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方法文章

成年Xenopus可及组织的高效全面取样技术

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DOI：

10.3791/68353

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2025年6月10日

 ,  , 
1Department of Systems Biology, Harvard Medical School

本文内容

摘要

这是全面的Xenopus取样方案的第一部分。所采集的组织包括心室、动脉干、左肝叶、胆囊、肺、胰腺、脾脏、喉、食管、胃、肠道、睾丸、脂肪体、输卵管、成对肾脏、坐骨神经丛、皮肤、胸腺以及完整眼球。

摘要

Xenopus 长期以来一直是研究脊椎动物发育和疾病的關鍵模式生物，為細胞過程和基因功能提供了深入的見解。儘管關於Xenopus胚胎的研究信息豐富，但在成體組織取樣的標準化方法方面仍存在顯著空白，特別是針對定量蛋白質組學等現代技術。本研究提出了一種針對成年Xenopus多組織快速、精確且高效的取樣綜合方案。該方案解決了與其他無尾目動物相比解剖結構差異細微所帶來的挑戰，即使對青蛙解剖經驗有限的研究人員也能確保實驗的可重複性。本方案通過優先保證樣本的新鮮度，以滿足高質量生化分析的需求。我們可在一小時內快速收集最多18種組織。此外，該方法適用於灌注與非灌注條件，可靈活滿足多種實驗需求。本工作不僅填補了Xenopus laevis和tropicalis在方法學上的關鍵空白，也為將技術應用於其他類似兩棲動物模型的研究人員提供了寶貴資源，從而拓展並提升了比較生物學與進化研究的範圍與可靠性。

引言

Xenopus 在研究人类疾病方面相较于小鼠、斑马鱼及其他模式生物具有独特优势，尤其适用于发育与进化研究。其胚胎体外发育，且胚胎体积大、易于操作，可实现对组织移植、基因编辑等实验操作的实时观察，而小鼠因胚胎在体内发育，需依赖侵入性操作，难以实现类似研究。此外，Xenopus 具有三腔心脏和四足动物的四肢，为研究先天性缺陷1、肢体再生2和心脏发育3提供了更直接的进化桥梁。与小鼠不同，Xenopus 蝌蚪具备肢体和器官再生能力，可模拟哺乳动物所缺乏的再生过程；其水生生活阶段也便于非侵入性地研究环境因素或毒素的影响。结合繁殖周期短、成本低及伦理限制较少等优势，Xenopus 在器官发生和应激反应的高通量、机制性研究方面优于哺乳动物体系，而此类研究在哺乳动物系统中难以复制。

本文旨在为成年Xenopus组织提供精确且可重复的器官取样操作指南，正如已有针对Xenopus蝌蚪的类似指南4。尽管目前已可进行成年Xenopus的"数字解剖"5和“显微CT成像”6，但在缺乏如小鼠等其他成年动物模型所具备的详细操作说明的情况下7,8,9，实现成年Xenopus器官与组织取样的标准化仍具挑战性。

尽管已有六种关键组织的取样指南10，但目前尚无针对Xenopus的专门且全面的解剖与取样指南。虽然存在针对Rana属物种的完整解剖指南11，并且也有适用于其他无尾目动物的各种课堂解剖手册12，但对于缺乏取样技术或两栖动物解剖学经验的研究人员而言，Xenopus与其他无尾目动物之间存在的细微差异使得现有资源难以满足组织取样的一致性和可重复性要求。

本指南旨在优先保证蛋白质组学和免疫化学实验中组织的新鲜度。对于有经验的操作者，可在一小时内从单个个体中完成所有组织的采集。建议缺乏经验的操作者在牺牲难以替代的动物之前，先在因其他原因实施安乐死的标本上尝试本实验方案。

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方案

所有实验均经哈佛医学院动物护理和使用委员会（IACUC，机构动物护理和使用委员会编号 IS 00001365_3）批准，并遵循其规章制度进行。若在取样前已执行灌注方案13，则跳至步骤 2.3。

