本方案描述了一种建立患者来源的结直肠癌（CRC）类器官模型的方法，该模型与肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）共培养，用于研究二者之间的相互作用及其治疗潜力。该模型为研究肿瘤微环境中的免疫应答以及预测基于TIL的疗法在个体化CRC治疗中的疗效提供了临床前研究平台。
本文内容
摘要
摘要
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）已被确定为结直肠癌的重要预后标志物。TILs 的治疗应用在黑色素瘤和宫颈癌中已显示出良好的疗效。然而，其在结直肠癌治疗中的应用仍处于探索阶段。一种合适的 体外 目前尚无有效的模型用于评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的疗效，这限制了该领域的进一步发展。源自患者的类器官（PDO）模型能够高度保留原始肿瘤组织的特征，并反映患者间的异质性，为研究结直肠癌（CRC）与TIL之间的相互作用提供了优良平台。本研究描述了一种从新鲜切除的肿瘤组织中建立患者来源的结直肠癌类器官模型的方法，并进一步分离与扩增TIL。该体系可实现结直肠癌类器官与TIL的共培养，从而评估TIL介导的细胞毒性和免疫应答。通过分析TIL对类器官的杀伤效果，可预测基于TIL的免疫治疗在个体化结直肠癌治疗中的潜在疗效。此外，对TIL进行进一步的工程化改造可能增强其抗肿瘤活性，为开发更有效的细胞治疗策略提供新途径。该PDO-TIL共培养模型为结直肠癌中TIL疗法及个体化治疗策略的临床前评估提供了有力工具。
引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见且致死率最高的癌症之一，构成了重大的公共卫生挑战1。尽管在手术、化疗和免疫治疗等治疗手段方面已取得进展，但结直肠癌患者的预后——尤其是转移性疾病的患者——仍然较差。肿瘤微环境（TME）在调控癌症进展和治疗反应中发挥着关键作用，其中肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）作为影响抗肿瘤免疫反应的重要组分日益受到关注2。TILs是一类存在于肿瘤内部的多样化免疫细胞群体，已被确认为结直肠癌的重要预后标志物，较高的TIL浸润水平通常与更佳的临床结局相关3。近期研究还揭示了TILs在其他癌症（如黑色素瘤4和宫颈癌5）中的治疗潜力，基于TIL的免疫治疗在这些肿瘤中已显示出良好的疗效。
然而，尽管肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）在某些癌症类型中已取得成功，其在结直肠癌（CRC）中的应用仍处于持续研究阶段。结直肠癌的复杂性和异质性，加之其免疫抑制性的肿瘤微环境，为基于TIL的有效免疫治疗带来了挑战6。结直肠癌肿瘤通常表现出高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）7，其特征是存在调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）以及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些成分均会主动抑制TIL的功能。此外，结直肠癌细胞常表达免疫检查点分子（如PD-L1），可进一步阻碍TIL介导的肿瘤杀伤作用8。同时，结直肠癌肿瘤的遗传异质性及其伴随的免疫抑制性间质，使得TIL难以有效识别并清除肿瘤细胞，因而较难达到在黑色素瘤和宫颈癌中所观察到的治疗效果9。当前研究中的一个关键空白在于缺乏能够准确模拟结直肠癌与TIL之间相互作用的合适体外（in vitro）模型。此类模型对于评估TIL在结直肠癌治疗中的潜力，并优化其在个体化治疗策略中的应用至关重要。
患者来源的类器官（PDOs）已成为模拟人类癌症的有力工具10。这些源自患者肿瘤组织的三维培养物，能够高度模拟原始肿瘤的组织学和遗传学特征，相较于传统的二维细胞系，更能准确地反映肿瘤生物学特性。PDO模型还保留了患者间的异质性，使其成为实现个体化医疗的理想平台11。在结直肠癌（CRC）研究中，PDOs已被用于药物筛选和肿瘤生物学研究12，但其在评估免疫应答——特别是肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）相关研究中的应用仍较为有限。构建PDO与免疫细胞共培养模型时，需在微环境复杂性与实验可控性之间取得平衡。尽管巨噬细胞和树突状细胞等成分可增强模型的仿生性，但由于外周血单个核细胞（PBMCs）易于获取，已成为主流选择。然而，PBMCs中肿瘤特异性T细胞比例较低，且单核细胞亚群可能干扰微环境的稳定性13。相比之下，TILs天然富集了对肿瘤有反应的T细胞克隆，并携带原位耗竭表型，因此在精确解析结直肠癌免疫逃逸机制方面具有更优的建模价值。
