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方法文章

裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe中线粒体呼吸链蛋白的表达及复合物组装分析

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DOI：

10.3791/68336

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2025年5月2日

 ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory for Pathogens and Ecosystems, College of Life Sciences, Nanjing Normal University

本文内容

摘要

裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 正逐渐成为研究线粒体的一个理想模型。本文介绍了一种用于分析 S. pombe 中线粒体呼吸复合物丰度及其组装情况的实验方案。该方法有助于揭示保守基因在线粒体呼吸链中的新功能。

摘要

线粒体呼吸链对细胞能量代谢至关重要，是氧化磷酸化的核心。线粒体呼吸链由五种酶复合物及其相互作用形成的超复合物组成。分析这些蛋白质的表达水平及复合物组装情况，对于理解线粒体功能具有重要意义。可通过在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe，简称 S. pombe）这一优良的模式生物中结合生化与遗传学方法来开展相关研究，该生物为研究线粒体生物学提供了对芽殖酵母的互补体系。本文介绍了一种详细的实验方案，用于分离 S. pombe 线粒体，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蓝色天然PAGE（BN-PAGE）分析线粒体呼吸链蛋白的表达水平及复合物组装情况。简而言之，首先纯化野生型及基因突变株的线粒体，然后溶解其复合物，并进行SDS-PAGE/BN-PAGE电泳及免疫印迹分析。该方法可用于鉴定某个基因在线粒体呼吸链中的新功能。

引言

线粒体在多种生物学过程中发挥着重要作用，例如为细胞提供能量的细胞呼吸、营养代谢以及细胞死亡1。线粒体功能障碍与脑部疾病、肌肉疾病及发育性疾病相关2,3。因此，对线粒体的研究对于改善人类衰老和健康至关重要。

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae（S. cerevisiae）长期以来被用于研究线粒体基因的功能4，因为呼吸缺陷的酵母突变体仍可通过发酵产生维持生存所需的能量。然而，该酵母属于“小菌落阳性”（petite-positive），能够在没有线粒体DNA（mtDNA）的情况下增殖。因此，线粒体基因表达缺陷的基因突变体常常丢失其mtDNA，这给进一步研究带来困难。相比之下，裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe（S. pombe）在进化上与S. cerevisiae相距较远，属于“小菌落阴性”酵母，其存活依赖于mtDNA。此外，S. pombe的mtDNA结构及其线粒体mRNA的组织形式与高等真核生物相似5。在S. pombe中，有大量（96个）基因（相比之下S. cerevisiae中仅有6个）对线粒体基因表达至关重要6。因此，S. pombe正逐渐成为一个研究线粒体基因新功能的有吸引力的模型。然而，关于S. cerevisiae线粒体的研究论文数量约为S. pombe的100倍，且针对S. pombe线粒体研究的已发表方法和实验方案也极为有限7。

线粒体呼吸链对细胞能量产生至关重要，是线粒体的核心组成部分8。它由呼吸链复合物I至V组成，包括NADH-泛醌氧化还原酶（复合物I）、琥珀酸脱氢酶（复合物II）、泛醌-细胞色素c氧化还原酶或细胞色素bc1复合物（复合物III）、细胞色素c氧化酶（复合物IV）以及ATP合酶（复合物V），同时还包括两种传递电子的中间底物——泛醌（CoQ）和细胞色素c（Cyt c）9。这些复合物还可相互作用形成更高阶的超复合物，但其组装机制在很大程度上仍不清楚10,11。然而，S. pombe缺乏复合物I，其功能可能由外源性NADH脱氢酶Nde1和内源性Ndi1所替代12,13,14。在S. pombe中，线粒体基因组编码复合物III的一个亚基（Cob1）、复合物IV的三个亚基（Cox1、Cox2、Cox3）以及复合物V的三个亚基（Atp6、Atp8、Atp9）15,16。我们最近报道过，在S. pombe中，RNA解旋酶Mss116缺失（Δmss116）16和组装因子Shy1缺失（Δshy1）15分别会影响这些蛋白的表达及其复合物的组装。为了利用这些方法促进发现更多基因在线粒体呼吸链中的新功能，本文提供了针对S. pombe线粒体呼吸链蛋白表达水平进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，以及对其复合物组装情况进行蓝-native PAGE（BN-PAGE）分析的详细实验方案。

