一种用于大鼠心肌缺血-再灌注损伤建模的微创双活结技术

摘要

在此，我们提出一种通过靶向左前降支冠状动脉（LAD）的双主动结线圈结扎法诱导心肌缺血-再灌注损伤的方案，该结扎可被释放 体外 无需二次开胸即可按需进行再灌注，且具有微创优势。

摘要

心肌缺血-再灌注损伤（MI/RI）模型在探究心肌梗死的病理生理机制及促进相关药物研发方面具有重要意义。然而，在常用的建模方法中，传统的聚乙烯管辅助冠状动脉结扎法存在明显缺陷。该方法需重新开胸以解开结扎线，不仅耗时，而且对实验动物造成较大损伤，容易导致动物死亡。本研究旨在介绍一种改进的模型制备方法。该方法采用双活结线圈结扎左前降支冠状动脉（LAD），并通过拉拽活结实现再灌注 体外 为实现再灌注，从而避免二次侵入性操作。通过心电图（ECG）监测、M型超声心动图（ME）测定、伊文思蓝与2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色（EB-TTC）等评估方法表明，该方法可诱导出稳定的心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）。该改良的MI/RI模型方案具有操作简便、建模迅速的特点，且建模成功率令人满意。总体而言，该方法为从事心肌缺血/再灌注损伤研究领域的研究人员提供了切实可行且具有重要参考价值的指导。

引言

根据世界卫生组织的数据，冠心病在全球心血管疾病负担中占据重要地位，具有发病率高、死亡率高和并发症发生率高的特点。此外，该疾病的发病年龄呈现日益年轻化的趋势。一些发达国家的统计数据显示，过去十年中，35至40岁年龄组冠心病的发病率增加了约15%–20%。药物溶栓、介入治疗和冠状动脉旁路移植等再灌注方法安全、有效且应用广泛。然而，血流的突然恢复常常会加重缺血心肌的结构和功能损伤，引发一系列不良后果，包括心肌细胞凋亡与坏死、心律失常以及收缩功能障碍，最终导致心肌缺血-再灌注损伤（MI/RI）^1,2。MI/RI的发生率高达25%–30%，其机制尚未完全阐明³。因此，探索有效的预防和治疗策略已成为心血管领域亟需解决的重要问题。

动物模型在心血管疾病研究中具有至关重要的作用。它们是阐明心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI）病理机制以及开发新型治疗策略不可或缺的工具⁴。心肌缺血再灌注损伤动物模型的可靠性与稳定性，直接影响治疗策略在临床实践中的成功转化与应用。左前降支冠状动脉（LAD）是心肌缺血常累及的血管⁵。通过结扎LAD构建的MI/RI模型，在发病机制和病理过程方面与人类心肌缺血再灌注损伤高度相似^6....

方案

实验方案严格遵循陕西中医药大学实验动物使用与机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南（记录编号：SUCML20240820006）。所有动物实验数据均按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行记录。本研究采用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，体重为250 g ± 20 g，年龄为6–8周。实验所用动物、试剂和设备的具体信息列于材料表中。

1. 术前准备

1. 1.1. 进行禁食：让大鼠禁食8小时，可自由饮水。
2. 校准并称重：使用电子天平（精度0.1 g）精确测量大鼠体重，用于计算麻醉剂剂量。
3. 诱导麻醉：使用无菌2.5 mL注射器，按每100 g体重0.4 mL的剂量，于腹中线外侧1 cm处进行腹腔注射20%乌拉坦溶液。
4. 确认麻醉状态：用无菌镊子夹住后肢足掌；若无肢体回缩反射，则表明已进入深麻醉状态。

2. 心电图（ECG）监测（图1，步骤1）

1. 将大鼠固定为仰卧位：使用医用胶带在手术台上将躯干和四肢固定于"四肢伸展姿势"。
2. 连接电极：以下列顺....

结果

心电图（ECG）
从大鼠心脏结扎前直至缺血-再灌注后120分钟，全程记录心电图。心电图变化见图2A。缺血期间，ST段呈弓背上抬，T波高耸尖锐。再灌注后，ST段抬高逐渐回落。

心肌梗死
心肌缺血-再灌注损伤后，常出现左心室扩张。在对照组和心肌缺血-再灌注损伤（MI/RI）模型组的M型超声心动图中（图2B1、B2），可观察到LVIDd和LVIDs显著增加（图2B5、B6）。这种扩张归因于受损的心肌细胞，其损害了心肌的收缩与舒张功能，从而引发心室腔的代偿性扩大。缺血程度越严重，再灌注损伤也越重；因此.......

