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在青少年和成年小鼠中给予Δ9-四氢大麻酚（THC）

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DOI：

10.3791/68358

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2025年8月1日

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1Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine, 2Department of Biological Chemistry, University of California, Irvine, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University of California, Irvine

本文内容

摘要

Δ9-四氢大麻酚（THC）是大麻中的致醉成分，在美国属于管制物质。本文概述了获取、储存和向小鼠施用THC的标准操作流程，以符合现行法律法规，并简要介绍了一种评估THC在啮齿类动物中基本药效动力学作用的方法。

摘要

Δ9-四氢大麻酚（THC）是导致大麻及大麻衍生产品产生精神活性（精神作用）效应的主要成分，这些产品目前在合法与非法市场上均有流通。THC的精神作用效应是通过激活大脑中的CB1大麻素受体而产生的，这些受体通常由内源性大麻素（内源性大麻素物质）激活。在大脑以外，THC通过激活CB1和CB2受体参与调控多种生理过程。内源性大麻素物质与大麻素受体共同构成内源性大麻素系统，其在生命周期中所发挥的生理功能存在显著变化，其中青春期是该信号复合体作用尤为敏感的阶段。本文介绍了一种用于制备THC以进行胃肠外给药，并评估其在两个发育阶段（青春期和成年早期）的雌雄小鼠中急性药效动力学效应的实验方案。本方案聚焦于文献中广泛使用的三个剂量（1、5和10 mg/kg），采用腹腔注射途径，展示THC已知的药理效应，包括僵直诱导、运动活动抑制以及痛觉抑制。此外，鉴于THC在美国属于受控物质，本文还简要概述了在现行法律法规下获取和储存THC所需遵循的程序。

引言

近几十年来，美国成年人群中大麻使用的流行率持续上升，并在2023年保持在较高水平。在19至30岁的成年人中，约有42%的人报告在过去一年内使用过大麻，29%的人在过去一个月内使用过，10%的人报告每日或接近每日使用（在过去30天内使用20次或以上）1。在35至50岁的成年人中，相应比例分别为29%、19%和8%。尽管这些估计值与2022年获得的数据在统计学上无显著差异，但表明这两个年龄组在过去5年和10年中均呈上升趋势1。重要的是，现有证据表明，约有9%的大麻使用者会对该药物产生耐受性和依赖性——这种状况被称为大麻使用障碍（SUD）2，并可能构成健康隐患3。

与其他精神活性药物一样，大麻的使用通常始于青少年早期，并在青春期期间逐渐增加。2023年，8%的8th 美国10年级学生中，18%th 评分者，以及12年级中29%的th 评分者报告至少使用过该药物一次4尽管过去几年相对稳定，甚至在风险感知降低的情况下5,6，这些数字仍然过高。除了被广泛用于非医疗目的外，大麻在多种医学病症中也显示出治疗潜力7,8. 其致醉成分（精神活性物质）Δ的合成形式9四氢大麻酚（THC）(图1），作为处方药已使用超过40年，用于治疗接受化疗的艾滋病和癌症患者的恶心及食欲减退9,10。四氢大麻酚（THC）及其类似物大麻二酚（CBD）（图1），其无精神活性，已证实可用于疼痛、炎症及多种神经系统疾病的治疗11,12因此，医用大麻衍生产品（例如用于儿童癫痫和自闭症的治疗）的迅速普及，也使得更多年轻群体开始接触此类药物。在当前社会背景下，立法变化与公众接受度的提升进一步助长了相关经济利益，可能凌驾于公共健康与安全关切之上，这一趋势尤其令人担忧13.

含有THC的大麻（“ marijuana ”）以多种形式被摄入，包括吸食、汽化、食用制剂、酊剂和油剂。摄入后，THC会分布至全身并进入大脑，在大脑中产生欣快感、放松感、感官知觉改变以及食欲增加，尽管在某些个体中也可能引发焦虑和偏执症状14,15。THC通过激活位于脑内和脑外的两类大麻素（CB）受体，与内源性大麻素（ECB）系统相互作用15,16。在CB1受体最丰富的脑区，其激活会影响情绪、痛觉感知、食欲和认知等多种功能。THC还可激活外周器官中的CB1和CB2受体，从而影响全身能量代谢——包括营养物质的摄入、吸收和储存——以及疼痛发生、炎症和免疫反应17,18。

THC 具有急性和持续性效应，仍需进一步开展关于大麻使用长期后果的临床前和临床研究。应特别关注高剂量 THC 可能引发的不良反应，因为在美国销售的大麻中，THC 的平均浓度在过去几十年中已从 2008 年的 8.9% 上升至 2017 年的 17.1%19，近年来甚至更高。“高 potency 大麻产品”（即含有高浓度 THC 的产品）在美国许多合法市场中十分常见，其中大麻花的平均 THC 含量为 20–35%，某些提取物产品的 THC 含量甚至高达 90%。在如此高的剂量下，THC 的效应可能在性质上不同于 20 世纪 70 年代和 80 年代使用的传统“低 potency 大麻”所产生的效应，后者所含 THC 为 6% 或更低20。因此，了解高 potency 大麻产品的药理学特性对于制定预防策略以及指导监管和财政政策至关重要。此外，了解年龄、遗传因素和已有疾病等变量如何影响个体对 THC 的反应，有助于针对特定人群定制预防和治疗方案。尤其需要进一步研究青少年以及妊娠期或哺乳期妇女使用大麻的后果，因为在产前/围产期和青春期等内源性大麻素（ECB）系统发挥关键神经发育作用的阶段暴露于大麻素，可能导致持续性的负面后果21。同时，还需开展更多研究以明确 THC 与其他药物或物质之间的相互作用。有关 THC 安全性和有效性的综合数据可为监管决策和公共卫生政策提供依据，确保其在医疗和非医疗情境下的安全使用。