本研究的目的是开发一种新型 体外 评估TIL介导的结直肠癌抗肿瘤反应的平台，通过建立结直肠癌PDO与TIL的共培养体系实现。该模型可直接评估TIL对结直肠癌PDO的细胞毒性，并在患者特异性背景下分析免疫反应。利用该系统可能加深对基于TIL的结直肠癌免疫治疗潜力的理解，并支持通过工程化手段增强TIL疗效的策略探索。既往方法受限于TIL数量较少14在大多数情况下，外周血单个核细胞（PBMCs）首先与患者来源类器官（PDOs）共培养两周，随后可从PBMCs中扩增出肿瘤特异性肿瘤浸润性T细胞（TILs），再进一步与PDOs共培养以观察其细胞毒性效应15然而，这种方法也存在建模时间长和总体得率低的问题。相比之下，本文所述方法能够从小体积肿瘤组织样本中分离并建立类器官（PDOs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并可直接进行共培养。该方法在实验操作和效率方面可能更具便利性。最终，该体系旨在为TIL疗法的临床前评估提供一个有力工具，推动个性化治疗策略的发展，从而改善结直肠癌（CRC）患者的治疗效果。
方案
所有涉及人源材料的实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并事先获得大连大学附属中山医院伦理委员会的批准（批准编号：KY2023-206-1）。所有提供临床样本用于本研究的患者均签署了知情同意书。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
纳入标准包括经病理学确诊的原发性结直肠癌组织、足够的样本量（≥1 cm3）、无新辅助治疗史（化疗放疗或靶向治疗）以及签署知情同意书。排除标准包括样本质量差，坏死或纤维化程度超过50%、存在并发严重感染或自身免疫性疾病、有其他恶性肿瘤病史以及患者拒绝参与。
1. 细胞培养试剂的配制
- 结直肠癌类器官（CRC PDOs）培养基：根据表1中描述的成分配制CRC PDOs完全培养基。
- TILs完全培养基（CM）16：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES、2-巯基乙醇和3000 IU/mL IL-2。
- TILs扩增培养基（EM）：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES和600 IU/mL IL-2。
- AdDMEM++++：在高级DMEM培养基中添加1%青霉素-链霉素、1% HEPES、1%谷氨酰胺和5 mM Y-27632。
- 结直肠癌组织消化缓冲液：向AdDMEM++++中加入50 µL IV型胶原酶和10 µL青霉素-链霉素-两性霉素B溶液。
- 组织洗涤液：向PBS中加入2%青霉素-链霉素。
2. 患者来源组织的处理
- 由经验丰富的外科医生切除原发性结直肠癌肿瘤组织。采集后，将组织分为两部分：将其中一部分置于冰盒中的 AdDMEM++++ 中，运送至实验室用于肿瘤细胞解离与培养；另一部分置于 4% 多聚甲醛中，用于组织病理学分析17。
- 将 Matrigel 在 4 °C 冰箱中缓慢解冻。将红细胞裂解缓冲液预热至室温。准备组织剪、镊子、AdDMEM++++ 培养基和结直肠癌组织消化缓冲液。
- 将组织转移至培养皿中，用 5 mL PBS 洗涤三次。更换新的培养皿，再用 5 mL 组织洗涤缓冲液洗涤三次，以最大限度减少污染。
- 用剪刀将组织剪碎，转移至消化缓冲液中，在 37 °C 水浴中孵育 30 min，直至完全解离。
- 用组织剪进一步剪切组织，并转移至组织消化液中。在 37 °C 水浴中进行消化，并持续观察，直至组织完全解离。
- 加入等体积的 AdDMEM++++ 以中和消化反应。在 25 °C 下以 380 × g 离心 5 min。
- 用移液器弃去上清液。观察沉淀中红细胞的数量。加入 1–3 mL 红细胞裂解液，在 25 °C 孵育 10 min。
- 加入等体积的 AdDMEM++++ 终止裂解反应。在约 25 °C 下以 380 × g 离心 5 min。
- 用移液器弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适量体积的 AdDMEM++++ 中。
- 采用台盼蓝排斥法对活细胞进行定量，获得肿瘤组织的单细胞悬液。
3. PDO 模型的建立与 TILs 培养
