方法文章

可重复制造SPOT作为高通量基于支架的培养平台

DOI：

10.3791/68405

⸱

2025年7月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案详细记录了SPOT（一种基于支架的高通量培养平台）在96孔和384孔板格式中的制备与组装过程。同时，还介绍了SPOT的接种流程，包括手动操作以及使用 commercially available liquid handler（商用液体处理仪）进行接种的具体步骤。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

患者来源的类器官（PDOs）在癌症研究领域中正被越来越多地用于肿瘤建模。它们结合了体内（in vivo）和传统体外（in vitro）模型的优势，既保留了组织的复杂性和异质性，又由人类细胞构成。随着生理上更具代表性的PDO模型的兴起，人们迫切需要能够简便分析类器官行为的装置。本方案详细说明了如何组装和使用基于支架的类器官组织平台（Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues，SPOT），这是一种高通量、三维（3D）类器官培养装置。该平台消除了接种水凝胶时通常形成的弯月面，从而实现类似于二维（2D）培养的快速、准确成像。因此，在SPOT中接种的类器官及共培养体系可轻松通过高通量显微镜进行成像。SPOT设计为即用型设备，适用于具备基本组织培养经验的研究人员，并兼容手动和自动化接种流程。本方案详细介绍了SPOT在96孔和384孔板格式中的制备方法，包括组装、接种、质量控制和故障排除的逐步操作说明。尽管制备过程（不含等待时间）需要3至4小时，但可同时制备多块培养板，提高了可扩展性。通过简化PDO的培养与分析流程，SPOT为高通量药物筛选和转化癌症研究提供了一种可靠的工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管生物医学研究取得了进展，开发出具有生理相关性的体外检测方法仍然具有挑战性。理想的检测方法应能兼容多种细胞类型、处理方案、时间尺度、商用仪器和分析检测手段，以满足不同学科研究人员的需求。然而，由于缺乏合适的工具，研究人员往往依赖于简单的模型，例如永生化细胞系的二维单层培养，这些模型无法重现疾病的复杂性和临床相关性，尤其在癌症研究中表现明显1,2。为解决这一问题，大规模肿瘤生物样本库的建立以及与临床医生的合作推动了高保真体外模型的发展，例如患者来源的肿瘤类器官（PDOs），其相较于传统细胞系更能保留患者的特异性遗传特征和治疗反应谱型3,4,5。与此同时，实验室自动化和药物发现领域的进步要求检测平台能够无缝整合到高通量工作流程中。尽管现有平台在生物学保真度或可扩展性方面有所突破，但能够同时解决这两个挑战的平台仍为数不多6,7,8。开发可自动操作、高通量且能复制关键疾病特征的模型，对于推动生物医学研究以及加速转化应用所需的数据生成至关重要。

目前有多种新兴模型旨在解决高通量培养特定细胞类型（如类器官，PDOs）所面临的挑战（图1）。传统的培养平台通常将类器官与水凝胶混合后置于96孔或384孔板中，存在若干局限性：（i）较高的细胞-凝胶体积导致营养物质获取不均；（ii）孔内液面弯月面曲率引起成像伪影和细胞梯度；（iii）水凝胶接种在不同批次及操作人员之间缺乏一致性；（iv）与自动化制备和自动显微成像系统不兼容；（v）所使用的细胞外基质（ECM）通常较软且脆弱，在生理组织密度下或引入收缩性细胞类型时易导致样本破坏1,9。目前，大多数基于孔板的PDO研究采用两种方法：一种是手动将细胞-凝胶混合物接种至孔板中10,11，另一种是凝胶覆盖法，即将水凝胶用黏度较低的培养基稀释后，通过离心使细胞沉降至孔底，以将其置于合适的光学焦平面12,13。然而，这两种方法均无法为长期培养提供足够的机械支撑。根据我们先前的观察（未发表数据），在标准孔板中，商用水凝胶与细胞混合后，12天内12个孔中有9个孔的凝胶会从孔壁收缩脱离；而凝胶覆盖法则缺乏生理性的细胞-基质相互作用。此外，由于孔内空间有限，所获得的培养物难以长期维持，并且不适用于需要高试剂-细胞培养基比例的检测实验14,15,16。这些实际障碍阻碍了三维模型的广泛应用，并限制了整个领域内实验的可重复性。

三维细胞培养方法的可扩展性与生物学相关性图表，示意图，实验设置。
图1：基于可扩展性和生物学相关性的培养模型评估。 各种体外（in vitro）和体内（in vivo）培养系统在可扩展性（y轴，以孔板通量定义）和生物学相关性（x轴，以生理保真度定义）上的相对位置，突出了通量潜力与生理相关性之间的权衡。请点击此处查看该图的放大版本。