本文概述了在实验室环境中获取、储存和使用四氢大麻酚（THC）的标准操作流程，符合当前美国立法（1971年《管制物质法案》）的要求。本方案重点关注科学文献中广泛使用的三种THC剂量（1、5和10 mg/kg）22，并采用腹腔内（i.p.）给药途径，展示了THC的三种经典效应：僵直状态的诱导、运动活动的抑制以及镇痛作用。该实验方案也可用于多次THC注射后研究长期使用THC的影响，长期使用可导致耐受性以及一系列心理健康后果，而这些后果在人类急性给药时通常不会出现。

方案

所有实验程序均经加州大学欧文分校动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物照护与使用的指南进行。

1. 获取和储存THC的操作步骤

注意：在美国，于学术研究环境中使用四氢大麻酚（THC）需遵循大麻法律地位所规定的多个步骤。大麻及源自大麻的四氢大麻酚均被列为一级管制物质。因此，在购买大麻或四氢大麻酚之前，研究人员必须从美国药品执法局（DEA）获得许可。以下提供了该流程的概述，该流程可能需要长达6个月或更长时间。

  1. 确定研究范围：明确研究过程的目的和目标，并说明使用THC的必要性。制定详细的研究方案，包括所需THC的用量、商业来源，以及其处理和储存方式。尽可能提供所有相关细节。
  2. 获得机构监管批准：将研究提案提交至所在机构的动物护理与使用委员会（IACUC）（用于临床前研究）或机构审查委员会（IRB）（用于临床研究）。该审查步骤旨在保护研究对象的权利，并确保研究符合伦理标准。
  3. 遵守州级法规：注意各州关于大麻研究的具体法规，因其可能存在显著差异。例如，在加利福尼亚州，需获得加州研究咨询小组（RAPC）的批准23。
  4. 获取THC：从为此目的获得许可的种植者或制造商处购买大麻和THC。
    注意：经批准的种植者名单可在美国缉毒局（DEA）网站上查询。美国国家药物滥用研究所（NIDA）通过其药物供应计划提供THC24。申请该计划时，需提供机构信息、详细的研究方案，以及机构监管文件（如IACUC或IRB批准函）。购买或转移一类管制物质时，必须填写DEA表格222，该表格为每项DEA注册号专用的单页表格。
  5. 接收和储存THC
    1. 将THC储存在符合美国缉毒局（DEA）批准设计的安全锁柜或保险库中。研究区域的出入应受到控制（例如，建筑物和/或实验室的门应上锁）。仅允许授权人员接触THC。
    2. 制定并维护一份可接触THC的人员名单，并保持名单更新。THC容器应清晰标注名称、浓度、接收日期及危险警示。
    3. 遵循既定的处置程序，该程序要求进行特定记录，并遵守联邦和州的法规。THC应保存在-20 °C或更低温度下。
  6. 库存管理：
    1. 建立完善的库存管理系统，用于追踪THC的数量、使用情况和存放位置。准备一个管制物质档案夹，其中应包含一类物质许可证、授权人员信息、所有收货记录、处置记录以及任何物质使用记录（图2）。
    2. 定期对库存和储存实践进行审计，完成每半年一次的库存日志，以确保符合监管要求。定期检查出入记录和库存记录。
  7. 培训与规程：应对所有操作THC的人员提供培训。应制定明确的储存、操作和处置该药物的规程。
    注意：通过实施这些措施，学术实验室可确保其符合法律要求，并维持安全的研究环境。

2. 通过腹腔注射向小鼠给予THC的操作步骤

注意：操作THC时，必须控制温度并避免光照以保持其稳定性。THC对热敏感，长期储存时应保存在-20 °C或更低温度下。短期储存时，THC可在室温下保存，或在4 °C冰箱中保存数小时。THC也对紫外光（UV）和可见光敏感，光照可能通过氧化反应导致其降解。为防止降解，THC应储存在密封的棕色玻璃容器中，或用铝箔包裹的透明容器中，并置于避光环境中。建议对所有样品标注日期和储存条件，以确保正确追踪和稳定性。