- 将肿瘤组织的单细胞悬液分为两部分：一部分用于类器官（PDO）模型的建立，另一部分用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的培养。
- 细胞计数后，将每孔80,000个细胞的细胞悬液与Matrigel按1:1比例混合，用于PDO模型的建立。
- 将剩余的细胞悬液以1 × 106 cells/mL的浓度重悬于完全培养基（CM）中，接种于24孔板进行TILs培养。
- 每日观察，拍照记录PDO和TILs的生长状态，每2天更换一次培养基。
4. TIL 的纯化与扩增
- 在纯化前将TILs培养10-20天。
- 将TILs收集至离心管中。用新鲜培养基冲洗培养板孔，并收集孔板中残留的细胞。
- 在约25 °C条件下，以125 × g离心5 min。
- 用移液器弃去上清液。加入2 mL PBS洗涤，然后在约25 °C条件下再次以125 × g 离心5 min。
- 进行细胞计数。
- 使用CD3+ 磁珠分选法分离CD3+T细胞18。
- 将抗体与细胞悬液在4 °C孵育10-15 min。
- 将磁珠与抗体-细胞悬液在4 °C孵育10-15 min。
- 将分选柱放入分选磁铁中。将细胞悬液加入分选柱，仅使磁珠标记的阳性细胞保留在分选柱中。
- 将分选柱从磁场中取出。加入缓冲液以洗脱分选柱中保留的阳性细胞。将细胞重悬于2 mL PBS中，并在约25 °C条件下以195 × g 离心5 min。
- 用移液器弃去上清液。将细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于12孔板中的新鲜EM培养基中。加入5 µg/mL CD3抗体。每3天将细胞传代至新的培养瓶中。
5. 类器官的组织学与免疫组化表征
- 当类器官生长至50 µm大小时，吸除培养基。
- 直接使用4%多聚甲醛固定类器官球体。吸除类器官，于约25 °C下以195 × g离心5 分钟，将沉淀物包埋于2%琼脂糖中，待其凝固后转移至4%多聚甲醛中过夜固定。
- 次日进行梯度脱水处理。制备石蜡包埋块，切取4 µm厚切片，采用梯度溶液复水，随后使用CK7、CK20、Ki-67和CDX-2抗体进行免疫组织化学染色。
6. 肿瘤浸润淋巴细胞的免疫荧光表征
- 纯化肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），培养至获得足够数量后，取出部分细胞用于表征分析。
- 采用剥离法对悬浮细胞进行表征。将剥离仪的转速设定为 343 × g ，在约 25 °C 下离心 4 分钟。
- 将细胞计数后以每张载玻片 1 × 104 的密度接种。
- 通过离心将细胞牢固地附着于载玻片上。
- 用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，并用 PBS 洗涤三次。
- 加入封闭液（含 2% FBS 的 PBS）于室温孵育 1 小时。
- 加入一抗（CD45、CD3、EpCAM）于室温孵育 1 小时，随后用 PBS 洗涤三次。
- 根据制造商推荐浓度配制二抗，并于室温孵育 1 小时，之后用 PBS 洗涤三次。
注意：注意抗体的同源性问题。 - 加入 DAPI 于约 25 °C 下孵育 15 分钟。
- 在荧光显微镜下观察染色后的细胞。
7. PDOs 与 TILs 共培养系统
- 向类器官培养基中加入 IFN-γ 以增强抗原呈递。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 h15。
- 用 PBS 稀释抗 CD28 抗体。通过向每孔加入 50 µL 抗体溶液，对 96 孔板进行包被。用封板膜密封后，在 4 °C 孵育 24 h。
- 孵育 24 h 后，使用 TrypLE 将类器官消化为单细胞。计数细胞，并用 PBS 洗涤两次。
- 收集配对的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），计数细胞，并用 PBS 洗涤两次。
- 将类器官以每孔 1 × 104 个细胞接种，TILs 以每孔 1 × 105 个细胞接种，使效应细胞与靶细胞（E:T）比例达到 10:1，进行共培养。
- 在补充有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、3000 U/mL IL-2 和 20 µg/mL 抗 PD-1 阻断抗体的 RPMI 1640 培养基中进行共培养。孵育 3 天后，采集图像用于观察和记录。
注意：设置未添加 TILs 的类器官作为对照组。
8. 通过流式细胞术对肿瘤浸润淋巴细胞进行功能检测
- 在共培养期结束时收集PDOs和TILs。
- 用PBS洗涤细胞两次，每次以300 × g 离心5 分钟，使用移液器弃去上清液。
