研究文章

多模态评估龙胆苦苷对CDCA诱导的HepG2细胞损伤的保护作用

DOI：

10.3791/68320

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2025年7月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究证明，龙胆苦苷可通过调控胆汁酸和脂质的生成与代谢，以及抑制氧化应激和炎症反应，治疗胆汁淤积性肝损伤。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主要活性成分 Swertia chirayita，龙胆苦苷（GPS）已被证明可在胆汁淤积情况下对肝脏起到保护作用。为了阐明GPS对胆汁淤积性肝损伤的保护机制，采用鹅脱氧胆酸（CDCA）处理HepG2细胞以模拟胆汁淤积环境 体外采用CCK-8法检测GPS对HepG2细胞的保护作用。利用生化试剂盒检测细胞内TBA、T-CHO、TG、ALP、ALT、AST、GSH、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD和MDA的含量。通过共聚焦激光显微镜检测ROS水平。采用免疫荧光和Western blot法检测HepG2细胞中SHP-2、Tgr5、CYP7A1和NTCP的表达。随后使用Autodock软件验证其主要活性成分的分子对接情况。结果表明，GPS可显著减轻CDCA对HepG2细胞造成的损伤，其保护作用可能通过调控细胞内胆汁酸和脂质的生成与代谢，以及抑制氧化应激和炎症反应实现。

引言

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人体消化系统的代谢场所是肝脏。胆汁分泌是肝胆系统脂肪分解代谢过程中的关键机制。胆汁的主要成分胆汁酸由肝细胞释放，在维持脂肪代谢平衡中起着至关重要的作用。无论是健康个体还是疾病状态，肝脏的生理与病理过程均依赖于肝脏中游离胆汁酸与结合型胆汁酸之间的平衡。若此平衡被打破，胆汁酸循环将无法正常进行，可能导致肝内胆汁淤积及继发性肝损伤1。已有研究表明，胆汁淤积性肝损伤（CLI）是一种与代谢紊乱、肠道菌群失衡以及肝细胞坏死相关的疾病2。CLI由胆汁流动受阻及胆汁酸在肝细胞内蓄积所引起。严重的CLI可进展为肝硬化、肝纤维化和肝功能衰竭3。目前，CLI的发病机制仍较为复杂且尚未完全阐明，大多数患者接受的药物治疗疗效较低4，并伴随显著的不良反应5。因此，寻找有效的CLI治疗药物已成为当今医学界面临的紧迫问题之一。

目前的研究已表明，一些核受体在胆汁酸代谢中具有重要意义6。其中，胆汁酸受体是胆汁酸的关键调控受体，可与胆汁酸（BAs）结合并激活小肝细胞调节蛋白（SHP，small heterodimer partner）7。另一方面，胆汁酸在肝细胞中过度蓄积会导致胆汁淤积，从而负向抑制SHP受体，并激活CYP7A1（细胞色素P450 7A1）受体，促进胆汁酸的生成8。此外，该过程还会阻断G蛋白偶联胆汁酸受体TGR5介导的胆汁酸分泌，并刺激牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）受体以促进胆汁酸的转运。这会导致胆汁酸在肝细胞内积聚，进而造成肝脏损伤9。因此，对该机制的进一步研究可能为CLI（胆汁淤积性肝病）的治疗提供更有效的策略。

在医学上具有悠久使用历史的Swertia chirayita是一种中国传统藏药。它被视为最佳的“蒂达”药材，当地居民常用于治疗胆囊和肝脏疾病10。该药材常用于治疗胆结石、胆囊炎、肝硬化、肝炎及其他肝脏疾病11。近期研究表明，獐牙菜属植物（Swertia）中的某些环烯醚萜类化学成分及其活性成分对肝纤维化和急性肝损伤等肝脏疾病具有良好的治疗作用12,13,14。Swertia chirayita的活性成分通过减轻炎症15以及其抗氧化特性16来缓解肝脏疾病。我们的前期研究已证实，以Swertia chirayita为主要成分的藏药复方制剂对慢性肝病（CLI）具有良好的治疗效果，提示Swertia chirayita在治疗CLI方面具有潜在应用价值17。从Swertia chirayita中提取并纯化的主要活性成分为獐牙菜苷（GPS，Gentiopicroside）18，其具有多种药理作用，包括保肝作用19、调节糖代谢20、改善肠道微生物群21以及抗肿瘤特性22。既往研究显示，GPS可通过上调胆汁酸转运蛋白的表达，改善胆汁淤积状态下的肝损伤，并减轻肝内胆汁淤积23,24。类似地，体内（in vivo）和体外（in vitro）研究均表明，GPS可通过促进脂质代谢、减轻炎症反应和降低氧化应激来缓解肝损伤25,26。