  1. 材料
    1. 使用超纯水和分析纯试剂配制所有溶液。THC 可从 Cayman Chemical（Ann Arbor, MI）或 RTI International（Research Triangle Park, NC）购买，或通过 NIDA 药物供应项目获得24。
  2. 仪器与耗材
    1. 开始实验前，请确保材料表中列出的所有物品均已备妥。
      ​注意：处理 THC 时必须使用玻璃瓶（8 mL 或类似规格）和容器。塑料可能与疏水性分子（如 THC）发生反应或将其吸收，从而导致样品损失或浓度不一致。玻璃具有化学稳定性且不具反应性，有助于防止与疏水性分子发生不必要的相互作用。
  3. 小鼠 THC 给药操作步骤
    1. 从冰箱中的安全锁柜中取出 THC 容器。
    2. 保持容器处于冰上，使用移液器吸取适量体积的 THC，并小心地将其加入 8 mL 玻璃瓶底部。根据剂量（mg/kg）和小鼠体重（g）计算所需体积。
    3. 将玻璃瓶转移至化学通风橱中，用温和的氮气流轻轻吹干溶剂。注意避免将含 THC 的溶液溅到瓶壁上，否则会造成严重损失。此过程大约需要 5–10 分钟。
    4. 在管制药品记录本的管制药品使用日志中记录从当前使用的玻璃瓶中取用的 THC 量。
    5. 当溶剂完全干燥后，加入适量的 Tween-80。该体积应确保最终盐水中 Tween-80 的浓度为 5%，具体参见步骤 2.3.8。
    6. 将玻璃瓶置于盛有热水的烧杯中加热，水温不超过 60 °C。涡旋振荡玻璃瓶以充分溶解 THC，并根据需要重复操作。
    7. 逐步以小增量加入无菌生理盐水：例如 200 µL、300 µL、500 µL 和 1 mL。每次加入后进行涡旋混合并加热。
    8. 重复步骤 2.3.6 和 2.3.7，直至加入所需总量的生理盐水，形成最终含 5% Tween-80 和 95% 生理盐水的 THC 溶液，并确保溶液完全溶解。
    9. （可选）将玻璃瓶置于超声水浴中，设置功率约为 100%，频率 40 kHz，温度 37 °C，超声处理 5 分钟。确认溶液澄清且无未溶解物质。液体颜色可能因所用溶剂不同而有所变化。
    10. 称量小鼠体重并确定合适的注射剂量。每只小鼠的注射体积应为 10 mL/kg。
    11. 进行腹腔内（i.p.）注射。确保 THC 溶液在使用当天新鲜配制。