- 配制含有CD3-FITC、CD4-APC/Cyanine7、CD8-APC、CD107a-PE-Cyanine7、CD279-PE和7-AAD的抗体混合液。
- 将细胞重悬于100 µL抗体混合液中，室温避光孵育20 分钟。
- 加入1 mL PBS洗涤细胞，以300 × g 离心5 分钟，使用移液器弃去上清液。
- 将细胞重悬于500 µL PBS中。
- 进行流式细胞术分析。详细的分析策略请参见补充图1。
结果
结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立与表征
肿瘤样本取自结直肠癌（CRC）患者。采用新鲜切除的结直肠癌肿瘤组织建立类器官（PDOs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并进一步用于PDO-TIL共培养实验（图1）。
图 1：整体实验流程示意图。 该图展示了实验设计的各个连续步骤，包括结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的扩增以及共培养实验。请点击此处查看该图的放大版本。
利用患者来源的肿瘤组织成功建立了结直肠癌类器官（CRC PDOs），并记录了其在12天内的生长过程。第1天，类器官呈现为细小、分散的细胞簇（图2，左上），表明处于早期发育阶段。至第6天，观察到进一步的聚集与扩展，形成更为明显且略大的细胞簇（图2，中上）。到第12天，类器官边界清晰，体积增大，反映出显著的成熟与生长（图2，右上）。该发育过程表明结直肠癌类器官在体外培养中成功建立并持续扩增。
图2：结直肠癌患者来源类器官（PDOs）的时间进程形态学发育。 结直肠癌PDOs包埋于Matrigel中，在传代前连续12天培养期间拍摄的代表性相差显微图像。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
采用多种标志物的免疫组织化学染色对结直肠癌（CRC）组织及其相应的类器官（PDOs）进行了表征。苏木精和伊红（HE）染色显示，CRC组织与衍生的PDOs具有相似的结构特征。细胞角蛋白7（CK7）和细胞角蛋白20（CK20）的免疫染色证实了类器官的上皮特性，这两种标志物在CRC组织和PDOs中均呈阳性（图3，中间和右列）。此外，增殖标志物Ki-67和肠道分化标志物尾型同源框2（CDX2）在两者中也表现出相似的表达模式（图3，第二列和第四列）。这些结果表明，结直肠癌PDOs能够高度模拟原始肿瘤组织的细胞和结构特征，验证了其在后续功能研究中的相关性。
图 3：结直肠癌患者来源类器官（CRC PDOs）及其对应原发肿瘤组织的组织学与免疫组织化学表征。 对结直肠癌患者来源类器官（CRC PDOs）及配对的患者肿瘤组织进行苏木精-伊红（HE）染色以及 CK7、Ki-67、CDX2 和 CK20 的免疫组织化学染色。比例尺：50 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
从肿瘤细胞悬液中培养和扩增肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）及TILs的表征
在22天的时间内监测了从肿瘤组织单细胞悬液中逐步扩增TILs的过程。明场显微镜图像显示，第1天时TILs分布稀疏。到第14天，TILs密度明显增加，并开始形成细胞簇。到第22天，观察到进一步的聚集和生长，表明TILs持续扩增（图4）。
图4：从解离的肿瘤样本中扩增肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。 来自结直肠癌（CRC）肿瘤消化物的TIL培养物在第22天的代表性相差显微图像。培养物显示为松散贴壁的单层细胞和成簇增殖的淋巴细胞，未见明显的肿瘤细胞。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
为验证扩增后肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的纯度，采用免疫荧光染色检测CD45、CD3及上皮细胞黏附分子（EpCAM）的表达。结果显示CD45与CD3均呈强阳性信号，表明TIL群体主要由T细胞构成，且纯度较高。CD3与CD45的共定位进一步证实了T细胞在其中占主导地位。补充图2）。相比之下，EpCAM 染色完全呈阴性，证实了肿瘤细胞的缺失。这些结果表明，利用 CD3+ 磁珠分离得到的 TIL 群体几乎不含肿瘤细胞，主要由 CD3+ T 细胞组成。这些细胞群体的高纯度和强免疫反应性为后续功能研究提供了可靠的资源（图5).