从裂殖酵母（S. pombe）中分离线粒体的原理基于酿酒酵母（S. cerevisiae）中已建立的方法17。首先通过消化酵母细胞壁制备原生质球，随后进行机械匀浆，并通过差速离心法对线粒体进行分级分离18。接着，线粒体呼吸链蛋白经SDS-PAGE和BN-PAGE分离后进行可溶化处理并实施免疫印迹分析。BN-PAGE技术最初是为分离线粒体膜蛋白（如呼吸链复合物）而开发的19,20,21。该方法利用温和的非离子型去污剂溶解保持完整结构的膜蛋白复合物，并通过阴离子染料考马斯亮蓝G-250赋予其电荷，从而使蛋白复合物在梯度天然PAGE凝胶中依据其分子质量进行分离22。该技术已广泛应用于酿酒酵母S. cerevisiae23和哺乳动物细胞24,25中线粒体呼吸链复合物的研究；然而，在S. pombe线粒体中的应用尚不充分。

本文综合介绍了一种从裂殖酵母（S. pombe）细胞中分离线粒体，并对线粒体呼吸链蛋白进行SDS-PAGE和BN-PAGE电泳，随后进行免疫印迹分析的方法。实验流程如图1所示。在获得高质量的线粒体和抗体的前提下，本方法在S. pombe中的应用也可推广至其他生物体系，用于鉴定更多参与线粒体呼吸链蛋白表达和/或复合物组装功能的基因。

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方案

1. 准备 S. pombe 原生质球

  1. 将1 L裂殖酵母（S. pombe）细胞在补充完全培养基（YES培养基）（表1）中培养至特定菌株（野生型WT或Δshy1突变株），从OD600 = 0.05培养至OD600 = 1.0。
    注意：裂殖酵母（S. pombe）细胞的OD600不应超过2.0，否则细胞难以被溶壁酶消化形成原生质体。野生型（WT）和基因突变株可平行培养以获得可比较的结果。
  2. 在4 °C下以3,000 × g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于500 mL去离子水（ddH2O）中，并在4 °C下以3,000 × g离心5分钟再次收集细胞。洗涤细胞一次。
  3. 称量细胞沉淀的湿重（约1,000 OD600细胞对应2 g湿重）。将细胞重悬于8 mL 1× S缓冲液（表2；每克细胞使用4 mL S缓冲液）。新鲜加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度10 mM，并加入苯甲基磺酰氟（PMSF）至终浓度1 mM。
  4. 向细胞悬液中加入溶壁酶以消化裂殖酵母（S. pombe）的细胞壁。根据所用溶壁酶的不同，在30 °C下旋转孵育相应时间。
    注意：细胞壁的充分消化是分离高质量线粒体的关键步骤。
    1. 使用溶菌酶时，每克细胞湿重加入100 mg粉末，孵育约2小时；使用Lyticase时，每克细胞湿重加入10 mg粉末，孵育约1小时；使用Zymolyase-20T/100T时，每克细胞湿重分别加入5 mg/1 mg粉末，孵育约1小时；使用Lallzyme MMX时，每克细胞湿重加入1 g粉末，孵育约0.5小时；使用Vinotaste酶时，每克细胞湿重加入1 g粉末，孵育约2小时。
  5. 通过显微镜观察（40×物镜）原生质体的形成情况。取20 µL S缓冲液中的细胞悬液加入1 mL去离子水（ddH2O）中，观察大多数细胞是否已破裂（图2C）。
    注意：正常的裂殖酵母（S. pombe）细胞呈杆状（图2A）。在有效消化后，S缓冲液中超过80%的原生质体应变为圆形（图2B）。
  6. 在4 °C下以1,000 × g离心10分钟收集原生质体。将原生质体重悬于8 mL预冷的1× S缓冲液中，洗涤两次。使用剪去尖端的移液器枪头轻柔地重悬原生质体。

