本文介绍了一种通过超声引导将血管干细胞精确递送至主动脉管壁的实验方案。该技术可有效靶向血管壁，并促进主动脉瘤和主动脉夹层的血管修复。
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摘要
摘要
主动脉瘤和主动脉夹层破裂是危及生命的心血管急症。早期预防和控制疾病进展对于改善患者预后至关重要。血管干细胞在多种血管疾病中的血管损伤修复过程中发挥着关键作用。然而，血管内干细胞注射疗法在确保外源性干细胞有效植入血管壁方面仍面临挑战。
为了探索一种更有效且微创的干细胞递送方法用于主动脉疾病治疗，我们开发了一种超声引导下的精准靶向干细胞递送技术。具体而言，该技术采用超高分辨率的小动物彩色多普勒超声成像系统，精确定位主动脉疾病小鼠模型升主动脉的血管壁。随后，使用29 G针头将1 × 106个mCherry标记的血管干细胞与25 µL Matrigel混合物注射至目标部位。通过小动物超声成像对疾病进展进行监测。最后，取主动脉组织并利用光片显微镜进行三维成像分析，以追踪注射后的血管干细胞分布情况。
上述结果表明，注射的血管干细胞能够以最小的侵入性精确递送至升主动脉的血管壁，从而有效促进主动脉瘤和主动脉夹层的血管修复。这种超声引导的干细胞递送技术为干细胞移植提供了一种具有前景的微创方法，未来有望在临床中用于控制主动脉瘤、主动脉夹层及其他相关心血管疾病的进展。
引言
主动脉瘤和主动脉夹层（AAD）是常见且致死率极高的心血管疾病，通常表现为隐匿性起病和快速进展。AAD 的发病率在 1.3% 至 8% 之间，全球每年约有 150,000 至 200,000 例死亡病例1,2。由于起病急骤且临床症状不典型，许多患者在确诊时已处于危重状态，错过了最佳治疗时机。尽管药物治疗（如 β-肾上腺素能受体阻滞剂和血管紧张素受体阻滞剂）可在一定程度上延缓动脉瘤的扩张，但这些疗法主要提供对症缓解，尚未被证明能有效预防 AAD 的发生或进展3。
目前，临床管理主要依赖于外科干预，包括主动脉根部重建、升主动脉置换、Bentall手术以及主动脉瘤的腔内修复术4,5。然而，对于遗传性主动脉夹层（AAD）患者，特别是尚未达到手术指征的患者，尚缺乏有效的病因学治疗手段，药物治疗也难以控制疾病的长期进展。在马凡综合征（MFS）患者中，尽管药物治疗可延缓主动脉扩张，但研究表明部分个体主动脉扩张速度较快，发生主动脉夹层的风险更高5。因此，为尚未达到手术标准的患者提供有效的干预措施，仍是当前面临的重要临床挑战。开发更具针对性的治疗策略，已成为主动脉疾病治疗中亟需解决的关键问题。
主动脉夹层（AAD）的发病机制主要涉及平滑肌细胞（SMCs）的广泛凋亡以及中膜变薄，从而导致主动脉壁的结构脆弱。具体而言，主动脉SMCs的进行性丢失是AAD的典型特征，表现为SMCs凋亡、细胞外基质（ECM）降解、免疫细胞浸润以及氧化应激水平升高2。血管干细胞是一类存在于血管壁中的成体干细胞，具有分化为SMCs或内皮细胞的能力。在正常生理条件下，干细胞 处于静息状态，但在病理条件下会被激活，通过自我更新和分化参与组织修复6。近年来的研究强调了血管壁干细胞在血管损伤中的关键作用，特别是在静脉移植物重塑、动脉粥样硬化、再狭窄、高血压以及AAD等疾病或病理状态中的作用7,8,9,10,11,12,13。
尽管现有的干细胞递送技术（如组织特异性局部注射和全身静脉输注）已相对成熟，但将干细胞递送至主动脉壁仍面临重大挑战14,15。主动脉内血流速度快，加之血管壁持续的收缩与舒张，使得干细胞难以高效递送，并难以确保移植细胞在血管组织中的长期存活。
