本方案描述了一种建立患者来源的结直肠癌（CRC）类器官模型的方法，该模型与肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）共培养，用于研究二者之间的相互作用及其治疗潜力。该模型为研究肿瘤微环境中的免疫应答以及预测基于TIL的疗法在个体化CRC治疗中的疗效提供了临床前研究平台。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）已被确定为结直肠癌的重要预后标志物。TILs 的治疗应用在黑色素瘤和宫颈癌中已显示出良好的疗效。然而，其在结直肠癌治疗中的应用仍处于探索阶段。一种合适的 体外 目前尚无有效的模型用于评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的疗效，这限制了该领域的进一步发展。源自患者的类器官（PDO）模型能够高度保留原始肿瘤组织的特征，并反映患者间的异质性，为研究结直肠癌（CRC）与TIL之间的相互作用提供了优良平台。本研究描述了一种从新鲜切除的肿瘤组织中建立患者来源的结直肠癌类器官模型的方法，并进一步分离与扩增TIL。该体系可实现结直肠癌类器官与TIL的共培养，从而评估TIL介导的细胞毒性和免疫应答。通过分析TIL对类器官的杀伤效果，可预测基于TIL的免疫治疗在个体化结直肠癌治疗中的潜在疗效。此外，对TIL进行进一步的工程化改造可能增强其抗肿瘤活性，为开发更有效的细胞治疗策略提供新途径。该PDO-TIL共培养模型为结直肠癌中TIL疗法及个体化治疗策略的临床前评估提供了有力工具。
引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见且致死率最高的癌症之一，构成了重大的公共卫生挑战1。尽管在手术、化疗和免疫治疗等治疗手段方面已取得进展，但结直肠癌患者的预后——尤其是转移性疾病的患者——仍然较差。肿瘤微环境（TME）在调控癌症进展和治疗反应中发挥着关键作用，其中肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）作为影响抗肿瘤免疫反应的重要组分日益受到关注2。TILs是一类存在于肿瘤内部的多样化免疫细胞群体，已被确认为结直肠癌的重要预后标志物，较高的TIL浸润水平通常与更佳的临床结局相关3。近期研究还揭示了TILs在其他癌症（如黑色素瘤4和宫颈癌5）中的治疗潜力，基于TIL的免疫治疗在这些肿瘤中已显示出良好的疗效。
然而，尽管肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）在某些癌症类型中已取得成功，其在结直肠癌（CRC）中的应用仍处于持续研究阶段。结直肠癌的复杂性和异质性，加之其免疫抑制性的肿瘤微环境，为基于TIL的有效免疫治疗带来了挑战6。结直肠癌肿瘤通常表现出高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）7，其特征是存在调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）以及肿....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及人源材料的实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并事先获得大连大学附属中山医院伦理委员会的批准（批准编号：KY2023-206-1）。所有提供临床样本用于本研究的患者均签署了知情同意书。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
纳入标准包括经病理学确诊的原发性结直肠癌组织、足够的样本量（≥1 cm3）、无新辅助治疗史（化疗放疗或靶向治疗）以及签署知情同意书。排除标准包括样本质量差，坏死或纤维化程度超过50%、存在并发严重感染或自身免疫性疾病、有其他恶性肿瘤病史以及患者拒绝参与。
1. 细胞培养试剂的配制
- 结直肠癌类器官（CRC PDOs）培养基：根据表1中描述的成分配制CRC PDOs完全培养基。
- TILs完全培养基（CM）16：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES、2-巯基乙醇和3000 IU/mL IL-2。
- TILs扩增培养基（EM）：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES和600 IU/mL IL-2。
- AdDMEM++++：在高级DMEM培养....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立与表征
肿瘤样本取自结直肠癌（CRC）患者。采用新鲜切除的结直肠癌肿瘤组织建立类器官（PDOs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并进一步用于PDO-TIL共培养实验（图1）。
图 1：整体实验流程示意图。 该图展示了实验设计的各个连续步骤，包括结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的扩增以及共培养实.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究利用患者来源的结直肠癌组织，分离获取肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并建立类器官（PDOs），同时扩增TILs。随后通过共培养系统研究这两组分之间的相互作用。
在以往的研究中，肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的提取依赖于复杂的仪器设备19，或直接从肿瘤组织悬液中获取20。然而，这些方法通常难以在有限的肿瘤样本条件下于短时间内获得足够数量的TILs，从而限制了其广泛应用。Young-TIL培养技术的建立16显著简化了TILs的制备流程。尽管TILs已在黑色素瘤21、宫颈癌22及其他肿瘤类型23的研究中被广泛使用，但在结直肠癌（CRC）中，TILs的分离及其与患者来源类器官（PDO）模型的共培养研究仍较为有限。
本研究中，将肿瘤浸润性淋.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金 [82172822]、大连市科技局高层次人才创新支持计划 [2021RD02]、辽宁省科技计划联合项目 [2024JH2/102600067] 和辽宁省国际科技合作项目 [2024JH2/101900006] 的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| 2-巯基乙醇 | sigma | 63689 | |
| 4% 多聚甲醛 | BBI | E672002-0100 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420403 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| B27 添加剂 | Gibco | 17504-44 | |
| CD107a-PE-Cyanine7 | Biolegend | 328618 | |
| CD279-PE | Biolegend | 329906 | |
| CD3 单克隆抗体 (OKT3) | Invitrogen | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Biolegend | 300406 | |
| CD45（胞内区）(D9M8I) | CST | 13917S | |
| CD4-APC/Cyanine7 | Biolegend | 300518 | |
| CD8-APC | Biolegend | 344722 | |
| CDX-2 | MXB | RMA-0631 | |
| CK20 | MXB | Kit-0025 | |
| CK7 | MXB | Kit-0021 | |
| Dylight 488 山羊抗兔 IgG | Abbkine | A23220 | |
| Dylight 549 山羊抗小鼠 IgG | Abbkine | A23310 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| EpCAM | CST | 36746T | |
| 胎牛血清 (FBS) | Cellmax | SA211.02 | |
| FGF 10 | Peprotech | 100-26 | |
| 胃泌素（人源） | Tocris | 3006 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Hepes | Sigma | H4034 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| 人CD3+细胞分离试剂盒（仅供科研使用） | RWD | K1201-10 | |
| 人IFN-γ重组蛋白 | PeproTech | 300-02-20UG | |
| Ki-67 | CST | 9449s | |
| Matrigel | corning | 354234 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| Nivolumab（抗PD-1） | Sellerk | A2002 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | V900929 | |
| 青霉素-链霉素 | NCM Biotech | C100C5 | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-1 | |
| 红细胞裂解液 | thermo-invitrogen | 00-4300-54 | |
| 重组人IL-2（无载体） | Biolegend | 589104 | |
| RPMI 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Sellerk | S1077 | |
| 0.4% 台盼蓝染液 | thermo-invitrogen | T10282 | |
| Ultra-LEAF 纯化抗人CD28抗体 | Biolegend | 302934 | |
| Ultra-LEAF 纯化抗人CD3抗体 | Biolegend | 317325 | |
| Y-27632 | Sellerk | S1049 |
参考文献
- Eng, C., et al. Colorectal cancer. Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).
- Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope. Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).
- Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
