，并使用它来编辑采集站点中每只鼠标的信息。
   6. 依次单击 Session > Acknowledge all Sites 以开始数据收集。为确保实验结果真实可靠，请事先将实验小鼠在安静的房间里稳定 30 分钟。
   7. 将安静的小鼠放入完全密封的测试罐中。点击 Start 开始 系统中的选项来收集数据。系统每 2 秒采集一次数据，因此至少采集 10 分钟。在中间截取 4 min 的数据。在这里，每组测试了 5 只动物，并重复测试了 3 次。
   8. 单击 Study （研究） 页面上的 Create Report （创建报告 ），然后选择报告类型。以电子表格格式保存实验数据。在本实验中，采用呼气峰流速 （PEF） 、吸气峰流速 （PIF） 、增强暂停 （Penh） 和潮气量 （TV） 评估小鼠的肺功能。

3. 肺动脉血流速度测量

1. 动物准备
   1. 将小鼠置于麻醉诱导室中，并用 5% 异氟醚麻醉（流速：1 L/min）。将鼠标固定在动物处理平台上，将平台温度保持在 35-37 °C 以保持体温。
   2. 将小鼠的嘴巴和鼻子放入麻醉面罩中。用 1%-2% 异氟醚维持麻醉（流速：0.6-1 L/min）。当小鼠保持稳定的仰卧位，心率稳定，呼吸节律规律，肌肉完全放松，肢体运动无，无弧肌抽搐反应，足部撤退反射消失，粘膜呈粉红色，瞳孔无扩张时，认为已达到适当的麻醉深度。
   3. 在这个阶段，使用无菌棉签将 2-3 毫克 vet 软膏涂抹在下结膜囊上。轻轻抚摸上下眼睑，在不压迫眼球的情况下促进闭合，确保软膏在角膜表面均匀分布。
2. 成像区域准备
   1. 使用脱毛膏和脱毛装置去除胸毛。用湿纱布或湿纸巾清洁治疗区域，然后用棉签均匀涂抹预热至 37°C 的偶联剂，以达到 0.3 毫米的均匀厚度，确保没有可见的气泡。
3. 多普勒超声成像
   1. 使用 40 MHz 多普勒超声探头从胸骨旁长轴视图测量肺动脉血流速度。将探头向左倾斜 45°，将手术台向右倾斜 15°。从胸部右侧放下探头，微调 X 轴和 Y 轴，以定位右心室和肺动脉，以它们的解剖空间关系、形态学特征和血流动力学流向为指导。
   2. 按 CF 按钮切换到多普勒模式。可视化蓝色肺动脉血流信号。将采样线放在肺动脉上，然后按下 PW 按钮以显示肺动脉血流谱。
   3. 按 Freeze 按钮冻结图像，然后按 Measure 按钮并选择触摸屏上的 Velocity 选项。将测量线置于光谱的峰值，以获得最大肺动脉血流速度。
4. 数据采集
   1. 使用离线分析软件选择肺动脉脉冲多普勒数据。访问 Cardiac Package 测量包，选择 RV 和 PV 功能，并输出肺动脉血流速度和保存的图像。

4. 数据分析

1. 使用 R4.4.2 和 GraphPad Prism 9.5.1 进行数据分析并绘制数据。使用独立样本 t 检验对肺功能数据进行组间比较，而组内比较使用重复测量方差分析。采用独立样本 t 检验分析组间肺动脉血流速度比较，p < 0.05 的统计学意义。

结果

为了验证肺功能和肺动脉血流评估方法的可行性、准确性和可重复性，我们绘制了空白组第 4 周监测期间肺活量 50% （EF50，放大 10 倍） 的 PIF、PEF 和呼气流量的每分钟平均曲线（图 1A）。如该面板所示，三条相应的曲线在形状上表现出高度的一致性。尽管绝对变化很小，尤其是在 EF50 中，但这些变化仍然被捕获，表明 WBP 在收集小鼠关键呼吸参数方面具有高度敏感性。这三个参数是独立的，不需要使用其他指数进行计算。PIF 和 PEF 主要反映整体气道功能和气流速度，而 EF50 更侧重于小气道功能的评估¹⁴。PEF 通常是最高的，因为在呼气过程中，肺和胸肌的快速收缩会产生显着的压力差，从而迅速排出空气。相比之下，PIF 通常低于 PEF，因为吸气涉及胸腔扩张，压差相对较小，并且是一个必须克服肺部弹性反冲的主动过程。在呼气中期测得的 EF50 通常低于 PEF 和 PIF，因为此时肺容量减少，导致气流速度降低¹⁵。 图 1A

讨论

在本研究中，根据既往报道，选择 NNK 联合 A/J 小鼠制作肺腺癌模型。相关研究表明，NNK 联合 A/J 小鼠可在^第 10 周开始出现轻微的肿瘤形成，在^第 16 至 20^周开始稳定形成肿瘤^18,19。因此，我们选择注射后第^{4 周的}试验，观察肿瘤发展早期肺功能和肺动脉血流的变化，继续第 10^周的试验，以评估肿瘤发展初期小鼠检测指标的变化，最后在^第 20 周肿瘤发展稳定期进行检测，客观比较结果的三个测试。

本研究成功利用 WBP 技术结合多普勒超声监测 NNK 诱导的 LUAD 小鼠模型肿瘤进展过程中肺功能的动态变化。结果表明，随着肿瘤生长的进展，显着的阻塞性通气功能障碍。此外，肺动脉血流速度的显着降低可能表明血管阻力增加和肺血灌注减少，这可能是由于肿瘤生长的综合影响，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A/J 小鼠	GemPharmatech LLC。
0.5ml EDTA 管	Labshark
1-丁酮，4-（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）	顾世工园医疗器械有限公司
75% 乙醇	都克罗恩化工有限公司Ltd	2023052901
麻醉诱导室	Shanghai Tawans Intelligent Technology Co.， Ltd.	MZ-MR
脱毛膏	上海语燕仪器有限公司
脱毛装置	上海宇燕仪器有限公司	3180
异氟醚	Shanghai Duma Biotechnology Co.， Ltd.	DM-M9462
医用胶带	北京蓝福康科技有限公司	19-5023
医用三叉戟	MedChemexpress	69652
PBS 缓冲溶液	上海复盛股份有限公司	A-RY5256
生理盐水（医药）	北京生物实验室科技有限公司	GL1736‌
超声偶联剂	奇盛（上海）医疗器械有限公司