2. 机械匀浆  S. pombe 原生质球

  1. 用 8 mL 冰冷的 1× 匀浆缓冲液（表 3；每克细胞使用 4 mL 匀浆缓冲液）重悬原生质球，并加入 1× 蛋白酶抑制剂。将细胞转移至预冷的玻璃匀浆器（Dounce 组织研磨器，配有研杵和试管）中。
  2. 使用贴合紧密的研杵进行约 15 次上下抽提，机械匀浆细胞。为防止线粒体蛋白降解，抽提过程中应避免产生气泡，并始终将匀浆缓冲液和匀浆器置于冰上孵育。
    注意：研杵分为紧密贴合和松散贴合试管的两种类型。若使用松散研杵，可能需要多达 25 次抽提。应优化抽提次数，因为抽提过多会损伤线粒体膜，而过少则会降低线粒体得率。
  3. 使用显微镜（40× 物镜）检查原生质球的细胞膜破裂情况。
    注意：大多数原生质球在匀浆缓冲液中会失去折光性形态，变成“鬼影细胞”，但线粒体仍保持完整。

3. 通过离心法分离裂殖酵母（S. pombe）线粒体

  1. 将匀浆后的悬液转移至离心管中，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，使未破碎的细胞和碎片沉淀。
  2. 将所得上清液在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞核。重复此步骤 1 次，直至不再形成沉淀。
  3. 将上清液转移至新的离心管中，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟，沉淀线粒体及其他污染的细胞器。
  4. 倾去上清液，用 1 mL 冰冷的 1× 山梨醇-EDTA-MOPS（SEM）缓冲液（表 4）重悬沉淀。在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟，以洗涤线粒体。
  5. 用 1 mL 冰冷的 1× SEM 缓冲液重悬沉淀，并将线粒体分装，用于后续实验。
    注意：此沉淀为粗制线粒体，可于 -80 °C 保存，用于后续的 SDS-PAGE 和 BN-PAGE 实验。粗制线粒体也可通过蔗糖密度梯度超速离心进一步纯化，以满足其他实验需求。

4. 线粒体呼吸链蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹分析

  1. 使用BCA蛋白定量试剂盒，通过将线粒体悬液稀释约25倍，测定线粒体等分试样的总蛋白浓度。
  2. 向40 µL线粒体总蛋白中加入SDS-PAGE上样缓冲液。在适当温度下孵育指定时间以使蛋白变性。
    1. 检测S. pombe Cox1、Cox3、Cob1和Atp6时，在45 °C变性线粒体蛋白3分钟；检测S. pombe Cox2和Hsp60时，在90 °C变性线粒体蛋白5分钟。
  3. 将约20 µg（约4 µL）线粒体蛋白上样至12% SDS-PAGE凝胶中。使用适当的抗体对线粒体呼吸链蛋白进行免疫印迹分析，步骤如第6步15所述。
    注意：S. pombe Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6蛋白由线粒体DNA（mtDNA）编码，即使在S. pombe中也难以像常规表位标签那样进行基因编辑。因此，检测这些蛋白需要特异性抗体。为验证所分离线粒体的纯度和完整性，可在上清液中同时检测这些呼吸链蛋白，上清液应含有细胞质和核蛋白；反之，可在线粒体样品中检测代表性细胞质和核蛋白，如肌动蛋白和组蛋白H3。

5. BN-PAGE 用线粒体样品制备

  1. 将步骤3.5中前次分装的线粒体在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟，收集线粒体沉淀。取2 mg线粒体蛋白（约400 µL线粒体分装液）用于BN-PAGE分析。
  2. 将线粒体沉淀重悬于200 µL 3x BN-PAGE凝胶缓冲液（1.5 M 6-氨基己酸；150 mM Bis-Tris，pH 7.0，用HCl调节）中。加入2 µL 100x PMSF和1 µL 1 M MgCl2。将悬液在4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟。
  3. 将线粒体沉淀重悬于160 µL 5% (w/v) 数字化皂苷（DG）或64 µL 5% (w/v) 正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷（DDM）中。冰上孵育30分钟，每10分钟轻柔混匀一次。
    1. 对于S. pombe的初次实验，每毫克线粒体蛋白加入4 mg DG去垢剂，以溶解线粒体膜并维持呼吸链超复合物的完整性；每毫克线粒体蛋白加入1.6 mg DDM去垢剂，以分离线粒体呼吸链的各个独立复合物。根据BN-PAGE中不同蛋白复合物的初步结果，通过两倍递增或递减的方式调整DG和DDM的处理浓度。
  4. 将悬液在4 °C条件下以20,000 × g 离心5分钟。转移上清液，并使用BCA定量试剂盒测定可溶性蛋白浓度。
  5. 向约160 µL DG处理的上清液中加入80 µL（去垢剂体积的1/2）3x BN-PAGE上样缓冲液（表5），或向约64 µL DDM处理的上清液中加入32 µL（去垢剂体积的1/2）3x BN-PAGE上样缓冲液。
    注意：与SDS-PAGE不同，BN-PAGE的蛋白样品不能通过煮沸进行变性。