受这些挑战的启发，研究人员利用一种薄型纤维素支架的高孔隙率和机械增强特性，开发了基于支架支撑的类器官组织平台（Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues, SPOT），该平台提供96孔和384孔两种规格。SPOT采用一种预先图案化的聚合物支架，结合此前开发的渗透方法实现整合。17 与板布局相匹配，可实现细胞-凝胶液滴的精确定位，并为水凝胶相提供结构支撑（图2A). 毛细作用引导细胞凝胶溶液进入支架，形成机械增强的生物复合网络图2B由于支架具有多孔结构，细胞凝胶能够渗入并形成一层较薄的覆盖层（厚度约为70 µm），仅需十分之一量的细胞凝胶即可覆盖孔板底部14通过代谢检测和基于图像的测量方法评估胰管腺癌（PDAC）类器官的生长情况，验证了SPOT平台在接种PDAC患者来源类器官（PDOs）方面的兼容性。自开发以来，SPOT已展现出在类器官培养研究中显著的多功能性和实用性。此外，SPOT的设计具有用户友好的可扩展性，其扁平、无弯月面的微凝胶结构可减少试剂用量，并通过实现均匀的光线穿透，提升成像能力，确保高内涵成像的准确性。14 (图2C，DSPOT 还支持与其他相关细胞类型（如成纤维细胞）的共培养，以更好地模拟肿瘤微环境18.

设备制备示意图；细胞接种、显微镜观察过程及基于图像的研究分析。
图2：96-SPOT装置及图像分析工作流程概览。（A）SPOT板制备的示意图：该装置通过堆叠一个商用无底孔板（顶部）、蓝色所示的PMMA图案化支架和底部的聚碳酸酯膜，并使用黄色所示的双面聚丙烯酸胶粘剂层进行组装而成。（B）向支架孔中接种细胞：将细胞悬浮于未聚合的水凝胶（粉红色所示）中，并通过移液加入各个孔中，使其渗入支架内部。随后水凝胶发生凝胶化，将细胞包埋于支架支撑的水凝胶中。（C）显微镜观察：所形成的微组织可通过自动化宽场显微镜进行成像。（D）基于图像的分析：可使用标准图像分析流程对悬浮于凝胶中的荧光细胞（绿色）图像进行分析。图中为代表性的一孔96-SPOT装置中表达GFP的KP4细胞的落射荧光显微图像。比例尺为500 µm。本图经修改自14。请点击此处查看此图的放大版本。

SPOT 的另一个优势在于，该系统可与开源液体处理装置整合，从而实现 PDO 培养物的自动化、可重复制备。这一进步减少了操作者之间的差异性，并支持复杂的实验设计，包括高通量药物筛选和个体化医疗策略18。此前研究还表明，SPOT 与基于单细胞的多重细胞表型表征技术兼容，可在异质性肿瘤环境中进行，并可通过消化方式按需回收细胞18。这些特性使 SPOT 成为一种多功能工具，适用于需要纵向、高分辨率数据来评估药物疗效以及在生理相关条件下细胞行为的筛选应用14,18。通过整合这些技术创新，SPOT 克服了传统三维培养系统中的关键局限性。

本方案提供了制备SPOT组件、组装培养板以及进行稳健且可重复的3D类器官培养的接种方法的全面指南。内容包括使用移液器进行手动接种的详细操作步骤，以及利用液体处理仪实现96孔和384孔板格式的自动化接种流程。此外，本方案还概述了关键的质量控制措施，例如验证凝胶分布的均匀性和支架结构的完整性，以确保实验的高标准。同时提供了针对常见问题的故障排除策略，如凝胶渗透不完全、接种过程中液体蒸发以及支架脱落等问题，为研究人员提供实用解决方案，以优化实验流程并获得可靠结果。

SPOT 旨在弥补传统类器官检测面临的一些不足，包括在保持凝胶完整性的前提下进行检测操作和换液所面临的挑战10,11,12,13。本方法的总体目标是制造一种支架支撑的平台，以支持类器官在12天内的培养。此外，该方法还涵盖了通过手动或液体处理仪辅助接种在 SPOT 中生成组织阵列，从而使用户能够开展任何下游干扰实验，包括药物 IC50 检测和小分子筛选。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，以胰腺导管腺癌（PDAC）类器官为例。这些类器官来源于PDAC患者，购自加拿大玛格丽特公主癌症中心大学健康网络生物样本库（UHN Biobank）（编号PMLB PPTO.46，大学健康网络，加拿大），采购过程遵循多伦多大学研究伦理委员会指南（方案编号#36107）。所需的所有材料、试剂和设备请见材料表。

1. 制备PMMA-丙酮溶液（耗时：20分钟 + 约8–16小时静置）

注意：在SPOT中使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）-丙酮溶液来界定孔位并防止孔间泄漏。一般步骤是将固体PMMA溶解于丙酮中。此前，PMMA-丙酮溶液曾被用于对类似的纸质支架进行图案化，以阻断培养基和气体交换，从而在另一种3D培养模型中实现缺氧环境17。此处，对PMMA-丙酮配方进行了调整，以制备PMMA浸渗支架用于SPOT的构建。