3. 评估四氢大麻酚药理作用的实验步骤

  1. 动物
    1. 本研究应使用两种性别的小鼠。
      注意：本研究使用了来自杰克逊实验室（Jackson Laboratories，Farmington，CT）的两种性别的 C57BL/6J 小鼠，分别为青春期小鼠（出生后第 30–35 天，PND 30–35）和成年小鼠（出生后第 70–75 天，PND 70–75）。
      ​该方法适用于其他小鼠品系。
    2. 将小鼠饲养在通风笼具中（每笼4-5只），自由摄取食物和饮水。根据年龄和体重匹配动物，随机分配至不同处理组，并在实验前至少适应环境1周。
    3. 保持饲养室在12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为6:30）条件下，温度恒定（20 ± 2 °C），相对湿度为55%–60%。
  2. 实验组
    1. 将每个年龄和性别组分为四个处理组：一个溶剂对照组和三个THC处理组，剂量分别为1、5和10 mg/kg。
  3. 药物给药
    1. 按照上述方法，用95%生理盐水加5%吐温-80作为溶剂新鲜配制THC，并通过腹腔注射给药。
  4. 行为学测试
    注意：在此示例中，每只动物均接受下述测试，以追踪THC的作用效果22三项行为学测试在同一批动物上连续进行。测试顺序为：运动活性测试（THC给药后30分钟）、僵直测试（THC给药后45分钟）和尾浸测试（THC给药后60、180和300分钟）。图3）。对于青春期雌性动物实验，我们重复使用了相同的溶剂对照组，并对同一批动物分别给予1 mg/kg或10 mg/kg的THC，以进行僵直行为测试和尾浸测试。该策略使我们能够在遵循伦理准则、尽量减少动物使用数量的同时，达到足够的统计学效力。行为数据采用摄像机记录，视频文件通过行为追踪软件进行分析。
    1. 僵直症测试
      注意：小鼠的僵住症是一种（病理）生理状态，其特征为缺乏自主运动、姿势僵硬以及对外界诱发的身体位置改变具有抵抗性。它被认为是四氢大麻酚（THC）的四种标准效应之一，其他三种分别为运动抑制、镇痛作用和体温降低。在本示例中，僵住行为的评估基于既定的实验程序。22，如下所述：
      1. 设置：准备一根水平横杆（长7 cm），将其置于洁净实验台面上方4 cm处，环境光照为正常室内光照（160 lux）。在附近放置一个已准备就绪的电子计时器。
      2. 将小鼠从饲养室转移至测试实验室，在测试前让其在笼内适应环境60分钟。操作时应穿着洁净的实验服，且不得使用香水。
      3. 戴上洁净的乳胶手套，轻轻将小鼠从笼中取出，安全地给予适量的THC或溶剂对照物，然后将其放回笼中。
      4. 在THC注射后适当时间（本实验为45分钟），将小鼠从笼中取出，并轻轻将其前爪放在水平杆上。
      5. 使用电子计时器记录不动时间。
        注意：不动时间定义为将小鼠放置于横杆上至其抬起一只或两只前爪所经过的时间。
      6. 当小鼠将一只或两只前爪离开横杆，或达到10秒的截止时间时，停止计时。
      7. 每只小鼠重复测试两次，两次试验之间休息 2 min。
      8. 使用两次静止时间的平均值进行最终数据分析。
      9. 结局指标：以静止时间（秒）作为强直状态的指标。
    2. 旷场实验（新环境中的运动活动）
      注意：THC诱导的运动减退通过敞箱实验并依据既定方案进行评估25.
      1. 设置：本实验使用配备视频追踪设备的敞箱实验装置。确保敞箱实验装置清洁，无先前实验留下的气味线索。
        注意：可使用本文件中所述的市售产品进行有效清洁 材料表.
      2. 将小鼠从饲养室转移至测试实验室，在开始实验前让其在笼内适应环境60分钟。确保测试房间的光照强度较低（10 lux）。25穿戴洁净的实验服，禁止使用香水。
      3. 戴上洁净手套，轻轻将小鼠从笼中取出，安全地给予适量的THC或溶剂对照物，然后将小鼠放回笼中。
      4. 在THC注射后适当时间（本实验为30分钟），将小鼠轻柔地放置于旷场中央，注意尽量减少操作带来的应激。
      5. 使用摄像机和行为追踪软件记录10分钟的实验会话。
      6. 测试结束后，将小鼠放回其原居住笼，并使用上述清洗液彻底清洁实验区域。
      7. 结果测量指标：以总移动距离（单位：米）作为主要参数，用于量化运动活动。
    3. 尾浸试验（伤害性感受阈值，又称热水尾撤回试验）
      注意：疼痛感知通过尾浸试验进行评估，方法如前所述26该实验用于评估潜在镇痛药物的有效性以及对药物作用的耐受性。实验过程中，将热刺激施加于小鼠尾部以诱发疼痛，记录小鼠尾部从热源撤回所需的时间。
      1. 设置：在正常环境光照（160 勒克斯）下准备一个保持在 54 °C 的水浴。在附近放置一个可随时使用的电子计时器。
      2. 使用宠物训练垫（Glad）制作的柔软组织袋轻轻固定小鼠，确保尾巴保持可接触状态。
      3. 将尾部远端三分之一浸入水浴中，同时启动计时器。
      4. 记录尾部回缩的潜伏期（单位：秒），定义为尾部的反射性抽动。
      5. 设定最长截止时间为10秒，以防止组织损伤和不适。
      6. 每只小鼠在每个时间点（本实验中为注射THC后60、180和300分钟）重复测量两次，每次试验间隔5分钟。
      7. 将两次潜伏期测量值取平均用于数据分析。
      8. 结果测量：以秒为单位计算甩尾潜伏期，作为主要结局变量，用于评估镇痛效果。
  5. 统计分析
    1. 以均值 ± 标准误（SEM）表示结果。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Šídák多重比较检验，或三因素方差分析（three-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验来确定显著性差异。若满足以下条件，则认为差异具有统计学意义： P < 0.05.
      注意：使用 GraphPad Prism 10.4 版本进行分析。

结果

为了说明上述方案，我们展示了THC急性药理作用的实验结果。将四组小鼠（每组8只），即青春期雄性、成年雄性、青春期雌性和成年雌性，分别给予三种剂量的THC（1、5和10 mg/kg），同时以溶剂作为对照。随后评估僵直症、运动活动和痛觉反应，重点关注效应的剂量依赖性以及性别和年龄间的差异。

首先，在急性僵直效应方面，THC 在青春期和成年雄性小鼠中均产生了剂量依赖性的僵直反应（图4A 和 表1）。反应持续时间具有剂量依赖性（P<0.0001，双因素方差分析），其中 5 和 10 mg/kg 剂量在两个年龄组中均产生统计学显著效应，与各自对照组相比差异显著（P < 0.0001，Šídák 多重比较检验）。在 10 mg/kg 剂量下，THC 在青春期和成年雌性小鼠中也均诱导出僵直反应（图4B 和 表2），但成年雌性小鼠的反应程度较青春期雌性小鼠明显减弱（P < 0.0001，Šídák 多重比较检验）。进一步分析数据以确定性别是否影响 THC 诱导的僵直反应。与雄性相比，青春期雌性小鼠表现出轻微但显著的性二态性反应（P = 0.0204）（图4C 和 表3）。在成年小鼠中，性别的影响更为显著，成年雌性小鼠对 THC 僵直效应的敏感性明显低于成年雄性小鼠（P < 0.0001）（图4D 和 表4）。