6. 线粒体呼吸链复合物的BN-PAGE及免疫印迹分析

  1. 组装预制的天然 Bis-Tris 凝胶（3%-12% 梯度）。或者，通过梯度混合器将 3% 和 12% BN-PAGE 凝胶混合，制备手工天然 Bis-Tris 凝胶（3%-12% 梯度）（表 6）。
  2. 上样经 DG 或 DDM 处理的蛋白样品以及用于天然 PAGE 的高分子量蛋白 Marker。
    1. 线粒体呼吸链复合物的 BN-PAGE 分析需使用总量为 100 µg 的溶解后线粒体蛋白。将约 12 µL 的 DG 处理蛋白样品或 5 µL 的 DDM 处理蛋白样品上样至 BN-PAGE 凝胶中。调整上样体积，以确保在最终曝光后，各样品间的上样对照（如线粒体基质蛋白 Mcp60（Hsp60））信号强度一致15。
  3. 使用含 0.02%（w/v）Coomassie G-250 的阴极缓冲液，在 80 V/6 mA 的恒定电压/电流下电泳约 30 分钟。随后，将蓝色阴极缓冲液更换为不含 Coomassie G-250 的阴极缓冲液，并在 10 mA 的恒定电流下继续电泳约 3 小时，直至 Coomassie G-250 蓝色染料前沿迁移至凝胶底部。
    1. 为防止线粒体呼吸链复合物降解或解聚，应使用预冷的缓冲液在 4 °C 条件下进行电泳。对于预制凝胶，使用预制胶运行缓冲液；对于手工凝胶，使用 1x BN-PAGE 阳极运行缓冲液（50 mM Bis-Tris，pH 7.0，用 HCl 调节）和 1x BN-PAGE 阴极运行缓冲液（15 mM Bis-Tris，pH 7.0，用 HCl 调节；50 mM Tricine）。
  4. 切下上样了蛋白 Marker 的凝胶条带，用 Coomassie R-250 染色液染色 15 分钟，脱色至 Marker 条带可见。
    注：用于天然 PAGE 的高分子量蛋白 Marker 未预染，需经 Coomassie R-250 染色后方可显现。
  5. 将凝胶其余部分浸入 1x BN-PAGE 转膜缓冲液（表 7）中平衡 30 分钟。用 100% 甲醇冲洗相同尺寸的 0.45 µm PVDF 印迹膜，并将其浸入 BN-PAGE 转膜缓冲液中平衡 10 分钟。在 300 mA 恒定电流下，将凝胶中的蛋白转印至 0.45 µm PVDF 印迹膜上，持续 2 小时。
    注：不推荐使用硝酸纤维素（NC）膜，因其对 Coomassie G-250 染料结合非常牢固。
  6. 用 100% 甲醇冲洗 PVDF 膜以去除 Coomassie G-250 蓝色染料。将 PVDF 膜置于含 5%（w/v）脱脂奶粉的 1x TBS（50 mM Tris，pH 8.0，用 HCl 调节；150 mM NaCl）封闭缓冲液中，25 °C 下孵育 1 小时。
  7. 将 PVDF 膜与针对 S. pombe 线粒体呼吸链复合物的指定一抗在 4 °C 过夜孵育。
    注：用于检测复合物 III 的 Cob1 抗体浓度为 1:1,000；用于检测复合物 IV 的 Cox1 抗体浓度为 1:2,000；用于检测复合物 V 的 Atp6 抗体浓度为 1:200。
  8. 用 1x TBST 缓冲液（表 8）洗涤 PVDF 膜。将 PVDF 膜与二抗在 1:10,000 浓度下于 25 °C 孵育 1 小时。
  9. 用 1x TBST 缓冲液洗涤 PVDF 膜。曝光并扫描 PVDF 膜。将 BN-PAGE 凝胶的曝光图像与天然蛋白 Marker 图像对齐，以估算线粒体呼吸链复合物及超复合物的分子量。