  1. 在已标记的 50 mL 圆锥形离心管中，加入 1.75 g PMMA 粉末。然后在通风橱中加入 7.84 mL 丙酮，并 tightly 封闭离心管，以避免溶剂挥发。
  2. 若需可视化聚合物图案，可在溶液中加入 5–10 滴指甲油。紧密封闭离心管，手动振荡管体，以开始将指甲油与 PMMA-丙酮溶液混合。
    注意：为确保多次绘图批次之间的一致性，可先将已知量的指甲油用丙酮稀释，再将此稀释液作为 7.84 mL 丙酮进行移液。
  3. 将 PMMA-丙酮溶液置于涡旋混合器中过夜，以确保充分溶解。若未开启，可将该溶液储存于 4 °C，最长不超过 2 周。

2. 制备PMMA渗透支架

（用时：96-SPOT 图案化：15 分钟准备 + 每个支架 6 分钟；384-SPOT 图案化：15 分钟准备 + 每个支架 10 分钟）

注意：PMMA 渗透支架的制备仅在工作台（非无菌环境）上进行。制备 96/384-SPOT 支架时，请确保使用相应的图形编辑绘图仪软件或矢量绘图仪控制库 已安装。 请注意，该实验步骤中的某些子步骤同时适用于96-SPOT和384-SPOT，而其他步骤则仅适用于其中一种板型。在后一种情况下，将分别提供选项A（适用于96-SPOT）和选项B（适用于384-SPOT）。对于（A）96-SPOT模式，存在 三 层；首先，引线用于建立PMMA-丙酮溶液的稳定流动；其次，96个圆形阵列；最后，采用旅行商问题（TSP）路径规划各孔之间的区域。对于（B）384-SPOT模式，第一个模块包含引线；第二个模块为围绕孔板的边框；最后绘制网格，形成384个独立区域。对于这两种模式，均可通过修改源代码来调控孔的尺寸，如Li等人的研究所示。14.