其次，对于急性运动效应，THC 降低了雄性小鼠的运动活性（图 5A 和 表5）。这种效应具有THC剂量和动物年龄依赖性（P < 0.0001 和 P = 0.0042），表明与成年小鼠相比，青少年小鼠对THC的作用更为敏感。事后多重比较检验显示，在5 mg/kg THC剂量下，青少年小鼠的活动量显著低于成年小鼠（P < 0.0001）。THC 也降低了雌性小鼠的运动活动性图5B 和 表6). 双因素方差分析显示，剂量和年龄在雌性小鼠中也具有显著效应（P < 0.0001 和 P = 0.0103，分别）（图 5B 和 表6）。然而，事后多重比较检验并未显示在0 mg/kg或10 mg/kg THC剂量下，青春期与成年雌性小鼠之间存在统计学上的显著差异（图5B）。这些数据集进一步用于分析性别是否影响THC诱导的运动减退。在青春期小鼠中未观察到性别二态性。图5C 和 表7）；然而，成年小鼠表现出具有统计学意义的性二态性（P = 0.0046），成年雌性小鼠的活动量显著高于成年雄性小鼠。然而，事后多重比较检验并未显示在0或10 mg/kg THC剂量下，两性之间存在具有统计学意义的差异（图5D 和 表8).

第三，关于急性镇痛作用，THC 减轻了雄性小鼠的尾浸痛觉反应（青少年小鼠，图 6A 和 表 9；成年小鼠，图 6C 和 表 11）。在青少年雄性小鼠中，THC 在 5 和 10 mg/kg 剂量下均产生显著的镇痛效应，给药后 60、180 和 360 分钟检测结果均显示差异显著（与溶剂对照组小鼠的甩尾潜伏期相比，Šídák 多重比较检验，P < 0.0001）（图 6A 和 表 9）。双因素方差分析（Two-way ANOVA）证实 THC 剂量对甩尾潜伏期具有显著影响（P < 0.0001），并显示镇痛效应随时间呈下降趋势，尤其在最高剂量下更为明显（P = 0.0133）（图 6A 和 表 9）。在青少年雌性小鼠中观察到类似的 THC 剂量依赖性效应，但未观察到时间因素的显著影响（P < 0.0001 和 P = 0.9923）（图 6B 和 表 10）。在成年雄性小鼠中，THC 仅在最高剂量（10 mg/kg）和最早时间点（给药后 60 分钟）产生显著镇痛效应（与溶剂对照组相比，Šídák 多重比较检验，P < 0.0001）（图 6C 和 表 11）。双因素方差分析显示剂量和时间因素均具有显著影响（剂量，P < 0.0001；时间，P = 0.0007）（表 11）。在成年雌性小鼠中，仅在最高剂量（10 mg/kg）和最早时间点（给药后 60 分钟）观察到显著的镇痛效应（与溶剂对照组相比，Šídák 多重比较检验，P < 0.0012）（图 6D 和 表 12）。关于年龄和性别对 THC 诱导镇痛作用的影响，双因素方差分析显示，THC 对甩尾潜伏期的作用受到年龄和性别的共同影响（图 6E、F，表 13 和 表 14）。在给药后 60 分钟，青少年雄性小鼠表现出最强的效应，尽管在此时间点，所有四组小鼠与相应的溶剂对照组相比均显示出显著的 THC 诱导镇痛作用（图 6E）。有趣的是，在给药后 60 分钟时间点，青少年小鼠中观察到性别因素的显著影响，而成年小鼠中则未观察到（青少年，P = 0.0083；成年，P = 0.9919，Šídák 多重比较检验）（图 6E 和 表 13）。在给药后 300 分钟时间点，仅在青少年小鼠（无论雄性或雌性）中观察到显著的镇痛效应，而成年小鼠中未观察到（图 6F 和 表 14）。三因素方差分析（Three-way ANOVA）同时检验了剂量、年龄和性别三个变量，结果显示时间和剂量均具有显著影响（P = 0.0007 和 P < 0.0001），且时间和剂量之间存在显著交互作用（P = 0.0022）（表 15）。

显示大麻素中THC与CBD化学结构差异的分子结构图。
图1植物大麻素THC和CBD，以及内源性大麻素anandamide和2-AG的化学结构。 Δ-9-四氢大麻酚（THC）在雌性大麻植物的花序中产生，是其精神活性作用的主要成分；THC通过与G蛋白偶联的CB受体结合发挥作用1 和 CB2 大脑和身体其他组织中的受体。大麻二酚（CBD）是一种非精神活性的大麻素，具有抗癫痫作用，可能还具有抗精神病和抗炎特性。两种主要的内源性CB受体激活剂为花生酰胺（anandamide）和2-花生四烯酰甘油（2-arachidonoyl-sn-甘油（2-AG）是脑和外周组织中的脂质衍生信使，可按需合成，参与多种短程信号传导过程，例如精细调控中枢神经系统中的突触可塑性。 请点击此处以查看此图的放大版本。

受控物质使用记录表，包含日期、用量、人员、签名。
图 2：一类受控物质使用记录表示例。 任何对四氢大麻酚（THC）的使用均应记录在临时的一类受控物质使用日志中，该日志保存于锁闭的柜子或安全的办公区域内的一类受控物质专用文件夹中。该表格应包括必须注册取得一类许可证的主要研究人员姓名及其所属单位、受管制药品的详细信息及确切批次、实验方案编号、经授权使用该药品的人员姓名、每次使用的用量及剩余量。 请点击此处查看此图的放大版本。