1. 准备（无需灌注）

  1. 确保研究机构已批准本方案中所述的安乐死技术。
  2. 配制含有 5 g/L MS-222（三卡因甲磺酸盐）和 5 g/L 碳酸氢钠的溶液（参见材料表）。检测 pH 值，确保其 ≥7。
    注意：溶液体积必须大于完全浸没待安乐死动物所需的体积。
  3. 通过将Xenopus置于步骤 1.2 中的 MS-222 溶液中进行主要安乐死处理，保持动物完全浸没，持续 1 小时14。
  4. 将解剖台面（托盘或泡沫板）倾斜放置于次级容器内，或以其他方式布置，以便于血液引流。
  5. 当青蛙在溶液中放置 1 小时后，主要安乐死过程即已完成。取出青蛙，并通过脚掌夹捏测试检查其疼痛反应是否消失。
  6. 记录被取样动物的年龄（如已知）、性别、健康状况，以及是否已进行灌注。称量Xenopus体重，并在取样前完成其他必要的测量。
  7. 将青蛙仰卧放置，并用大头针固定前肢靠近躯干的部位（图 1A）。
  8. 使用解剖剪沿中线向上剪开皮肤，然后横向剪开，形成两个皮瓣。
  9. 辨认白线（linea alba）（图 1B）。用镊子夹住白线并将其从体腔拉开。小心使用剪刀沿肌肉组织向头部方向剪开。将体壁分成两个瓣，并将所有瓣剪开或固定至一侧，以便暴露操作区域。
  10. 辨认心脏，此时心脏应仍在跳动。若心脏不易接触，可使用解剖剪剪除喙骨（图 1B）。
    注意：若在取样前心脏已停止跳动，则样本的新鲜度已受损。
  11. 如需要，可完成快速灌注方案9。

2. 取样

注意：如果动物已经灌注，请跳至步骤 2.3。所有切缘应约为 25 mm。在处理不同样本之间，应将镊子和剪刀擦拭干净或更换。所有组织应在安乐死后 1 小时内取样，以保证最大程度的新鲜度。