  1. 支架浸润过程的设置
    1. 将储存于 4 °C 的 PMMA-丙酮溶液在室温下振荡 10 分钟。将试管架放置一旁，待开始绘图时使用。
    2. 使用电源线将绘图仪连接至电源。绿色闪烁灯表示设备已开启。将绘图仪的 USB 线插入指定的计算机以进行绘图。
    3. 用一张烘焙纸覆盖夹式画架。确保画架的整个表面均被覆盖。
      1. 为引导 96-/384-SPOT 模式的绘图，先在一张打印纸上制备 96-/384-SPOT 模板。使用笔代替注射器、打印纸代替烘焙纸和茶滤纸，执行步骤 2.2–2.3。模板完成后，将其放置在夹式画架上，并用烘焙纸覆盖。然后进入步骤 2.2，按照方案制备 96-/384-SPOT 支架。
    4. 使用长尾夹将烘焙纸固定在画架上（图 3A）。取一张支架材料（即茶滤纸），沿两侧两层粘合处剪开（图 3B）。
    5. 将剪裁后的茶滤纸（以下简称纸支架）放置在夹式画架上，光滑面（茶滤纸外侧）朝上。用夹子固定三边。确保纸支架在夹式画架上完全展平，绘图区域不得有任何褶皱。
  2. 绘制 96/384-SPOT 模式
    1. 如需设置 96-SPOT 的绘图软件和文件，请遵循选项 2.2.2；如需设置 384-SPOT 的软件和文件，请遵循选项 2.2.3。
    2. 设置绘图软件及 96-SPOT 绘图文件
      1. 在软件应用程序中，打开 96-SPOT 的 SVG 文件（补充文件 1；图 4A）。在菜单栏中，导航至 扩展 > 绘图仪控制（图 4B）。
      2. 新窗口出现后，调整设置以匹配 补充图 1。返回绘图仪控制扩展窗口的“绘图”选项卡。保持此窗口打开，以备后续使用。
    3. 设置矢量绘图仪控制库 API 及 384-SPOT 绘图文件
      1. 打开命令提示符窗口（Windows）或终端（Mac）。输入命令以启动指定的交互式计算笔记本。确保笔记本在浏览器中打开。
      2. 选择 384-SPOT 代码文件（补充文件 2）并打开。使用 20G 针头（或 384-SPOT 模式下使用 16G 针头），用 3 mL 绘图注射器吸取 1 mL PMMA-丙酮溶液（图 3C）。
        注：10 mL 加载注射器与 EVA 管路之间的流量控制阀必须打开（与筒身平行）。由于浸润过程依赖重力驱动，请确保 3 mL 绘图注射器中的液面始终维持在 0.5–1.5 mL 刻度之间，以保证绘图过程中分配体积的一致性。
    4. 当 3 mL 绘图注射器的针头仍处于 PMMA-丙酮溶液中时，关闭 10 mL 加载注射器与 EVA 管路之间的流量控制阀（使其垂直于筒身）。
    5. 迅速盖上 PMMA-丙酮溶液的管盖。将 3 mL 注射器装入笔架。调整注射器相对于笔架的高度，以实现以下对齐（图 3D）。
    6. 调整夹式画架的位置，使 3 mL 注射器的针尖位于绘图模式的原点（即模板图案左上角的黑点处）。抬起带有注射器的绘图仪笔架，将夹式画架滑入其下方。
    7. 迅速断开 10 mL 注射器与管路的连接，使大气压力作用于储存在 3 mL 绘图注射器中的 PMMA-丙酮溶液。打开流量控制阀。
    8. 如需开始绘制 96-SPOT 模式，请遵循步骤 2.2.9；如需开始绘制 384-SPOT 模式，请遵循步骤 2.2.10。