THC作用的实验时间线示意图；阶段包括：旷场实验、强直性僵直、尾巴浸入实验。
图3：行为学测试实验顺序的示意图。各项实验的顺序为：运动活性检测（THC给药后30分钟）、强直性僵直检测（THC给药后45分钟）和尾巴浸入检测（THC给药后60、180和300分钟）。请点击此处查看该图的放大版本。

雄性和雌性小鼠在青少年期和成年期的行为学研究中的僵直剂量反应曲线
图4小鼠中THC诱导的急性强直症 THC 会导致青少年和成年个体出现僵直症状A）雄性和（B）雌性小鼠。通过腹腔注射指定剂量的THC后，采用栏杆实验评估其反应。同一数据集用于分析性别对THC诱导僵直效应的影响，在（C青少年和（D)成年雄性和雌性小鼠。结果以均值±标准误表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行显著性检验，随后进行Šídák多重比较检验。当P < 0.05时认为差异具有统计学意义。 < 0.05. ****P < 0.0001，与溶剂对照组相比， ##P < 0.01，以及 ####P < 0.0001，与图示青少年10 mg/kg组相比 B 或雄性10 mg/kg组在各图中 C 和 D. 请点击此处以查看此图的放大版本。

小鼠行为反应；柱状图；总移动距离与剂量关系；青少年期与成年期比较。
图5：小鼠中THC诱导的急性低活动性。 THC在青少年期和成年期的（A）雄性与（B）雌性小鼠中均降低了自发性运动活动。通过腹腔注射指定剂量的THC后，采用旷场实验评估反应。同一数据集用于分析性别对THC诱导低活动性的影响，分别在（C）青少年期和（D）成年期的雄性和雌性小鼠中进行。结果以均值±标准误表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）后接Šídák多重比较检验确定显著性。当P < 0.05时认为差异具有统计学意义。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001，与溶剂对照组比较；####P < 0.0001，与图A中青少年期5 mg/kg组比较。请点击此处查看该图的放大版本。

尾部回缩潜伏期曲线，THC剂量对青少年/成年小鼠、雄性/雌性随时间变化的比较。
图6：THC诱导的小鼠急性镇痛作用。 通过尾部浸入实验检测THC的急性抗伤害效应，在给予指定剂量THC腹腔注射后60、180或300分钟，分别测定（A）青少年雄性、（B）青少年雌性、（C）成年雄性、（D）成年雌性小鼠的反应。同一数据集用于分析年龄和性别对THC诱导抗伤害作用的影响，分别在THC给药后（E）60分钟或（F）300分钟进行。结果以均值±标准误表示。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）并结合Šídák多重比较检验确定显著性差异。当P < 0.05时认为差异具有统计学意义。*P < 0.05，***P < 0.001，****P < 0.0001，与溶剂对照组相比；##P < 0.01，比较10 mg/kg剂量组的青少年雄性与青少年雌性组；@P < 0.05 和 @@P < 0.01，分别与10 mg/kg剂量组的成年雄性和成年雌性组相比。 请点击此处查看该图的高清版本。

表1：THC对青春期和成年雄性小鼠产生僵直症的急性效应的双因素方差分析（参见图4A）（每组 n = 7-8）。 请点击此处下载该表格。

表2：THC对青春期和成年雌性小鼠产生僵直症急性作用的双向方差分析（与图4B相关）（每组 n = 5–8）。 请点击此处下载该表格。

表3：THC对青春期雄性和雌性小鼠产生僵直症的急性效应的双向ANOVA分析（与图4C相关）（每组 n = 5-8）。 请点击此处下载该表格。

表4：THC对成年雄性和雌性小鼠产生僵直症的急性作用的双向方差分析（与图4D相关）（每组 n = 7-10）。 请点击此处下载该表格。

表5：THC对青春期和成年雄性小鼠运动功能急性影响的双因素方差分析（与图5A相关）（每组 n = 7–9）。 请点击此处下载该表格。

表6：THC对青春期和成年雌性小鼠运动功能急性影响的双因素方差分析（与图5B相关）（每组 n = 5–8）。 请点击此处下载该表格。

表7：THC对青春期雄性和雌性小鼠运动功能急性影响的双因素方差分析（与图5C相关）（每组 n = 5–8）。 请点击此处下载该表格。

表8：四氢大麻酚对成年雄性和雌性小鼠运动功能急性影响的双因素方差分析（与图5D相关）（每组 n = 7–9）。 请点击此处下载该表格。

表9：青少年雄性小鼠中THC急性镇痛作用的双因素方差分析（与图6A相关）（每组 n = 7-8）。 请点击此处下载该表格。

表10：THC对青春期雌性小鼠急性镇痛作用的双因素方差分析（与图6B相关）（每组 n = 5-8）。 请点击此处下载该表格。

表11：四氢大麻酚对成年雄性小鼠急性镇痛作用的双因素方差分析（与图6C相关）（每组 n = 6-8）。 请点击此处下载该表格。

表12：四氢大麻酚（THC）对成年雌性小鼠急性镇痛作用的双向方差分析（与图6D相关）（每组 n = 7–8）。 请点击此处下载该表格。

表13：对青春期和成年、雄性和雌性小鼠注射10 mg/kg THC后60分钟时的急性镇痛效果进行双因素方差分析（与图6E相关）（每组 n = 5–8）。 请点击此处下载该表格。

