研究文章

多模态评估龙胆苦苷对CDCA诱导的HepG2细胞损伤的保护作用

DOI：

10.3791/68320

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2025年7月25日

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

本文内容

摘要

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本研究证明，龙胆苦苷可通过调控胆汁酸和脂质的生成与代谢，以及抑制氧化应激和炎症反应，治疗胆汁淤积性肝损伤。

摘要

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主要活性成分 Swertia chirayita，龙胆苦苷（GPS）已被证明可在胆汁淤积情况下对肝脏起到保护作用。为了阐明GPS对胆汁淤积性肝损伤的保护机制，采用鹅脱氧胆酸（CDCA）处理HepG2细胞以模拟胆汁淤积环境 体外采用CCK-8法检测GPS对HepG2细胞的保护作用。利用生化试剂盒检测细胞内TBA、T-CHO、TG、ALP、ALT、AST、GSH、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD和MDA的含量。通过共聚焦激光显微镜检测ROS水平。采用免疫荧光和Western blot法检测HepG2细胞中SHP-2、Tgr5、CYP7A1和NTCP的表达。随后使用Autodock软件验证其主要活性成分的分子对接情况。结果表明，GPS可显著减轻CDCA对HepG2细胞造成的损伤，其保护作用可能通过调控细胞内胆汁酸和脂质的生成与代谢，以及抑制氧化应激和炎症反应实现。

引言

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人体消化系统的代谢场所是肝脏。胆汁分泌是肝胆系统脂肪分解代谢过程中的关键机制。胆汁的主要成分胆汁酸由肝细胞释放，在维持脂肪代谢平衡中起着至关重要的作用。无论是健康个体还是疾病状态，肝脏的生理与病理过程均依赖于肝脏中游离胆汁酸与结合型胆汁酸之间的平衡。若此平衡被打破，胆汁酸循环将无法正常进行，可能导致肝内胆汁淤积及继发性肝损伤1。已有研究表明，胆汁淤积性肝损伤（CLI）是一种与代谢紊乱、肠道菌群失衡以及肝细胞坏死相关的疾病2。CLI由胆汁流动受阻及胆汁酸在肝细胞内蓄积所引起。严重的CLI可进展为肝硬化、肝纤维化和肝功能衰竭3。目前，CLI的发病机制仍较为复杂且尚未完全阐明，大多数患者接受的药物治疗疗效较低4，并伴随显著的不良反应5。因此，寻找有效的CLI治疗药物已成为当今医学界面临的紧迫问题之一。

目前的研究已表明，一些核受体在胆汁酸代谢中具有重要意义6。其中，胆汁酸受体是胆汁酸的关键调控受体，可与胆汁酸（BAs）结合并激活小肝细胞调节蛋白（SHP，small heterodimer partner）7。另一方面，胆汁酸在肝细胞中过度蓄积会导致胆汁....

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方案

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细胞培养与处理
HepG2 细胞和 MEM 培养基购自商业供应商。HepG2 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的 MEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 的环境中培养。细胞贴壁后更换培养基。每 2–3 天按 1:3 的比例传代培养，当细胞融合度达到 80% 时用于实验。

细胞活力检测
第1天，将HepG2细胞以每孔2 × 104个细胞（2 × 105个细胞/mL，100 µL/孔）接种于96孔板中，每组设6个复孔29。第2天，在接种24小时后，用不同浓度的CDCA（0、20、40、60、80、100 µM）处理细胞，持续12小时。采用CCK-8法检测细胞活力。在初次接种细胞24小时后，用不同浓度的GPS（0、25、50、100、200、400和800 µM）处理细胞，持续24小时。第3天，采用CCK-8法检测细胞活力。第4天，将HepG2细胞以每孔2 × 104个细胞（2 × 105个细胞/mL，100 µL/孔）接种于96孔板中，每组设6个复孔，培养24小时。第5天，将细胞分为六组：对照组、模型组、熊去氧胆酸（UDCA）组以及GPS 25 µM、50 µ....