图 5：TIL 培养物中主要细胞成分的免疫荧光鉴定。 典型的免疫荧光图像显示 TIL 细胞经 DAPI（蓝色）、CD45（绿色）、CD3（红色）和 EpCAM 共同染色。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
肿瘤浸润淋巴细胞与结直肠癌类器官的共培养
为进一步验证肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的抗肿瘤效应，采用明场显微镜监测了结直肠癌类器官（CRC PDOs）与TILs的共培养情况（图6）。在72小时的培养期间，共培养组的类器官逐渐失去原有形态，表现出明显的细胞损伤和结构破坏，而单独培养的类器官则无此现象。该结果提示，TILs对类器官具有显著的细胞毒性作用，且随着共培养时间的延长，这种效应愈发明显。此外，通过流式细胞术定量分析了共培养后类器官的凋亡率。经过72小时共培养，活细胞比例从76.20%下降至21.43%（补充图3）。
图6：CRC PDOs与TILs的共培养。（A）CRC PDOs在0小时、24小时和72小时的明场图像，显示类器官的生长和聚集情况。（B）CRC PDOs与TILs共培养在0小时、24小时和72小时的明场图像，显示两种细胞群体之间的相互作用。比例尺：50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
结直肠癌类器官共培养条件下TILs的免疫激活及其功能调控
与类器官共培养后，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）亚群的分布发生了变化（图7A）。为进一步评估TILs的免疫效应功能，检测了T细胞活化标志物CD107a的表达频率。结果显示，与类器官共培养后，TILs中CD107a的表达频率从7.59%上升至42.71%（图7B），表明TILs被成功激活。
此外，还检测了免疫检查点分子CD279（PD-1）的表达。在共培养组中，尽管肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）表现出较强的细胞毒功能，CD279的表达仍从6.45%上升至44.14%图7C)，提示可能存在免疫逃逸机制。同时检测了IFN-γ的释放，共培养后其表达水平从0.67%上升至8.91%。最后评估了TILs作用下PDOs的存活率，观察到其从76.20%下降至21.43%，表明具有显著的细胞毒性效应（补充图3).
图7：结直肠癌类器官与肿瘤浸润淋巴细胞共培养前后免疫活化标志物的流式细胞术分析。 （A）CD3+、CD4+ 和 CD8+ T细胞亚群的比例。（B）表达CD107a的CD8+ T细胞比例。（C）表达CD279（PD-1）的CD3+ T细胞比例。（D）产生IFN-γ的CD8+ T细胞比例。（E）通过流式细胞术检测结直肠癌类器官与TIL共培养前后CD3、CD4和CD8 T细胞比例的统计分析。（F）通过流式细胞术分析共培养前后CD107a表达水平的统计比较。（G）通过流式细胞术测量共培养前后CD279表达水平的统计分析。（H）通过流式细胞术确定共培养前后IFN-γ表达水平的统计分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：图7中流式细胞术分析的设门策略。 用于鉴定T细胞内IFN-γ以及表面CD107a和CD279表达的详细设门策略，以评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的反应性。请点击此处下载该文件。
补充图2：通过免疫荧光检测TILs中CD3与CD45的共定位。 代表性图像显示CD3与CD45的共定位，证实分离的淋巴细胞具有高纯度。请点击此处下载该文件。
补充图3：结直肠癌类器官与肿瘤浸润淋巴细胞共培养后凋亡的流式细胞术分析。 代表性流式细胞术图显示与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共孵育72小时后肿瘤细胞的存活状态。活细胞肿瘤细胞定义为EpCAM+且7-AAD-。图中包含设门策略。请点击此处下载该文件。
| 材料名称 | 终浓度 |
| Advanced DMEM/F12 | 向 50 mL Advanced DMEM/F12 中添加 |
| EGF | 50 ng/mL |
| A83-01 | 500 nM |
| Y-27632 | 5 µM |
| SB202190 | 5 µM |
| B27 补充剂 | 1x |
| 烟酰胺 | 5 mM |
| N-乙酰半胱氨酸 | 1.25 mM |
| 胃泌素（人源） | 10 nM |
| FGF 10 | 50 ng/mL |
| GlutaMax 100x | 1x |
| Hepes | 10 mM |