HepG2细胞常被用于 体外 肝病研究，因为它们表现出肝细胞代谢酶活性27与此同时，当暴露于四种游离胆汁酸形式之一（包括CDCA）时，肝细胞可分泌更多的胆汁28因此，CDCA可用于构建胆汁淤积性肝损伤的细胞模型，并模拟胆汁淤积环境。 体外鉴于CDCA诱导的肝细胞损伤主要由氧化应激和炎症通路介导，且已有文献报道GPS在其他肝脏环境中具有抗氧化和抗炎作用26我们假设，GPS 可能通过减轻 CDCA 诱导的 HepG2 细胞细胞毒性，从而对胆汁淤积性肝损伤（CLI）产生保护作用。本研究利用 CDCA 诱导的 HepG2 细胞损伤模型，探讨了 GPS 对 CLI 的保护作用及其分子机制。

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方案

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细胞培养与处理
HepG2 细胞和 MEM 培养基购自商业供应商。HepG2 细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）、1% 100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素的 MEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 的环境中培养。细胞贴壁后更换培养基。每 2–3 天按 1:3 的比例传代培养，当细胞融合度达到 80% 时用于实验。

细胞活力检测
第1天，将HepG2细胞以每孔2 × 104个细胞（2 × 105个细胞/mL，100 µL/孔）接种于96孔板中，每组设6个复孔29。第2天，在接种24小时后，用不同浓度的CDCA（0、20、40、60、80、100 µM）处理细胞，持续12小时。采用CCK-8法检测细胞活力。在初次接种细胞24小时后，用不同浓度的GPS（0、25、50、100、200、400和800 µM）处理细胞，持续24小时。第3天，采用CCK-8法检测细胞活力。第4天，将HepG2细胞以每孔2 × 104个细胞（2 × 105个细胞/mL，100 µL/孔）接种于96孔板中，每组设6个复孔，培养24小时。第5天，将细胞分为六组：对照组、模型组、熊去氧胆酸（UDCA）组以及GPS 25 µM、50 µM和100 µM组。除对照组外，其余各组均加入60 µM CDCA溶液处理12小时，随后分别向UDCA组和三个GPS组加入UDCA溶液（60 µM）和GPS溶液（25 µM、50 µM和100 µM），继续处理24小时。第6天，采用CCK-8法检测细胞活力。

细胞因子检测
根据已有文献报道，采用TNF-α、IL-6和IL-1β检测试剂盒检测不同处理后HepG2细胞中炎症因子的水平30。经CDCA或CDCA+GPS干预24小时后，弃去培养基，并用PBS洗涤。将细胞悬液在69 × g 条件下离心10分钟，弃上清，收集细胞沉淀。加入PBS溶液，在冰水浴条件下进行匀浆，制备细胞匀浆液。在10,005 × g、4 °C条件下离心10分钟，取上清液，采用BCA法测定细胞内容物中的总蛋白浓度。按照试剂盒说明书，利用ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平。使用多功能酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。

总胆汁酸、甘油三酯和总胆固醇的检测
根据试剂盒说明书，采用总胆汁酸（TBA）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（T-CHO）检测试剂盒对 HepG2 细胞的胆汁酸和脂质代谢进行检测31。TBA、TG 和 T-CHO 试剂均购自商业供应商。将细胞沉淀在冰水浴中进行超声破碎后，加入 RIPA 裂解液裂解 30 分钟，制备细胞匀浆。使用多功能酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。在各孔中加入 BCA 工作液并混匀细胞样品后，于酶标仪中 562 nm 波长处测定吸光度，孵育时间为 30 分钟。以标准品的吸光度值绘制标准曲线，并采用以下公式计算待测物含量：
TBA 含量（µmol/gprot）= (Asample-Ablank)/(Astandard-Ablank)×Ccalibration/Cpr
T-CHO、TG 含量（mmol/gprot）= (Asample-Ablank)/(Astandard-Ablank)×Cstandard/Cpr