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结果

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实验中CDCA的浓度设置为0 µM、20 µM、40 µM、60 µM、80 µM和100 µM的浓度梯度。当CDCA浓度为60 µM时，细胞活性与对照组相比差异显著，最终确定60 µM作为CDCA的使用浓度（图1A）。结果显示，给药后培养24小时，各组与对照组之间的细胞活性无显著差异（图1B），表明在800 µM浓度范围内，GPS对细胞活性无抑制作用。最终根据相关文献20，选择25 µM、50 µM和100 µM三个浓度进行后续实验。HepG2细胞先用60 µM CDCA诱导12小时，再分别与UDCA及不同剂量的GPS共同培养24小时，检测HepG2细胞活力的变化（图1C）。与对照组相比，模型组细胞活力显著降低（p < 0.05）；与模型组相比，UDCA组及各剂量GPS组的细胞活力均显著升高（p < 0.05），表明GPS对CDCA所致的肝细胞损伤具有保护作用。

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讨论

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胆汁淤积性肝病（CLI）是由胆汁形成、分泌或排泄受阻所引起的一种肝脏疾病。临床上表现为瘙痒、骨质疏松，甚至可进展为肝纤维化、肝硬化等疾病，严重危害生命健康36,37,38。熊去氧胆酸（UDCA）被公认为是治疗CLI最常用的药物39。然而，由于临床上存在大量对UDCA应答不佳的患者，近年来已开发出一系列新型治疗药物：法尼醇X受体（FXR）激动剂（奥贝胆酸40、西洛非克索41）、成纤维细胞生长因子19（FGF19）类似物（Aldafermin）42以及TGR5激动剂（INT-767）43，这些药物通过减少胆汁酸合成来维持肝脏正常生理功能。不可忽视的是，这些药物存在加重瘙痒症状的潜在风险，且其安全性和有效性数据有限，迫使我.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由四川省自然科学基金（2024NSFSC0697）和成都中医药大学联合创新基金项目（LH202402015）资助。

作者贡献：
Caitong Wu：方法学、正式分析、数据管理、撰写初稿，以及撰写和修改。Yang Xiao：概念化、调查、可视化和验证。Fuhan Fan：验证和修改。Zhangli Lei、Xianhua Zhou 和 Xianli Meng：修改和翻译。Yong Zeng、Hou Ya 和 Peng Shen：概念化、方法学、验证、调查、审阅和修改稿件，以及监督。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ALP南京建成生物工程研究所A059-2-2
ALT南京建成生物工程研究所C009-2-1
AST南京建成生物工程研究所C010-2-1
BCABoster Biological Technology Co., LtdAR0146
CDCA成都美得胜科技有限公司474-25-9
细胞计数试剂盒-8Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
细胞色素P450 7A1抗体Abmart 上海有限公司TD2612S
DAPI碧云天生物技术C1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
山羊抗兔IgG（H&L成都泽尼生物科技有限公司511202
山羊抗兔IgG AF488Abmart 上海有限公司M21012M
全球定位系统成都美迪生科技有限公司RP210717
GSH南京建成生物工程研究所A006-2-1
HepG2 细胞普罗赛尔生命科学 &科技有限公司CL-0103
HRP 标记的山羊抗兔 IgG中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 AS014
IL-1βElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDA南京建成生物工程研究所A003-1-2
MEM基础培养基普罗赛尔生命科学 & 技术有限公司PM150410
PBSBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
快速转移缓冲液 (20×)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROS碧云天生物技术S0033S
SHP2 兔多克隆抗体中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 A12486
SLC10A1 抗体Abmart 上海有限公司PU276166S
SOD南京建成生物工程研究所A001-3-1
待定南京建成生物工程研究所E003-2-1
T-CHO南京建成生物工程研究所A111-1-1
TG南京建成生物工程研究所A110-1-1
TGR5 多克隆抗体ImmunoWay 生物技术公司YT4636
TNF-ααElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
0.25% 胰蛋白酶溶液Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCA成都乐美天医学科技有限公司DSTDX007601
β-肌动蛋白兔单克隆抗体中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 AC026

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, T., Hasan, M. N., Gu, L. Bile acids regulation of cellular stress responses in liver physiology and diseases. eGastroenterology. 2 (2), e100074(2024).
  2. Lin, S., et al.

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