    9. 在指定绘图仪中启动 96-SPOT 的绘图，具体如下：
      1. 在软件中，点击绘图仪控制扩展中的 应用。绘图仪将开始运行并绘制 PMMA 图案。绘图完成且笔架返回初始位置前，无需进一步操作。
      2. 如需在绘图过程中暂停绘图仪，按下绘图仪左侧的小银色按钮。然后通过图形软件中的绘图仪 控制扩展 > 恢复 选项卡，选择从暂停处继续绘图，或使笔架返回初始位置（补充图 1C(iii)）。
    10. 在指定计算界面中启动 384-SPOT 的绘图，具体如下：
      1. 在界面中点击 重启内核并重新运行（工具栏上的双箭头）。代码将开始运行并绘制 PMMA 图案。图案绘制完成且笔架返回初始位置前，无需进一步操作。
      2. 如需在绘图过程中暂停绘图仪，按下绘图仪左侧的 小银色 按钮。手动将打印头完全向后并向左移动，使其回到初始位置。重新连接绘图仪电源。与 96-SPOT 绘图不同，384-SPOT 无法从暂停处恢复绘图；需更换纸支架并从头重新运行代码。
  3. 卸载注射器及清理
    1. 绘图完成后，重新将 10 mL 注射器连接至管路。从绘图仪笔架上取下 3 mL 注射器，并将剩余的 PMMA-丙酮溶液转移回原储存瓶中；若此前步骤中已发生明显蒸发，则予以弃置。
    2. 用移液器吸取丙酮清洗 3 mL 注射器的筒身。将注射器-管路系统静置晾干后，放回储存位置。
    3. 小心地从夹式画架上取下 SPOT 支架。
    4. 检查所绘制的 SPOT 支架，确保其可用于实验（图 3E、F）。参考故障排除 表 1 以及质量保证与控制 表 2 和 表 3 获取指导。
    5. 将所有带有 PMMA 图案的支架储存于密封袋中，置于阴凉干燥处。

3. 96/384孔板胶带切割

（用时：96-SPOT 图案化：每 5 片胶带 15 分钟；384-SPOT 图案化：每 5 片胶带 30 分钟）

注意：这是精确且高效切割胶带的方法之一，尤其适用于384孔板胶带模式。该方法还可通过激光刻蚀胶带的一层（顶部覆盖塑料层），以在组装过程中提高操作便利性。 Alternatively，也可使用裁纸刀进行胶带切割，但速度较慢，且无法实现刻蚀功能。

  1. 打开96孔/384孔胶带图案激光切割文件（补充文件3，补充文件4），通过点击绘图 ，将用三种不同颜色编码的打印图案载入激光切割软件中，设置参数如补充图2A所示。
  2. 将一段胶带装载到激光切割机表面，并确保胶带平整地贴合在表面上。切割过程中可使用纸张或重物压住胶带边缘。
    注意：确保胶带在激光切割机表面完全平整。任何凸起都可能影响切割质量，尤其是384孔胶带。
  3. 根据激光切割机说明书，调整打印图案的位置，使其与胶带位置对齐。
  4. 使用相同的激光切割设置切割96孔和384孔胶带，具体设置如补充图2B所示。不同颜色线条的切割顺序至关重要：先切割红线，再切割绿线，最后切割蓝线。
    红线：Rast/Vest模式，激光功率45%，速度80%，1000 PPI，Z轴0.50 mm。
    绿线：Rast/Vest模式，激光功率7%，速度100%，1000 PPI，Z轴0.50 mm。
    蓝线：Rast/Vest模式，激光功率50%，速度80%，1000 PPI，Z轴0.50 mm。
  5. 妥善保存已切割的胶带，直至进行SPOT组装。