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结果

我们先前使用该方案研究了shy1（人类SURF1基因在S. pombe中的同源基因）缺失对线粒体DNA编码的呼吸链蛋白表达以及线粒体呼吸链复合物组装的影响。我们发现，在Δshy1菌株中，Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6的稳态水平显著降低（图3），表明Shy1对于线粒体DNA编码的呼吸链蛋白的表达是必需的。此外，BN-PAGE分析显示，DG溶解的呼吸链超复合物III2IV2和III2IV的丰度在shy1缺失后减少，而超复合物III2和V/Vn在Δshy1细胞中的丰度未发生显著变化（图4A）。另外，DDM溶解的二聚体复合物III（III2）在Δshy1菌株中的丰度保持不变（图4B）。这些BN-PAGE数据表明，Shy1还参与了包含复合物IV的呼吸链超复合物的形成。

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讨论

本研究中，我们提供了一种分离S. pombe线粒体并进行SDS-PAGE和BN-PAGE的详细实验方案，用于分析线粒体呼吸链蛋白的表达及其复合物的组装情况。

共免疫沉淀（co-IP）常用于检测蛋白质复合物的组装；然而，co-IP在检测线粒体膜蛋白的组装时存在困难。相比之下，BN-PAGE具有多项优势：（i）某些抗体在co-IP过程中无法识别天然蛋白质复合物中被掩蔽的表位，但在BN-PAGE后的免疫印迹中可有效识别；（ii）大分子量膜蛋白复合物在co-IP过程中容易发生聚集，而BN-PAGE中带负电荷的考马斯亮蓝G-250可减少这种聚集倾向；（iii）使用温和去垢剂NP-40或Triton X-100将膜蛋白转化为水溶性蛋白时，往往难以避免对呼吸链复合物结构的干扰，而BN-PAGE中的考马斯亮蓝G-250能够有效溶解膜蛋白22。

本方案的第一步关键操作是通过消化细胞壁制备原生质球，这是裂殖酵母（S. pombe）与酿酒酵母（S. cere...

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致谢

感谢黄颖博士和罗颖博士提供的支持。本研究得到了国家自然科学基金项目（编号：32270048，授予 J. S.；编号：31900403，授予 G. F.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6-氨基己酸SangonA430196
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5:1）40% 生物实验室GS1374
过硫酸铵SangonA100486
抗Atp6抗体Bioworld内部IB：1:200
抗Cob1抗体Bioworld自主研发IB：1:1000
抗Cox1抗体Bioworld内部IB：1:2000
抗Cox2抗体Bioworld内部IB：1:1000
抗Cox3抗体Bioworld内部IB：1:200
抗Hsp60抗体Bioworld内部IB：1:3000
BCA 蛋白定量试剂盒LEAGENEPT0001
Bis-TrisYEASEN60105ES25
考马斯亮蓝 G-250SERVA17524.01
考马斯亮蓝 R-250SangonA100472
DigitoninSigmaD141
D-山梨醇SangonA100691
EDTASolarbioE8030
梯度混合器谷子科学MGM-50
HEPESSolarbioH8090
用于天然PAGE的高分子量蛋白质标记物实时RTD6142
IgG-Alexa Fluor Plus 800（抗兔二抗）赛默飞世尔科技A32735IB：1:10000
Immobilon-FL 0.45 μm PVDF 膜MilliporeIPFL00005
Kimble Kontes Dounce 组织研磨器赛默飞世尔科技K8853000015
KOHSangonA610441
Lallzyme MMXLallemandN.A.
溶菌酶SigmaL3768
溶菌酶SigmaL4025
MgCl2SangonA601336
MOPSSangonA421333
天然 Bis-Tris 凝胶（预制）SolarbioPG41510-N
PMSFSangonA610425
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳预制胶运行缓冲液SolarbioPG00020-N
用于酵母提取物的蛋白酶抑制剂混合物BeyotimeP1020
蔗糖SangonA610498 
TEMEDSigmaT9281
TricineSigmaT0377
Tween-20SolarbioT8220
维诺泰斯特诺维信N.A.
ZymolyaseMP Biomedicals320921

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