在本研究中，我们描述了一种新型的闭合血管壁上膜注射技术，该技术可在超声引导下实现微创、精准靶向的血管壁干细胞递送。该方法具有操作简便的优点，无需开胸或开腹手术，避免了相关并发症的发生。同时，在注射过程中具有更高的灵活性，可将干细胞集中于目标区域，同时最大限度地减少免疫反应及其他副作用。此外，组织光学透明化技术的进展使得小鼠全身体组织的亚细胞分辨率成像成为可能，在组织结构的高分辨率三维重建、病理机制研究、疾病建模及药物筛选等方面具有广泛的应用前景。当与光片显微镜结合使用时，该技术可实现高空间分辨率的三维成像16。利用该方法，我们能够追踪注射后的血管干细胞并观察其迁移能力。因此，超声引导下的干细胞递送代表了一种具有前景的微创干细胞移植方法。
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方案
所有实验操作均遵循首都医科大学动物研究委员会的规定，并经首都医科大学动物福利与伦理委员会批准。
1. 注射用血管干细胞的制备
注意：为了验证血管干细胞注射后的状态及其效应，采用免疫磁珠分选法分离 Sca1+ 细胞（方法如前所述17,18,19），随后用携带 mCherry 报告基因的慢病毒感染，以便后续观察细胞定位与分布情况，然后进行培养。选择第5代或更早代次、生长状态良好且 mCherry 标记的 Sca1+ 表达阳性的细胞用于后续实验20。
- 从6-8周龄小鼠中收获主动脉 周龄C57BL/6J小鼠，在显微镜下分离外膜组织，剪碎至约0.5 mm。在37 °C、5% CO₂条件下，将0.04%明胶涂布于培养瓶底部2 孵育以促进细胞贴壁和增殖。20分钟后，吸除明胶，将剪碎的组织置于培养瓶底部17,21，底部朝上放置2-3小时。待组织紧贴培养瓶后 底部，将培养瓶的底部放置 向下，向烧瓶中加入培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养箱
- 孵育3小时后，取出培养瓶，加入含有20%胎牛血清、10 ng/mL LIF、100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基。
- 3 天后，待细胞从组织中迁移出来 当细胞融合度达到80%–90%时，加入0.05%胰蛋白酶，按1:3比例进行传代培养。
- 第3代传代时，更换为含15%胎牛血清的DMEM培养基；第5代传代时，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基（其他成分保持不变）。
- 消化血管外膜细胞，并在冰上用抗Sca1孵育+ 微珠。将细胞悬液加入配备磁性细胞分选系统的分选柱中，并收集细胞18使用第5代或更早代次且生长状况良好的细胞进行后续实验。
注意：为了确保细胞活力，建议用于 体内 通过台盼蓝染色法测定，注射物的细胞活力应≥90%。 - 注射前1小时，向细胞中加入0.05%胰蛋白酶，用血细胞计数板计数细胞，并在室温下以200 × g离心去除上清液。 g 5 分钟。
- 将细胞重悬于Matrigel中（于4 °C预解冻），细胞浓度为4 × 107 细胞/mL作为干细胞移植的载体，以模拟体内生长环境。轻轻涡旋混匀，并置于冰上保存，直至准备注射。
2. 小鼠术前准备
- 在注射前 12 小时对小鼠进行禁食处理，但不禁水。
- 用 75% 乙醇彻底擦拭麻醉诱导舱和超声平台。
- 涂抹眼膏后，将小鼠放入麻醉诱导舱中，调节氧气流速为 1 L/min，异氟烷浓度调整为 2–3%。待痛觉反射消失，表明麻醉成功后，小心将小鼠从舱内取出。
- 将小鼠的鼻部和口部置于麻醉面罩下，调节异氟烷浓度至 1.5–2%。将小鼠仰卧位固定于 37 °C 的加热平台上，以最大程度暴露腹部。
- 在平台的四个电极上涂抹导电凝胶，并使用医用胶带将小鼠的四只脚掌固定在电极上，以监测生理状态。
注意：操作者需佩戴无菌手套、口罩、手术帽和无菌手术衣。 - 使用无菌棉签将脱毛膏涂抹于注射部位，静置 1 分钟后，用新的棉签轻轻擦去。采用碘伏与无菌生理盐水或酒精交替擦拭三次的方式对注射部位进行消毒。
- 覆盖手术区域，无菌条件下准备无菌注射器，并维持无菌操作区域。
3. 血管壁细胞的超声引导注射