4. 96/384-SPOT 组装（用时：1 小时）

注意：本节详细说明了在生物安全柜（BSC）等无菌环境中组装96-/384-SPOT装置的操作步骤。或者，也可在非无菌环境中预先组装96-/384-SPOT装置，随后通过环氧乙烷气体灭菌法进行灭菌处理。

  1. 组装 SPOT 支架的准备工作
    1. 取一个用于 96 孔或 384 孔 SPOT 的 PMMA 图案化支架。剪去支架蓝色区域周围的多余纸张，保留蓝色区域周边 5 mm 的白色边缘。最终得到的片材尺寸约为 760 mm × 1300 mm。
      注意：不要剪掉引水线。该线有助于判断支架的粗糙面与光滑面（图 3E、F）。
    2. 如需准备用于组装的 96 孔 SPOT 支架，请执行步骤 4.1.3；如需准备 384 孔 SPOT 支架，请执行步骤 4.1.4。
    3. 对 96 孔 SPOT 支架的孔间区域进行穿孔处理。
      1. 将一片聚乙烯薄膜（1000 mm × 1500 mm）覆盖在刚性丙烯酸支撑板（2700 mm × 2700 mm）上。将覆盖有聚乙烯薄膜的支撑板放置于工作台面，并将支架平铺在聚乙烯薄膜上（图 5A）。
      2. 将直尺边缘对准前两行之间的间隙，确保沿该边缘划线时不会进入孔内。
      3. 将划线轮置于支架底部并紧贴直尺，沿直尺引导刀片路径，从支架底部向上滚动至顶部。在支架所有行间间隙重复此操作（共 7 次）。
      4. 从第一列与第二列之间的间隙开始，对所有其他列间间隙重复步骤 4.1.3.2 和 4.1.3.3。
    4. 对 384 孔 SPOT 支架的孔间区域不进行穿孔处理，按以下步骤操作。
      1. 不要对 384 孔 SPOT 支架的孔间区域进行穿孔处理，直接进入步骤 4.2。
  2. SPOT 材料与组装设备的灭菌
    1. 将打印好的支架、两卷 96 孔胶带（或 384 孔胶带）、96 孔无底板（或 384 孔无底板）、96 孔板盖（或 384 孔板盖）、聚碳酸酯薄膜、聚二甲基硅氧烷（PDMS）块、可密封塑料袋、镊子和精密刀片放入生物安全柜中，一侧紫外线照射 20 分钟（图 5B）。
    2. 将所有材料和组装设备翻转至另一侧，再进行 20 分钟紫外线照射。
  3. 将支架固定至第一卷 96/384 孔胶带
    1. 将支架粗糙面朝上（图 3F）放置在 PDMS 块上，使孔行方向呈水平。利用引水线判断哪一侧为粗糙面（引水线右对齐表示粗糙面朝上）。
    2. 将支架平整地贴合在 PDMS 块上，确保支架表面及下方无皱褶或气泡。去除双面胶带非刻蚀侧的保护层。轻微弯曲胶带中部，将胶带中间两列与支架对齐。
    3. 对齐后，按压胶带中部，并从中间向两侧将胶带平整地贴合到支架上。
      注意：若支架对齐错误，PMMA 图案将明显重叠至加样孔区域。
    4. 使用镊子小心地将支架从 PDMS 块上取下，并将 PDMS 块妥善保存以供后续使用。
  4. 将支架固定至第二卷 96/384 孔胶带
    1. 将支架放置在工作台上，翻转支架使其光滑面（未粘胶带的一面）朝上。
    2. 去除第二卷胶带刻蚀侧的中间保护层，确保胶带中间两列暴露。若使用非刻蚀胶带设计，则完全去除一侧的保护层。
    3. 轻微弯曲胶带中部，将胶带中间两列与支架对齐。
    4. 胶带与支架对齐后，按压胶带中部。若使用刻蚀胶带设计，随后去除胶带中间暴露区域两侧的另外两个保护层，并从中间向两侧将胶带平整地贴合到支架上。
  5. 将支架固定至无底板
    1. 去除支架粗糙面一侧胶带的保护层。若使用刻蚀胶带设计，仅去除中间保护层。
    2. 将支架与无底板（带盖）的底面进行对齐。对齐后，将支架中部按压至板底面。若使用刻蚀设计，随后去除中间暴露区域两侧的保护层，并从中间向两侧将支架平整地贴合到板底面。
  6. 将支架固定至聚碳酸酯薄膜
    1. 使用镊子小心地松开聚碳酸酯薄膜的保护层。松动后，缓慢地从薄膜上剥离保护层。切勿在薄膜上产生压痕，以免影响显微镜成像时的光学性能。
    2. 对聚碳酸酯薄膜的另一侧重复步骤 4.6.1。当两侧保护层均被去除后，将薄膜暂时放置在工作台上备用。
    3. 去除连接在板底的胶带上的保护层。从中间开始向两侧将聚碳酸酯薄膜压贴至支架上。
    4. 用力将聚碳酸酯薄膜压紧至板底，确保所有孔均具有清晰明确的边界。
    5. 使用精密刀片 小心地切除板底多余的材料。
      注意：需格外小心，避免切割到板体或任何孔。若刀片难以切割，应检查是否已切入板体。
  7. 组装后 96/384-SPOT 的储存
    1. 完成 96 孔 SPOT 的全部组装后，将其放入透明可密封塑料袋中，并带出生物安全柜。
    2. 在板底面下方放置一块刚性丙烯酸支撑板，并在对角的两个角处用夹具将支撑板固定到板上（图 5C）。使用前每个角至少保持夹紧 30 分钟。
    3. 将板存放于清洁、干燥的环境中，直至使用。