讨论

冠状动脉结扎是建立心肌缺血-再灌注损伤模型的经典方法，在心血管疾病研究中具有重要意义¹²。自20世纪80年代起，由Yamamoto等人首创的聚乙烯管辅助冠状动脉结扎法已被全球众多科研实验室广泛采用。该方法具有结扎力度可控、操作可视化以及缺血时间精确调控等优势，为心肌梗死病理机制的研究奠定了坚实基础，并推动了大量重要研究成果的产生。然而，该方法也存在不足之处。该术式所需的开胸手术不可避免地会对实验动物的胸腔内结构造成严重损伤，导致术后胸膜粘连。胸膜粘连不仅影响实验动物的呼吸功能，还会干扰对心脏及其相关血管的后续观察^14,15。此外，大量实验数据表明，术后感染率高达35%¹⁶。一旦发生感染，实验动物的健康状况会迅速恶化，不仅影响实验结果的准确性，还可能导致动物过早死亡，使前期实验工作前功尽弃。同时，聚乙烯管长期留置于血管周围会持续刺激血管组织，引发内膜增生。这一现象破坏了血管正常的生理结构与功能，严重阻碍了对再灌注后微循环状态的评.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 mL 胰岛素注射器	无锡宇寿医疗器械有限公司	https://e.tb.cn/h.6NJ9o4dBdpXt4bT?tk=YobMVflhtgI	用于吸收EB并经主动脉弓注入
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	上海源叶生物科技有限公司	S19026	用于心脏染色
2.5 mL 一次性无菌注射器	平安健康医疗科技有限公司	20231230	用于吸取麻醉剂并通过腹腔注射对大鼠进行麻醉；在闭胸手术中用于抽取大鼠胸腔内的空气。
4 % 甲醛	广州维基生物技术有限公司	SW002	用于染色后固定心脏
4-0 缝合线	山东海迪科医疗产品有限公司		用于缝合肋骨、肌肉和皮肤
6-0 缝合线	江苏贝叶生医疗器械有限公司	https://e.tb.cn/h.6NKQ9XNVD1J56np?tk=R8NKVfPJIUM	用于左前降支结扎
针灸针	北京罗亚山川医疗设备有限公司	https://e.tb.cn/h.6NQZzrSfBLQ9OYZ?tk=yW5aVfPuXP3	用于刺穿大鼠肢体皮肤并连接心电图电极线。
动物毛发去除器	金云新概念家居用品有限公司	https://e.tb.cn/h.6NJe67IEMgxPfUt?tk=9boIVflb6mm	用于脱毛
脱毛膏	广州米研社品牌管理有限公司	https://3.cn/2fP-knZw	用于深层脱毛
乙醇	天津天力化学试剂有限公司	https://e.tb.cn/h.6NnxsK8EAvBV1Zu?tk=ja1XVflVhfM	用于消毒
伊文思蓝	Sigma	E2129	用于心脏染色
止血钳	上海爱得医疗仪器有限公司	https://e.tb.cn/h.6NQkHWD25dxnsv4?tk=xA1VVflTXjW	用于固定胰岛素注射器并阻断主动脉弓的血液
医用显微剪刀	南京集小宝贸易有限公司	https://e.tb.cn/h.6NJu33PgNRJCO1L?tk=smZjVflr730	用于切开气管和肋骨
医用显微镊子	南京集小宝贸易有限公司	https://e.tb.cn/h.6Nqn2dyJIUjUN6n?tk=MEMaVflGK0b	用于以6-0缝线结扎LAD
医用手术刀	山东博锐仪器分析有限公司	https://e.tb.cn/h.6NJyfb9CWH5Sj32?tk=HW0kVflEyOL	用于EB-TTC染色过程中心脏的切片
医用剪刀	山东博锐达分析仪器有限公司	该链接为电商平台短链接，不包含需翻译的科学内容。	用于切割大鼠皮肤和缝合。
医用外科布料	河南美得其医疗器械有限公司	https://e.tb.cn/h.6NqItN9yA0xttr9?tk=cCCIVflzFjr	用于提供无菌手术区域
医用胶带	浙江奥泰医疗科技有限公司	https://e.tb.cn/h.6N93etxLPPlJ9ZQ?tk=DfblVflAo5d	用于固定大鼠
医用镊子	江苏视讯医疗科技有限公司	https://e.tb.cn/h.6NreHXQv2YTJkIl?tk=S1imVfO17QV	用于评估大鼠麻醉程度，夹持皮肤、肋骨及其他组织，并剥离皮下肌肉和心包膜。
医用超声耦合剂	青岛海诺生物工程有限公司	https://3.cn/2fPpwB-j	用于提高超声波传输效率
生理盐水	山东齐都药业有限公司	https://e.tb.cn/h.6NMCUFJIti2EsiU?tk=FXBBVfOV1iN	用于清洗残留的脱毛膏
便携式彩色多普勒超声	VINNO Technology Co., Ltd.	Vinno 6	用于大鼠M型超声心动图的测定
聚维酮碘	山东安洁高科技消毒技术有限公司	https://e.tb.cn/h.6NqAb4WsT3xjMb9?tk=mhFxVfO4G1G	用于消毒
大鼠手术板	山东博锐达分析仪器有限公司	https://e.tb.cn/h.6NQyjjGNGInF3Eu?tk=qgQwVflHilH	用于固定大鼠
冷藏冰箱	浙江智兴超低温科技有限公司	DL-78	用于心脏的冷冻保存
硅胶管	山东成武三诺医疗器械有限公司	https://e.tb.cn/h.6N9L82XWNGlgDDG?tk=pWzCVfOQIgN	用于支撑气管
小型动物人工呼吸机	安徽正华生物设备有限公司	DW-3000H	用于帮助大鼠在开胸术后呼吸
无菌棉球	青岛海诺生物工程有限公司	https://e.tb.cn/h.6NJbKVmD0b7QhTf?tk=wMceVfOTrBX	用于乙醇和聚维酮碘浸泡消毒
无菌棉签	青岛海诺生物工程有限公司	https://e.tb.cn/h.6NMAQz1252EJHSM?tk=nyfLVfOUSBi	用于清除胸腔内残留的血液
隔热毯	广东中科生命科学 & 技术有限公司	https://e.tb.cn/h.6N9OyBVWuSXTUDy?tk=d6OqVfOSTlI	大鼠术后保温
开胸手术牵开器	广东中科生命科学 & 技术有限公司	https://e.tb.cn/h.6NQra4Z9UG8dnvo?tk=6eFUVfllCFW	用于暴露手术视野
II型铅制心电图监测仪	成都泰盟科技有限公司	BL-420N	用于心电图监测
乌拉坦	山东科源生化有限公司	U820333	用于麻醉大鼠
水浴恒温振荡器	上海博迅医疗生物仪器有限公司	SHZ-B	用于心脏染色