肝功能评价
采用丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）评估肝功能。ALT、AST 和 ALP 试剂盒均购自商业供应商。收集细胞后，用 PBS 缓冲液清洗两遍，随后以 69 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，沉淀细胞，加入 PBS 缓冲液，并在冰水浴中通过超声破碎制备匀浆。然后设置检测孔和对照孔。按照操作表加入试剂，轻轻振荡混匀孔板，室温静置 15 分钟。使用酶标仪在 505 nm 波长下测定各孔的吸光度（OD）值。将测得的绝对 OD 值代入标准曲线，并依据公式进行进一步的定量分析。

SOD、MDA、GSH 活性的测定
SOD 活性、MDA 含量和 GSH 含量分别按照试剂盒说明书进行检测。SOD、MDA 和 GSH 试剂均购自商业供应商。简言之，采用六孔板接种细胞。处理后，根据试剂盒实验说明对细胞进行预处理（收集与破碎）。随后，按照说明书操作步骤设置空白孔、标准孔和测定孔，并向细胞检测板中加入相应的工作液。接着，将细胞按照试剂盒说明指定的温度和时间进行培养。然后使用 BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白含量。最后在指定波长下测定吸光度，对氧化应激指标进行更全面的定量分析。

使用 DCFH-DA 探针检测 HepG2 细胞中活性氧（ROS）的变化
按常规方法进行细胞计数培养。将密度为 1 × 105 个细胞/mL 的 HepG2 细胞以每皿 1.5 mL 接种于玻璃底培养皿中，按上述方法培养。培养结束后弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞。将 DCFH-DA 按 1:1000 比例稀释，每孔加入 1.5 mL 稀释液，孵育 20 分钟。孵育结束后，用基础 MEM 培养液洗涤细胞 3 次。然后每皿加入 100 µL 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂。使用荧光共聚焦显微镜在激发波长 488 nm、发射波长 525 nm 条件下观察并拍照32。

免疫荧光成像
细胞经孵育后，用 PBS 缓冲液洗涤 3 次。用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟后，在摇床上用 PBS 缓冲液清洗细胞。加入稀释液后，于 4 °C 避光条件下冷藏过夜。随后，细胞加入荧光稀释液，在 37 °C 避光孵育 1 小时。孵育结束后，细胞用 PBS 缓冲液洗涤三次。再次用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟后，在旋转摇床上用 PBS 缓冲液漂洗。接着，每孔加入 150 µL 一抗稀释液，在 4 °C 避光条件下孵育过夜。回收一抗稀释液后，加入适量 PBS 缓冲液，振荡洗涤 5 分钟，此步骤重复三次。随后，每个培养皿加入 150 µL 荧光二抗稀释液，在避光培养箱中 37 °C 孵育 1 小时。向每个培养皿中加入适量 PBS 缓冲液，在旋转摇床上洗涤 8 分钟，重复三次。最后，细胞用足量 DAPI 染色液覆盖，染色 10 分钟，用抗荧光淬灭封片剂封片，并使用超分辨率成像系统进行成像33。

Western blot 分析
经过不同处理后，使用 RIPA 裂解液提取 HepG2 细胞的总蛋白，并采用 BCA 法测定蛋白浓度。使用 10% SDS-PAGE 分离目标蛋白后，将其转移至 0.45 µm 的 PVDF 膜上。随后，用含 5% BSA 的溶液在 25 °C 下封闭膜 1.5 小时。之后，加入抗 SHP-2（1:1000）、CYP7A1（1:1000）、Tgr5（1:1000）、NTCP（1:1000）和 β-actin（1:1000）的一抗，在 4 °C 下孵育过夜。接着，在 25 °C 下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（1:10000）孵育膜 2 小时。最后，使用超敏 ECL 化学发光液显影过氧化物酶标记的条带，并通过成像系统采集图像34。

分子对接
据文献报道，分子对接过程按照以下步骤进行35。药物小分子的 .mol2 结构从 ChemicalBook 平台下载，配体蛋白的 .sdf 结构从 Uniprot 和 RCSBPDB 平台下载。使用 Pymol 软件去除配体和水分子，将配体蛋白导入 AutoDock 软件进行加氢和检测。最终输出为 .pdbqt 格式。在 AutoDock 软件中进行对接盒设置、RunAutoGrid、RunAutoDock 和 AutoDock Tools 分析，并保存每组对接结果中最低的结合能。选择每组中自由结合能最低的构象，并利用 Pymol 软件对其配体-受体构象进行可视化。

