对成年非洲爪蟾可接近的组织进行综合采样的有效技术

Summary

这是全面的 Xenopus 采样协议的第一部分。取样的组织包括心室、动脉干、左肝叶、胆囊、肺、胰腺、脾脏、喉、食道、胃、肠、睾丸、脂肪体、输卵管、成对肾脏、坐骨神经丛、皮肤、胸腺和全眼。

Abstract

非洲爪蟾长期以来一直是研究脊椎动物发育和疾病的关键模式生物，为细胞过程和基因功能提供了深入的见解。尽管关于胚胎非洲爪蟾的信息丰富，但成人组织采样的标准化方法仍然存在重大差距，尤其是定量蛋白质组学等现代方法。本研究介绍了一种全面的方案，用于快速、精确和高效地对成年非洲爪蟾的多个组织进行采样。该协议解决了与其他 anurans 相比细微解剖差异相关的挑战，即使对于青蛙解剖经验有限的人也能确保可重复性。该方案通过优先考虑样品新鲜度，针对高质量生化分析进行了优化。我们可在一小时内快速收集多达 18 个组织。此外，这些方法适用于灌注和未灌注的条件，为一系列实验需求提供了灵活性。这项工作不仅填补了非洲爪蟾和热带非洲爪蟾的关键方法学空白，而且还为研究人员将技术应用于类似的两栖动物模型提供了宝贵的资源，从而提高了比较生物学和进化研究的范围和可靠性。

Introduction

非洲爪蟾 在研究人类疾病方面比小鼠、斑马鱼和其他模式生物具有独特的优势，特别是在发育和进化背景下。其外部胚胎发育和大型、易于作的胚胎能够进行实时观察和实验干预（例如，组织移植、基因编辑），这在小鼠中具有挑战性，这些小鼠在内部发育并需要侵入性手术。此外， 非洲爪蟾的三腔心脏和四足肢体为研究先天性缺陷¹、肢体再生² 和心脏发育³ 提供了更直接的进化桥梁。与小鼠不同， 非洲爪蟾 蝌蚪可以再生四肢和器官，模拟哺乳动物中不存在的再生过程，而它们的水生生活阶段允许对环境或毒素影响进行非侵入性研究。非洲 爪蟾 结合更快的育种、更低的成本和更少的伦理限制，非常适合对难以在哺乳动物系统中复制的器官发生和应激反应进行高通量、机制研究。

本文旨在为非洲爪蟾成年组织的精确和可重复的器官取样提供明确的指导，就像非洲爪蟾蝌⁴ 一样。虽然可以使用成年非洲爪蟾的“数字解剖”⁵ 和“显微 CT 成像”⁶，但如果没有为其他成年模型（如小鼠....

Protocol

所有实验均经哈佛医学院 IACUC（机构动物护理和使用委员会 IS 00001365_3）的规则和规定批准并按照其进行。如果在采样前遵循灌注方案¹³ ，请跳至步骤 2.3。

1. 制备（无灌注）

1. 确保研究机构已批准本协议中描述的安乐死技术。
2. 制备 5 g/L MS-222（甲磺酸三卡因）和 5 g/L 碳酸氢钠的溶液（参见 材料表）。检查 pH 值以确保其为 ≥7。
   注意：体积必须大于完全覆盖被安乐死动物所需的体积。
3. 通过将非洲 爪蟾 置于 MS-222 溶液中（从步骤 1.2 开始）进行初级安乐死，将动物浸没总共 1 小时¹⁴。
4. 将解剖表面（托盘或泡沫片）倾斜放置在辅助容器内，或以其他方式安排解剖表面以促进血液引流。
5. 一旦青蛙在溶液中放置 1 小时，初级安乐死就完成了。移开青蛙并通过捏脚来检查疼痛反应的丧失。
6. 记录被采样动物的年龄（如果已知）、性别和健康状况，以及是否接受过灌注。在采样前称量 非洲爪蟾 并进行所需的任何其他测量。
7. 将青蛙仰卧并固定靠近身体的前肢（

Results

通过遵循本协议的所有步骤，心室、动脉干、左肝叶、胆囊、肺、胰腺、脾脏、喉、食道、胃、肠、睾丸、脂肪体、输卵管、成对肾脏、坐骨神经丛、皮肤、胸腺和整个眼睛在安乐死后一小时内净切除（见图 1、图 2、图 3、图 4、图 5、图 6、 图 7、图 8 和图 9）。在此期间，对样品.......

Discussion

此处介绍的方案旨在为不同经验水平的用户提供灵活性，同时确保及时有效地收集必需组织。建议新用户按照协议中的每个步骤进行作，以确保系统地收集组织。然而，更有经验的用户可能会选择跳过某些步骤，只对他们需要的组织进行采样。例如，只需移动胃，即可在不对胰腺进行取样的情况下进入位于肠系膜后面的脾脏。这种适应性允许根据特定的研究需求定制采样过程。虽然组织降解速率和代谢活性是器官特异性的，但快速工作并使用冷冻缓冲液应最大限度地减少对所得样品的影响。

该方案旨在提高效率，可在一小时内收集多达 18 个组织。该方法的局限性是，对于特定应用，可能需要进一步改进技术。例如，用户可以选择与肠道分开对肠系膜进行采样¹⁸ 或独立于肾脏收集肾上腺。此外，可以格外小心地冲洗胃肠道器官以保持其完整性¹⁹。这些调整可以提高数据的准确性和完整性，尤其是在处理高度专业化的组织时。

该方法还被开发为与快速灌注.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	康宁	21-040-CV
5 倍放大镜，带 LED 灯和支架	amazon.com	B08QJ6J8P1	灯不得产生热量
一次性转移移液器	VWR	414004-036
解剖细尖镊	Fisher Scientific	08-875
解剖剪刀锋利的 piont，直的 6.5 英寸	VWR	76457-374
解剖托盘	Fisher Scientific	14-370-284	聚苯乙烯泡沫塑料板是可接受的替代品
安乐死容器	美国塑料	项目 2860	可接受的替代不透明容器
安乐死容器盖	美国塑料	项目 3047
虹膜切除剪刀 6"	VWR	470018-938	虹膜剪刀是可接受的替代品
MS-222：Syncaine（以前称为三卡因）	Pentair AES	TRS1
大鼠牙齿组织镊子 5.5 英寸，不锈钢	Fisher Scientific	S08100
碳酸氢钠，粉末，USP	Fisher Scientific	18-606-333
标本镊子，锯齿状	VWR	82027-442
T 型销，用于解剖	Fisher Scinetific	S99385