| Primocin | 50 mg/mL |
| 青霉素/链霉素 | 100 U·mL-1 / 100 mg·mL-1 |
| 50% L-WRN 细胞系上清液 | 1x |
表1：用于结直肠癌类器官（CRC PDO）培养的完全培养基的组成。 用于结直肠癌类器官（PDO）维持和生长的培养基详细配方。
讨论
本研究利用患者来源的结直肠癌组织，分离获取肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并建立类器官（PDOs），同时扩增TILs。随后通过共培养系统研究这两组分之间的相互作用。
在以往的研究中，肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的提取依赖于复杂的仪器设备19，或直接从肿瘤组织悬液中获取20。然而，这些方法通常难以在有限的肿瘤样本条件下于短时间内获得足够数量的TILs，从而限制了其广泛应用。Young-TIL培养技术的建立16显著简化了TILs的制备流程。尽管TILs已在黑色素瘤21、宫颈癌22及其他肿瘤类型23的研究中被广泛使用，但在结直肠癌（CRC）中，TILs的分离及其与患者来源类器官（PDO）模型的共培养研究仍较为有限。
本研究中，将肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）与结直肠癌类器官（CRC PDOs）共培养后，显著激活了TIL并诱导其产生细胞毒性。TIL的激活表现为CD107a表达水平显著升高。此外，与TIL共培养的PDOs表现出明显的结构损伤和细胞死亡。观察到TIL中CD279（PD-1）表达上调，提示TIL可能出现耗竭，这是基于TIL疗法已知的挑战之一。TIL耗竭的特征是效应功能受损，例如细胞因子产生减少（如IL-2、IFN-γ）以及抑制性受体（包括PD-1和CTLA-4）表达增加24。这些机制限制了TIL抗肿瘤反应的持久性。
由于本研究中共同培养的时间相对较短，TIL 衰竭的潜在机制尚未得到充分探究，仍需进一步研究。为克服这一局限性，未来的研究可探索联合策略以预防或逆转 TIL 功能障碍，例如添加细胞因子（如 IL-15）25、联合使用免疫检查点抑制剂（如抗 PD-1 或抗 CTLA-4 抗体），或调控肿瘤代谢通路（如靶向缺氧或乳酸积聚）26。此外，基因工程方法（如 SNX9 敲除）可能有助于揭示如何长期维持 TIL 功能27。系统性地探索这些策略有望弥合结直肠癌临床前模型与个体化 TIL 免疫疗法临床转化之间的差距。
本研究建立的共培养系统为探究结直肠癌（CRC）的免疫动态提供了一个有价值的模型。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的活化，结合观察到的免疫检查点分子上调现象，提示靶向PD-1/PD-L1等通路可能增强基于TIL的免疫治疗的疗效。尽管TILs在结直肠癌中的临床应用仍处于早期阶段，但该领域的进一步发展有望实现高度靶向、个体化的治疗策略。
尽管前景广阔，PDO-TIL 共培养模型仍存在若干局限性。其中一个主要挑战在于TIL扩增效率的不稳定性 体外，其中长期培养可能导致T细胞功能下降或表型漂移。此外，在共培养系统中准确模拟免疫检查点相互作用——如PD-1/PD-L1信号通路——仍然存在困难，可能影响对肿瘤免疫动态的准确反映。可扩展性是另一项挑战；类器官的生成与维持过程耗时且劳动密集，限制了高通量应用的可行性。解决这些局限性需要优化肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）扩增方案，整合免疫检查点调控策略，并开发更自动化、高效的共培养系统。
本研究为肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）在结直肠癌（CRC）中的转化应用建立了基础平台。尽管TIL疗法在某些癌症中已显示出疗效28，但患者的反应仍存在异质性。PDO-TIL共培养系统为临床前评估旨在增强抗肿瘤免疫反应的个体化免疫治疗策略提供了机会。然而，为了最大限度地提高其在结直肠癌中的相关性，仍需进一步优化。结直肠癌在其肿瘤微环境（TME）中呈现出独特的免疫挑战，包括微生物影响、免疫细胞浸润的独特模式、代谢改变以及缺氧状态。引入这些因素，例如肠道微生物群衍生的代谢物或免疫调节因子，可能提高该模型的生理相关性。
此外，鉴于结直肠癌（CRC）在分子水平上的异质性，尤其是在微卫星不稳定性高（MSI-H）和微卫星稳定（MSS）肿瘤等亚型中，将更广泛的肿瘤和免疫细胞特征整合到模型中，将有助于更全面地评估免疫治疗的疗效。随着基因工程技术的进步，例如根据肿瘤特征对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中的细胞因子信号通路或检查点受体表达进行改造，有望进一步提高模型的精确性，并推动个体化免疫治疗的发展。