表14：对青少年期和成年期、雄性和雌性小鼠在注射10 mg/kg THC后300分钟时THC急性镇痛作用的双向ANOVA分析（与图6F相关）（每组n = 5-8）。 请点击此处下载该表格。

表15：对青少年期和成年期、雄性和雌性小鼠注射10 mg/kg THC后60、180和300分钟时THC急性镇痛作用的三因素方差分析（与图6E 和 6F 相关）（每组 n = 7–8）。 请点击此处下载该表格。

讨论

本文概述了根据当前美国法规获取和储存四氢大麻酚（THC）的操作流程，并详细说明了将THC配制用于腹腔注射并给予青春期（出生后第30-35天）和青年成年期小鼠（出生后第70-75天）的实验方案。必须从合法渠道获取THC，并严格遵守所有适用的法规。在美国，研究人员必须同时满足联邦和州两级的监管要求，即使在允许医用和非医用大麻的州也是如此。使用经认证的来源可确保获得研究级THC，该物质在严格控制条件下生产，具有稳定的效价和纯度。相反，使用未经监管或许可的来源会损害科学研究的完整性，增加物质被非法转移的风险，并使研究人员面临法律后果。

我们检测了三种对THC的标准药理学反应——强直性昏厥、运动减少和镇痛作用。我们重现了大量文献数据（例如，参见参考文献27,28,29），表明THC以剂量依赖的方式影响这些反应。这些测试在临床前研究中被用于评估大麻素受体激动剂的药理特性，尽管其与人类体验的相关性可能有所不同。强直性昏厥是指个体运动能力下降或无法执行正常运动功能的状态，表现为身体僵直或固定于异常姿势。运动减少（或称运动低下）是指总体水平方向运动活动的降低，表现为动作变慢或活动频率减少，可能由镇静、运动功能障碍或单纯缺乏运动动机引起。在动物研究中，这通常表现为在新环境中探索行为或总体活动水平的下降。第三项测试即抗伤害感受，指THC在尾浸试验中延长尾部回缩潜伏期的能力。在动物模型中，由于评估镇痛主观成分需要专门的测试方法，尾浸法抗伤害感受虽具有局限性，但仍为观察药物如何影响伤害感受功能提供了有用的视角。

本文结果表明，THC 以剂量依赖性方式诱导僵直状态，且不受性别和年龄影响，尤其在 5 mg/kg 和 10 mg/kg 剂量下表现明显。在成年雌性小鼠中观察到与年龄和性别相关的特异性效应，其僵直反应的产生显著弱于雄性小鼠或青春期雌性小鼠。在新环境中，THC 引起的运动抑制在青春期小鼠中比成年小鼠更强，且不受性别影响。这种与年龄相关的差异不同于 THC 在熟悉环境（即家笼）中对成年小鼠选择性引起的运动抑制效应30。关于 THC 的急性镇痛作用，在青春期雄性小鼠中，5 mg/kg 和 10 mg/kg 两个剂量均显示出统计学显著效应；而在成年雄性小鼠中，仅 10 mg/kg 剂量有效。在所测试的三个时间点中，THC 的镇痛作用在给药后 60 分钟最强，随后逐渐减弱。在四个年龄-性别组中，青春期雄性小鼠对 THC 的镇痛作用最为敏感，并且在注射 10 mg/kg THC 后 60 分钟，青春期小鼠组间存在显著的性别差异。在给药后 300 分钟，发现明显的年龄效应：无论性别如何，青春期小鼠仍表现出显著的镇痛作用，而成年小鼠则无此效应。总体而言，与成年小鼠相比，青春期小鼠对 THC 表现出更高的敏感性，尤其体现在运动活动和痛觉反应的测量中。综上所述，这些结果表明青春期是 THC 急性药理作用的敏感时期，尽管该结论可能依赖于具体测试方法30。本研究结果还揭示了年龄和性别对 THC 效应的共同影响，提示成年雌性小鼠对 THC 的敏感性最低。

青春期接触THC——尤其是频繁且高剂量使用时——可能会扰乱全身（包括大脑）的内源性大麻素系统功能31。这种干扰可能对身心健康产生长期影响32,33,34。过去三十年的流行病学研究一致表明，青春期使用大麻与认知、情绪及心理社会功能的长期损害之间存在关联，这些影响甚至可能在停用后持续至成年期32,33,34,35,36。此外，已有研究报道体重、代谢和免疫功能的长期改变。尽管这些关联已有充分记录，但建立大麻使用与其潜在健康影响之间的因果关系至关重要。多种方法，包括异卵双生子分析、孟德尔随机化和准实验干预，可用于评估人群中的因果关系。然而，实验室动物实验在阐明因果机制方面也发挥着关键作用37。我们实验室在国家药物滥用研究所资助下，采用青春期啮齿类动物模型进行中等但频繁的THC暴露研究，结果支持青春期是THC暴露易损期的假说17,18,25,38,39,40。即使在此关键发育窗口期使用中等剂量的THC，也会对成年期内源性大麻素系统的多个组分产生持久影响。这些影响与神经行为改变、免疫反应受损以及应对心理社会压力能力下降相关。我们先前的研究还发现了脂肪组织功能的意外改变，为长期规律使用大麻者中观察到的代谢变化提供了潜在的分子解释18。THC在青春期等重要神经发育阶段不当激活大脑中的CB1受体，可能破坏大脑成熟所需的平衡，导致可持续至成年期的结构和功能改变。