5. 96/384-SPOT 接种（用时：2 小时 45 分钟）

注意：本节详细说明了在96孔/384孔SPOT装置中接种细胞以生成均匀3D微组织的操作流程。接种过程包括将确定体积的细胞-凝胶混合物（例如，96孔SPOT使用5 µL，384孔SPOT使用2 µL）小心地滴加到预先组装好的SPOT支架上。为确保凝胶均匀渗透并分布，需利用毛细作用引导细胞-凝胶液滴沿支架的多孔结构扩散。该步骤可通过移液器手动操作，也可使用液体处理设备自动化完成。接种后，将培养板置于37 °C孵育，以促进凝胶聚合及细胞包埋。

  1. 96/384-SPOT 板的准备
    1. 松开 96-/384-SPOT 的夹子，并从底部移除丙烯酸支撑板。
    2. 在生物安全柜（BSC）中，将 SPOT 从塑料袋中取出。打开紫外灯，对板和盖子的内部进行 20 分钟的灭菌处理，然后关闭盖子并将板翻转至底部，再进行 20 分钟的紫外处理。
    3. 使用移液器向 96-SPOT 板的每个孔间空间加入 70 µL 的 PBS。不要向 384-SPOT 板中加入 PBS。在接种前，将板置于 4 °C 冷却至少 30 分钟。
  2. 细胞的准备
    1. 根据推荐的操作方法，从培养瓶中消化细胞或从凝胶圆顶中分离类器官，并按照制造商说明书使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。记录细胞悬液的细胞密度（即每毫升的细胞数），以便根据所需的接种密度计算步骤 5.4.1–5.4.2 所需的细胞悬液体积。
  3. 凝胶的制备
    1. 根据先前优化的水凝胶制备说明17,19,20,21，通过将 1 mL 浓度为 3 mg/mL 的 I 型牛胶原蛋白加入 1.5 mL 微量离心管中来制备水凝胶。
      注意：所有组分及最终混合物在整个制备过程中必须保持在冰上。
    2. 向牛胶原蛋白中加入 125 µL 的 10 倍浓缩最低必需培养基（MEM）。缓慢吹打混合，直至混合物由粉红色变为黄色。
    3. 向牛胶原蛋白混合物中加入 8 µL 的 0.8 M 碳酸氢钠。缓慢吹打混合，直至混合物变为浅粉色。配制后 30 分钟内使用该混合液，以确保多次实验间凝胶形成的一致性。
      注意：如果混合物仍为黄色，可逐次加入 0.5 µL 的 0.8 M 碳酸氢钠，滴定至 pH 7，直至呈现浅粉色。可选：采用相同方法，可为需要更高胶原蛋白浓度的培养体系制备凝胶。对于类器官培养，使用 Landon-Brace 等人17所表征的水凝胶混合物。
  4. 将细胞悬浮于凝胶中
    1. 将达到目标细胞-凝胶密度所需的细胞悬液体积加入微量离心管中，在 300 x g 条件下离心 5 分钟。
    2. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于凝胶中（体积根据目标浓度而定）。
  5. 手动接种 96-/384-SPOT 板
    1. 将 96-/384-SPOT 板放置在冷冻冰袋上。接种 96-SPOT 时，请遵循步骤 5.5.2；接种 384-SPOT 时，请遵循步骤 5.5.3。
    2. 手动接种 96-SPOT
      1. 用细胞-凝胶混合物预润洗 10 µL 移液器吸头。使用 20 µL 移液器吸取 5 µL 凝胶，并按至第一停点，使吸头末端形成液滴。将液滴接触至孔的中央。
        注意：若将移液器按至第二停点排出凝胶，可能会引入气泡。所有孔必须在 5 分钟内完成接种，以确保各孔间凝胶形成的一致性。
      2. 接种完所有目标孔后，盖上板盖，按照制造商说明书在 37 °C 下孵育 45 分钟，使凝胶聚合。向每个接种孔中加入 200 µL 培养基，并在进行任何成像或干预前，至少连续孵育 1 小时。
    3. 手动接种 384-SPOT
      1. 用细胞-凝胶混合物预润洗 10 µL 移液器吸头。使用 10 µL 移液器吸取 2 µL 凝胶，并按至第一停点，使吸头末端形成液滴。
        注意：强烈推荐使用多通道 10 µL 移液器。
      2. 将液滴接触至孔的中央。接种完所有目标孔后，盖上板盖，按照制造商说明书在 37 °C 下孵育 45 分钟，使凝胶聚合。
      3. 向每个接种孔中加入 60 µL 培养基，并在进行任何成像或干预前，至少连续孵育 1 小时。
    4. 使用液体处理仪接种 96/384-SPOT
      1. 在制备细胞-凝胶混合物期间，开启液体处理仪及其 HEPA 过滤模块至高挡。小心地向液体处理仪内部喷洒 70% 乙醇，并用浸有乙醇的纸巾擦拭。
      2. 在进行移液头校准前，加载 96-SPOT 或 384-SPOT 的接种程序（补充文件 5 或 补充文件 6）。在 1 号和 4 号槽位安装温控模块（图 6A）。
      3. 为校准目的，使用指定的 P20 和 P200 滤芯吸头盒，分别装入 5 号和 6 号槽位（图 6B）。根据软件显示的提示完成移液头校准。校准完成后，更换为无菌的 P20 和 P200 滤芯吸头盒，分别置于 5 号和 6 号槽位用于接种。再次喷洒 70% 乙醇于表面，并关闭门直至开始接种。
        注意：必须准确校准吸头与 96-/384-SPOT 板顶部的位置。建议使用板封膜，以帮助可视化多通道移液头在 Z 轴方向相对于板顶的位置。理想位置是所有吸头均接触板封膜并产生微小凹陷。
    5. 在细胞-凝胶混合物制备过程中，当细胞处于最后一次离心步骤时，开启两个温控模块并设置为 4 °C。完成步骤 5.4 后，在生物安全柜内将所需量的细胞-凝胶混合物加入 8 联排 0.2 mL PCR 管中。
      注意：每管中加载的细胞-凝胶混合物最小体积为：96-SPOT：5 µL 乘以需接种的列数，再加上死体积；384-SPOT：2 乘以 2 µL 乘以需接种的列数，再加上死体积。建议每管的死体积约为 10–20 µL，以避免末端出现气泡或列不完整。
    6. 在将细胞-凝胶混合物从生物安全柜转移至冰上之前，使用 8 联排平盖封闭 8 联排 0.2 mL PCR 管。
    7. 将预冷的 SPOT 板装载到 4 号槽位的温控模块上，使用平底板格式模块（图 6B）。
    8. 将装有细胞-凝胶混合物的 8 联排 0.2 mL PCR 管装载到 3 号槽位的温控模块上，使用 96 孔格式模块。
    9. 打开平盖和 SPOT 板盖，并将其存放在液体处理仪内但远离已使用槽位。打开 P20 和 P200 滤芯吸头盒的盖子。
    10. 运行程序。接种完所有目标孔后，盖上板盖，按照制造商说明书在 37 °C 下孵育 45 分钟，使凝胶聚合。
    11. 向每个接种孔中加入 200 µL 或 60 µL（96-/384-SPOT）培养基，并在进行任何成像或干预前，至少连续孵育 1 小时。