  1. 使用移液管，用预冷的 PBS 或 0.7x PBS15冲洗体腔，以清除血液并保持视野清晰。
  2. 辨认出薄薄的心包膜（图 2A），用组织镊将其拉紧。用虹膜剪的尖端轻轻刺穿心包膜，注意不要剪到下方组织。将心包膜从心脏的三个腔室上剥离（图 2B）。
  3. 在耳房与心室和动脉干连接处将其剪除，去除耳房。
  4. 用镊子夹住心室的顶端，于心室与动脉干连接处下方剪断，保留一定边缘（图 2C）。
  5. 在放大镜下目视检查心室，确保无非目标组织附着。
    注意：心室中心可能含有浅色的螺旋瓣组织；可予以保留。在未灌注的动物中，心室的摘除可视为二次安乐死（也称终末麻醉）。
  6. 取样后立即根据实验需求，用预冷的 PBS 或 0.7x PBS 冲洗组织样本15。
    注意：在已灌注的动物中，除肝脏外的所有组织应能被彻底冲洗干净。若无法实现，应予以记录。在未灌注的组织中，所有冲洗液均会被血液饱和。每次取样后均应执行步骤 2.5–2.6。
  7. 观察到动脉干分为两条主动脉干（也称侧主动脉），每条再分为三条动脉弓（图 2D）。拉紧动脉干，并在动脉弓分叉后立即剪断主动脉干。
  8. 辨认肝脏的三个叶（图 3A）。夹住左侧叶的边缘（观察者的右侧），轻轻提起，使肝管和胆囊管可见。取该叶下部三分之二的组织，位于这些附着结构下方（图 3B）。
  9. 辨认胆囊，其颜色可能差异显著。夹住胆囊，将其从肝脏右叶上拉开并切断连接（图 3C）。若胆囊未破裂，可用虹膜剪将其刺破。
  10. 夹住肺的顶端并拉紧。注意肺泡的质地，并确定该质地终止、支气管开始的位置。在此边界处剪断（图 3D）。若肺与腹膜粘连，应小心分离。
  11. 辨认卵巢，其被一层称为生殖上皮的脏层腹膜包裹。轻轻移动卵巢叶，使其位于各自侧方，以便观察附着区域（图 4A）；这些附着点位于成对肾脏的正腹侧。使用剪刀尽可能靠近肾脏处切除卵巢，避免损伤肾脏（图 4B）。此过程中若卵母细胞泄漏，应取样后冲洗干净。
    注意：摘除卵巢有助于更好地接触雌性蛙的其他组织。
  12. 检查肝脏前叶（也称中叶），注意其通过肠系膜与胃和十二指肠相连（图 3A 和 图 4C）。使用虹膜剪切断肠系膜和肝十二指肠韧带。剩余的肉质组织即为胰腺和胆总管。
  13. 切断胰腺和胆总管与肝脏前叶的连接，保留一定边缘。用有齿镊夹住胃，用组织镊夹住胰腺一端。在放大镜下，轻轻将胰腺从胃上剥离（图 4D）。
    1. 若胰腺未能完整分离，可挑除残留的胰腺组织。或者，使用虹膜剪和组织镊系统性地分离胰腺。
      注意：除胆总管外，该样本中通常还包含部分肠系膜和胰管。
  14. 辨认脾脏，并通过切断其与腹膜的连接进行取样（图 4E）。
  15. 移除并丢弃剩余的肝脏组织。
  16. 移除另一侧肺及与喉部相连的剩余支气管。夹住喉部下端，开始将其从体腔中提起，明显可见的连接组织应逐一剪断。
  17. 当提起喉部时，其与食管的连接将变得明显。使用弯头虹膜剪小心剥离并剪断喉部周围的食管组织（图 5A）。然后将喉部向下拉，从口腔腔隙中剪除。剪断所有明显可见的连接组织。
  18. 注意胃的弯曲形态，以此区别于食管；同时注意幽门狭窄部，以此区分胃与肠道（图 5B）。在胃弯曲部前方立即切断消化道，使其与食管分离。
  19. 张开口腔，辨认咽鼓管在顶部的共同开口16。保持口腔张开，牵拉食管以观察其附着情况（图 5C）。将食管从体腔中提起，沿途剪断明显可见的连接组织。在咽鼓管开口正下方，将食管与口腔腔隙切断。
  20. 夹住胃，在其与十二指肠连接处（即幽门狭窄部）剪断（图 5A,B）。
  21. 拉紧结肠并尽可能靠近泄殖腔处剪断（图 5D）。将肠道拉出，剪断所有明显可见的腹膜附着。
  22. 若为雄性蛙，辨认睾丸，并使用虹膜剪切除其中一个，注意不要损伤下方的肾脏（图 6A）。
  23. 将脂肪体分开，使其位于各自侧方；脂肪体与腹膜连接、覆盖肾脏的区域将变得可见。夹住任一侧脂肪体的基部，用剪刀将其从腹膜上剪下，保留一定边缘（图 6B）。
  24. 辨认并移除膀胱，尽可能靠近泄殖腔处剪断（图 6C）。
  25. 若为雌性蛙或具有明显退化输卵管的个体，夹住输卵管下端，将其从泄殖腔拉开，并尽可能靠近泄殖腔处剪断（图 6D）。将输卵管从体腔中拉出，沿途剪断明显可见的腹膜附着（图 6E）。
  26. 移除并丢弃剩余的脂肪体、睾丸或输卵管。
  27. 用镊子夹住肾脏的下端基部，注意其被透明的腹膜覆盖（腹膜后位）17。在肾脏基部剪开腹膜（图 7A），然后将肾脏从体腔中提起（图 7B），必要时用剪刀剪断腹膜。
  28. 在放大镜下，剪除多余的腹膜以及任何残留的脂肪体、卵巢或睾丸组织。
  29. 观察连接脊柱末端与每条腿的周围神经束，即坐骨神经丛。用镊子夹住神经束，在其离开体腔处剪断（图 7C）。将神经束从体腔中提起，在神经离开椎管处剪断（图 7D）。 
  30. 移除动物身上的固定针，将其翻转至腹面朝下，重新固定四肢。选择一侧后肢进行取样，并将该肢的足部固定。
  31. 从腓肠肌/胫腓骨上方取下一小片杏仁状皮肤（图 8A,B）。
  32. 夹住背部皮肤，横向剪开，使动物中段形成连续的环形切口（图 8C）。
  33. 移除固定针，一手固定四肢，用有齿镊夹住前背部皮肤。用力将背部皮肤向上拉过头部和前肢，完成剥皮（图 8D）。
  34. 重新固定动物并选择一只眼睛。将弯头虹膜剪插入眼眶，沿眼球曲面环绕（图 9A）。根据动物的年龄和成熟度，可能显现出一群黑色素细胞（图 9B）。修剪该组织块，确保无肌肉附着或软骨残留。
  35. 重新固定动物并选择一只眼睛。将弯头虹膜剪插入眼眶，沿眼球曲面环绕（图 9C）。轻轻剪断眼球周围的肌肉附着。
  36. 将剪刀深入眼眶，切断眼球后方的视神经。用剪刀将眼球从眼眶中撬出，并进一步去除任何肌肉附着。