在人类中，吸烟和电子烟吸入是各年龄段人群最常用的吸食大麻方式。本实验方案概述了通过腹腔（i.p.）途径给予四氢大麻酚（THC）的方法，该方法操作简便、可重复性强，并能在啮齿类动物中产生药代动力学和药效学反应，这些反应在多个方面与人类大麻使用者的反应相似。例如，在青春期和成年雄性小鼠中，5 mg/kg 的 i.p. 剂量所产生的血药峰值浓度与成年人大麻使用者报告的浓度相当。目前正探索将 THC 气溶胶递送（俗称“蒸汽”）作为腹腔注射的补充手段。该方法基于以下假设：被动吸入雾化 THC 与吸烟或电子烟吸入类似，可通过肺部吸收，从而实现更快的起效速度、减少首过肝代谢，并可能产生与肠外给药不同的精神活性效应。值得注意的是，既往研究已表明，大鼠可在操作性行为范式中自我给予雾化大麻提取物或 THC/大麻二酚混合物，凸显了该方法在研究 THC 强化特性方面的潜力。

总之，本方案在已有评估大麻素诱导的四联行为方法的基础上进行了多项关键更新与优化41,42，这些行为依赖于神经元CB1受体的激活43。首先，我们描述了符合当前美国药品执法局（DEA）及机构法规的四氢大麻酚（THC）获取、操作和给药流程，这对于缺乏实际操作经验的研究人员尤为重要。其次，我们将四联行为范式应用于青春期（出生后第30–35天）和青年期（出生后第70–75天）小鼠，这两个发育阶段与生命早期及成年初期的大麻暴露密切相关，但在临床前研究中仍缺乏充分代表。本研究结果重现了THC对僵直、运动活动和镇痛作用的已知剂量依赖性效应，同时揭示了青春期小鼠对THC的敏感性增加，尤其体现在伤害感受和运动功能方面。这种年龄特异性的发现结合合规性指导，使本方案对于大麻素研究的新手以及探索大麻素发育影响的研究人员具有特别重要的价值。

披露

作者声明无生物医学领域的经济利益或潜在利益冲突。

致谢

本工作由国家药物滥用研究所资助（资助号：2P50DA044118 [授予 DP]）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL TB 注射器BD309659每箱200支；无菌，一次性使用。
8 mL 玻璃小瓶Fisher Scientific W224584每箱144个，用于配制THC注射液。
ANY-maze 软件ANY-maze6000用于记录行为学实验视频，并对实验指标进行量化以供数据分析。
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratories#000664所有实验所用的野生型小鼠；可指定所需的确切年龄和性别。
Compass CX 天平OhausCR221用于称量小鼠体重以确定THC注射剂量；最大称重220 g，精度0.1 g。
Corning Pyroceram 加热板Fisher Scientific11500151用于加热尾甩实验中的水浴装置。
Delta-9-四氢大麻酚Cayman Chemical 12068储存于-30 ºC 冰箱中受控的I类管制药品专用锁柜内。
Fisherbrand 丁腈手套Fisher Scientific19-181-610每包100副；一次性，无乳胶，用于个人防护装备。
GraphPad Prism v10.4GraphPadn/a统计分析软件，用于分析实验数据并执行统计检验。
重型烧杯Fisher ScientificS81280用于盛装尾甩实验所需的热水。
高纯度氮气AirgasUN1066 用于蒸发THC储备液中的乙醇。
Logitech C920 网络摄像头Logitech960-001055用于记录动物行为学实验；Carl Zeiss 1080p/30 fps 高清USB摄像头。
旷场实验箱Stoelting Co60101带不透明侧壁的实验箱，用于进行旷场实验；侧壁易于拆卸以便清洁。
宠物训练垫GladB088G1N2H8每包85片；22英寸 ´ 22英寸；用于包裹并固定小鼠进行尾甩实验。
PrecisionGlide 针头BD305109每箱100个；0.4 mm ´ 13 mm；无菌，一次性使用。
生理盐水Fisher Scientific (Cytiva)Z13771 L 瓶装，USP无菌级。
SCOE 1xBioFOGR-SK用于清洁行为学测试器材的清洗液。
吐温-80Sigma AldrichP8074-500MLBioXtra级，黏稠液体；CAS # 9005-65-6。
超声波水浴器Fisher Scientific (Branson)CPX2800温度可控；数字式超声波清洗器。
涡旋混合器Fisher Scientific2215365用于在配制THC注射液过程中混合溶液内容物。

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THC
在青少年和成年小鼠中给予Δ9-四氢大麻酚（THC）
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