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结果

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PMMA对纸基支架的图案化处理可作为物理屏障，防止各孔之间内容物的交换。该设计对于确保相邻孔之间在化学和生物学上的隔离至关重要，可避免培养基、药物、分泌因子甚至细胞的非预期扩散14。引入PMMA实现了精确的区域分隔，使SPOT成为高通量筛选和共培养研究中可靠的平台，最大限度地减少交叉污染14,18。推荐的质量保证与质量控制实验详见表3和表4。在进行细胞-凝胶混合物接种操作及长期类器官培养之前，最关键的质控实验之一是渗漏测试，以验证组装后培养板的结构完整性以及PMMA屏障的有效性。对于成功制备的培养板，应无任何培养基渗漏现象。通过在相邻孔中交替加入荧光素和PBS（图7A），用户可评估所制备SPOT板的完整性。在384-SPOT板中，测试期间（30天）未观察到任何培养基交换或向邻近孔的渗漏（图7B

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讨论

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在此方案中，提供了96孔和384孔SPOT的制备与使用详细指南，涵盖组装、手动及液体处理仪辅助的细胞-凝胶接种。与传统的水凝胶柱塞系统不同，SPOT可消除与弯月面相关的伪影，从而实现非破坏性、 原位 类器官成像，方法如前所述14,16,22此外，支架可提供结构支持，确保长期培养的稳定性。SPOT 技术使研究人员能够通过纵向成像追踪群体动态，并对肿瘤类器官及其他三维细胞培养物进行代谢分析，相较于仅依赖终点检测的评估方法具有显著优势14,18此外，在支架的支持下，先前的研究结果表明，可以将通常难以在凝胶穹顶中培养的收缩性细胞（例如基质细胞）整合到共培养系统中，并同时监测两个细胞群体的细胞变化。18该系统可与市售的液体处理系统兼容，有助于实现自动化的细胞接种以及下游终点单细胞分...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢Jennifer Lam在图像采集方面提供的帮助。图1、图2和图7A使用BioRender.com制作。本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金（项目编号：RGPIN-2021-03488）资助A.P.M.；加拿大卓越研究计划（CFREF）“设计医学”重大科学问题项目资助A.P.M.；加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金—博士项目资助R.C.；Peterborough K.M. Hunter慈善基金会奖资助R.C.；加拿大国家研究委员会（NRC）CRAFT博士后奖学金资助N.T.L.；加拿大自然科学与工程研究委员会CREATE TOeP项目资助N.T.L.；加拿大自然科学与工程研究委员会本科生科研奖资助Z.K.；以及多伦多大学卓越奖资助C.M.T.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 mL PCR管（8联管） Sarstedt72.985.002
1.5 mL离心管FroggaBioLMCT1.7B
1000-μL移液器吸头Eclipse4-1019-260-000
10 mL血清移液管FroggaBio394010
10 mL注射器BD, Canada302995
10倍最低必需培养基（MEM 10x）Gibco11430030
150 mm培养皿Corning430599
带鲁尔锁扣接头的16号分配吸头McMaster-Carr, Illinois, USA6699A2
20µL滤芯吸头架Opentrons999-00099
200µL滤芯吸头架Opentrons999-00081
200-μL移液器吸头Eclipse4-1030-260-000
带鲁尔锁扣接头的20号分配吸头McMaster-Carr, Illinois, USA6699A4
384孔无底孔板（黑色）Greiner82051-544
3 mL注射器 BD, Canada309657
50 mL聚丙烯锥形离心管VWRCA21008-940
50 mL聚丙烯锥形离心管VWRCA21008-940
96孔无底孔板（黑色）Greiner82050-714
丙酮Fisher ScientificA18-1
分析天平N/AN/A
Inkscape软件的AxiDraw扩展（https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation）N/AN/A
AxiDraw Python API（https://axidraw.com/doc/py_api/#installation） N/AN/A
AxiDraw V3高性能个人书写与绘图仪Evil Mad Scientists, USAN/A
牛胶原蛋白（PureCol 3 mg/mL）Advanced BioMatrix5005
选用的细胞系N/AN/A
夹式画架（包含在AxiDraw V3套件中）Evil Mad Scientists, USAN/A
选用的培养基N/AN/A
防尘保护胶带3M6851 PN36851
双面聚丙烯酸胶带（800 mm × 1200 mm）Adhesive Research, ARcare90106NB
胎牛血清（FBS）Gibco12483-020
Finum XL茶滤袋 Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Germany420.69.00
0.2 mL PCR管平盖（8联管）Sarstedt65.989.002
重型塑料弹簧夹BENCHMARK1024-554
HEPA模块 – 110-130V 60Hz型号Opentrons999-00109
冰袋（冷冻，1400 mm × 1800 mm）N/AN/A
Inkscape软件N/AN/A
激光切割机Universal Laser SystemVLS3.75
外径0.07英寸的微型乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）管McMaster-Carr, Illinois, USA1883T3
多通道电子移液器P20（Gen2）Opentrons999-00005
多通道电子移液器P300（Gen2）Opentrons999-00006
指甲油Sally HansenSBS-006861可选，用于PMMA墨水着色
Opentrons OT-2Opentrons999-00111
P1000移液器GilsonFA10006M
P200 8通道移液器GilsonF144072
P200移液器GilsonFA10005M
纸巾N/AN/A
Parafilm封口膜Bemis Company, Inc.52859-079
烘焙纸  N/AN/A
巴斯德移液管VWR14672-380
青霉素-链霉素（P/S）Sigma-AldrichP4333
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）Sigma-Aldrich182230
聚碳酸酯薄膜（760 mm × 1300 mm）McMaster-Carr85585K102
聚二甲基硅氧烷单体与交联剂（PDMS，1500 mm × 2700 mm）Ellsworth Adhesives4019862
精密刀具N/AN/A
刚性亚克力支撑板（尺寸适配孔板底部）McMaster-Carr8560K239
刚性纸板支撑板N/AN/A
直尺N/AN/A
剪刀 N/AN/A
碳酸氢钠（0.8 M蒸馏水中）Sigma-AldrichS6014
带铝块的温控模块（Gen2）Opentrons999-00097
滚轮划线器 HEEPDD (Amazon)B07YQWB284
透明胶带 N/AN/A
台盼蓝Gibco15250-061
胰蛋白酶Gibco25200-056
镊子N/AN/A
涡旋混合器 N/AN/A

参考文献

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