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结果

通过遵循本方案的所有步骤，可在动物安乐死后一小时内完整切除心脏心室、动脉干、左肝叶、胆囊、肺、胰腺、脾脏、喉、食管、胃、肠、睾丸、脂肪体、输卵管、成对的肾脏、坐骨神经丛、皮肤、胸腺以及完整眼球（参见 图1, 图2, 图3, 图4, 图5, 图6, 图7, 图8，以及 图9在...

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讨论

本文提供的实验方案旨在为不同经验水平的使用者提供灵活性，同时确保及时高效地收集关键组织。建议新用户严格按照方案中列出的每一步操作，以系统性地完成组织采集。然而，经验较丰富的用户可根据需要选择跳过某些步骤，仅取样所需组织。例如，脾脏位于肠系膜后方，通过简单移动胃部即可暴露脾脏，无需取样胰腺。这种适应性使得取样过程可根据特定研究需求进行定制。尽管不同器官的组织降解速率和代谢活性各不相同，但快速操作并使用预冷缓冲液可最大程度减少对最终样本的影响。

本方案设计高效，可在一小时内完成多达18种组织的采集。该方法的一个局限性在于，针对特定应用可能需要进一步优化技术。例如，用户可选择将肠系膜与肠道分开取样18，或将肾上腺与肾脏独立采集。此外，胃肠道器官可进行更仔细的冲洗，以保持其完整性19。这些调整可提高数据的准确性和完整性，特别是在处理高度特化的组织时。

该方法还被开发为可与快速灌注13兼容，这对...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）OD R24 资助项目 ODO31956 资助。我们还要感谢 Samantha Jalbert 和 Jill Ralston 提供的帮助与支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBS Corning21-040-CV
带LED灯和支架的5倍放大镜amazon.comB08QJ6J8P1光源不得产生热量
一次性移液管VWR414004-036
解剖用尖头镊子Fisher Scientific08-875
解剖剪，锐利尖端，直型，6.5"VWR76457-374
解剖托盘Fisher Scientific14-370-284泡沫聚苯乙烯板可作为可接受的替代品
安乐死容器US Plastic Item 2860其他不透明容器亦可接受
安乐死容器盖US Plastic Item 3047
虹膜切除剪，6"VWR470018-938虹膜剪可作为可接受的替代品
MS-222：Syncaine（曾用名 tricaine）Pentair AESTRS1
大齿组织镊，5.5 英寸，不锈钢Fisher ScientificS08100
碳酸氢钠粉末，USP级Fisher Scientific18-606-333
带齿镊（标本镊）VWR82027-442
解剖用T型针Fisher ScinetificS99385

参考文献

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