统计分析
上述数据使用 GraphPad Prism 9.2 进行统计学整理，所有实验结果均以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示。为在组间进行统计学比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。当p < 0.05时，认为两组之间的差异具有统计学意义。

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结果

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实验中CDCA的浓度设置为0 µM、20 µM、40 µM、60 µM、80 µM和100 µM的浓度梯度。当CDCA浓度为60 µM时，细胞活性与对照组相比差异显著，最终确定60 µM作为CDCA的使用浓度（图1A）。结果显示，给药后培养24小时，各组与对照组之间的细胞活性无显著差异（图1B），表明在800 µM浓度范围内，GPS对细胞活性无抑制作用。最终根据相关文献20，选择25 µM、50 µM和100 µM三个浓度进行后续实验。HepG2细胞先用60 µM CDCA诱导12小时，再分别与UDCA及不同剂量的GPS共同培养24小时，检测HepG2细胞活力的变化（图1C）。与对照组相比，模型组细胞活力显著降低（p < 0.05）；与模型组相比，UDCA组及各剂量GPS组的细胞活力均显著升高（p < 0.05），表明GPS对CDCA所致的肝细胞损伤具有保护作用。

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讨论

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胆汁淤积性肝病（CLI）是由胆汁形成、分泌或排泄受阻所引起的一种肝脏疾病。临床上表现为瘙痒、骨质疏松，甚至可进展为肝纤维化、肝硬化等疾病，严重危害生命健康36,37,38。熊去氧胆酸（UDCA）被公认为是治疗CLI最常用的药物39。然而，由于临床上存在大量对UDCA应答不佳的患者，近年来已开发出一系列新型治疗药物：法尼醇X受体（FXR）激动剂（奥贝胆酸40、西洛非克索41）、成纤维细胞生长因子19（FGF19）类似物（Aldafermin）42以及TGR5激动剂（INT-767）43，这些药物通过减少胆汁酸合成来维持肝脏正常生理功能。不可忽视的是，这些药物存在加重瘙痒症状的潜在风险，且其安全性和有效性数据有限，迫使我...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作由四川省自然科学基金（2024NSFSC0697）和成都中医药大学联合创新基金项目（LH202402015）资助。

作者贡献：
Caitong Wu：方法学、正式分析、数据管理、撰写初稿，以及撰写和修改。Yang Xiao：概念化、调查、可视化和验证。Fuhan Fan：验证和修改。Zhangli Lei、Xianhua Zhou 和 Xianli Meng：修改和翻译。Yong Zeng、Hou Ya 和 Peng Shen：概念化、方法学、验证、调查、审阅和修改稿件，以及监督。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ALP南京建成生物工程研究所A059-2-2
ALT南京建成生物工程研究所C009-2-1
AST南京建成生物工程研究所C010-2-1
BCABoster Biological Technology Co., LtdAR0146
CDCA成都美得胜科技有限公司474-25-9
细胞计数试剂盒-8Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
细胞色素P450 7A1抗体Abmart 上海有限公司TD2612S
DAPI碧云天生物技术C1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
山羊抗兔IgG（H&L成都泽尼生物科技有限公司511202
山羊抗兔IgG AF488Abmart 上海有限公司M21012M
全球定位系统成都美迪生科技有限公司RP210717
GSH南京建成生物工程研究所A006-2-1
HepG2 细胞普罗赛尔生命科学 &科技有限公司CL-0103
HRP 标记的山羊抗兔 IgG中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 AS014
IL-1βElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDA南京建成生物工程研究所A003-1-2
MEM基础培养基普罗赛尔生命科学 & 技术有限公司PM150410
PBSBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
快速转移缓冲液 (20×)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROS碧云天生物技术S0033S
SHP2 兔多克隆抗体中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 A12486
SLC10A1 抗体Abmart 上海有限公司PU276166S
SOD南京建成生物工程研究所A001-3-1
待定南京建成生物工程研究所E003-2-1
T-CHO南京建成生物工程研究所A111-1-1
TG南京建成生物工程研究所A110-1-1
TGR5 多克隆抗体ImmunoWay 生物技术公司YT4636
TNF-ααElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
0.25% 胰蛋白酶溶液Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCA成都乐美天医学科技有限公司DSTDX007601
β-肌动蛋白兔单克隆抗体中国武汉 ABclonal 生物技术有限公司 AC026

参考文献

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