通过整合这些优化，PDO-TIL 共培养模型能够更准确地模拟结直肠癌的复杂免疫生物学特性及免疫逃逸机制。这将为临床环境中推进个体化免疫治疗策略提供一个具有预测性和转化价值的平台。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金 [82172822]、大连市科技局高层次人才创新支持计划 [2021RD02]、辽宁省科技计划联合项目 [2024JH2/102600067] 和辽宁省国际科技合作项目 [2024JH2/101900006] 的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级DMEM/F-12 | Gibco | 12634028 | |
| 2-巯基乙醇 | sigma | 63689 | |
| 4% 多聚甲醛 | BBI | E672002-0100 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420403 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| B27 添加剂 | Gibco | 17504-44 | |
| CD107a-PE-Cyanine7 | Biolegend | 328618 | |
| CD279-PE | Biolegend | 329906 | |
| CD3 单克隆抗体 (OKT3) | Invitrogen | 14-0037-82 | |
| CD3-FITC | Biolegend | 300406 | |
| CD45（胞内区）(D9M8I) | CST | 13917S | |
| CD4-APC/Cyanine7 | Biolegend | 300518 | |
| CD8-APC | Biolegend | 344722 | |
| CDX-2 | MXB | RMA-0631 | |
| CK20 | MXB | Kit-0025 | |
| CK7 | MXB | Kit-0021 | |
| Dylight 488 山羊抗兔 IgG | Abbkine | A23220 | |
| Dylight 549 山羊抗小鼠 IgG | Abbkine | A23310 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| EpCAM | CST | 36746T | |
| 胎牛血清 (FBS) | Cellmax | SA211.02 | |
| FGF 10 | Peprotech | 100-26 | |
| 胃泌素（人源） | Tocris | 3006 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050-061 | |
| Hepes | Sigma | H4034 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| 人CD3+细胞分离试剂盒（仅供科研使用） | RWD | K1201-10 | |
| 人IFN-γ重组蛋白 | PeproTech | 300-02-20UG | |
| Ki-67 | CST | 9449s | |
| Matrigel | corning | 354234 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| Nivolumab（抗PD-1） | Sellerk | A2002 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | V900929 | |
| 青霉素-链霉素 | NCM Biotech | C100C5 | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-1 | |
| 红细胞裂解液 | thermo-invitrogen | 00-4300-54 | |
| 重组人IL-2（无载体） | Biolegend | 589104 | |
| RPMI 1640 | Gibco | ||
| SB202190 | Sellerk | S1077 | |
| 0.4% 台盼蓝染液 | thermo-invitrogen | T10282 | |
| Ultra-LEAF 纯化抗人CD28抗体 | Biolegend | 302934 | |
| Ultra-LEAF 纯化抗人CD3抗体 | Biolegend | 317325 | |
| Y-27632 | Sellerk | S1049 |
参考文献
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