注意：所有超声操作均使用超声成像系统和软件进行（参见 材料表）。使用带有探针的 中心频率 的 40 MHz 和 29 G 针 被使用。
- 将超声平台调整至与地面成约30°角。操作者面向动物右侧，动物头部朝向左侧。在已脱毛并消毒的区域涂抹超声耦合剂。
- 将探头置于胸骨右侧，以显示主动脉弓的长轴。
- 用29 G 针头吸取25 µL含1 × 106个血管壁干细胞的Matrigel悬液。注射前用无菌酒精擦拭针尖，以减少干细胞异位植入的风险。
- 将含有细胞悬液的注射器固定于超声引导注射装置上，确保针头方向与探头对齐，并与胸壁成45°角。
- 缓慢将注射针导入超声视野，调整至焦点平面，并与注射路径标记线对齐。
- 当针尖接近皮肤边缘时，使用钝头镊子夹住皮肤和腹壁，迅速将针穿过胸壁。
- 在超声引导下，将针头引导至无名动脉与主动脉弓之间的外膜 区域。轻轻上下移动注射器以确认针头位置。
- 推动注射器，将细胞悬液注入目标区域。
- 缓慢拔出注射针，并按标准程序对穿刺部位进行消毒。
注意：手术后，应将小鼠置于37 °C加热垫上，直至其完全清醒并能维持胸卧位，在此期间需持续监测。随后将动物转移至铺有新鲜垫料的清洁笼具中。术后24小时内应每小时监测一次，评估是否存在术后并发症，如弓背姿势和活动减少等。
4. 血管组织透明化
- 将标记mCherry的Sca1+干细胞注射至无名动脉与主动脉弓交界处的外膜 区域。4周后，使用CO2处死小鼠，经灌注后收集主动脉组织。
- 将主动脉组织在室温下用4%多聚甲醛固定4小时，随后用PBS洗涤3次，每次1小时。将组织转移至组织透明化溶液中，在37 °C摇床上孵育2天，以实现组织透明。
注：所用组织透明化溶液为10% N-丁基二乙醇胺和10% Triton-X-100溶于ddH2O中的混合液11。 - 用PBS在室温下洗涤组织3次，每次2小时。将组织转移至含CD31一抗（1:100）的PBS溶液中，4 °C孵育24小时。
- 用PBS洗涤3次，每次1小时后，在室温下用驴抗山羊二抗（1:800）孵育组织3–4小时，再用PBS洗涤3次，每次1小时。
- 将组织转移至折射率匹配溶液中，继续孵育至少2天以维持透明状态。
注：所用折射率匹配溶液为45%安替比林、30%烟酰胺和0.5% N-丁基二乙醇胺溶于ddH2O中的混合液11。 - 制备2%琼脂糖凝胶，加热融化后将透明组织包埋于其中，冷却使其保持直径为5 mm的圆柱形结构。将样品固定于光片显微镜载物台上进行三维扫描。成像参数如下：照明物镜：2个10× 0.3数值孔径（NA）水浸镜头；检测物镜：1个10× 0.5 NA多介质浸入式镜头；放大倍率转换器：1x/0.75x。
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结果
超声引导下血管干细胞递送
本研究中，使用小动物彩色多普勒超声成像系统进行超声引导下的注射（图1A、B）。操作过程中，将小鼠固定在加热的超声平台上，并根据需要调整平台和超声探头的位置（图1C）。
图1：超声引导注射装置及小鼠在动物平台上的最佳定位。（A）集成导轨系统的整体结构...
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讨论
由基因突变引起的主动脉瘤和主动脉夹层（AAD）被归类为遗传性 AAD，其中马凡综合征（MFS）最为常见。AAD 是 MFS 最具生命威胁的并发症22。为研究这一病症，我们采用了一种已建立的 MFS 小鼠模型（Fbn1C1041G/+ 小鼠），该模型可自发形成主动脉瘤，非常适合用于早期干预研究。该模型还可避免其他建模方法所带来的额外组织损伤和实验变异性。在本研究中，通过超声引导，将表达 mCherry 标记的 Sca1+ 血管干细胞精确递送至 Fbn1C1041G/+ 小鼠的升主动脉壁。利用小动物超声成像技术监测疾病进展。此外，采用光片显微镜对主动脉进行三维成像与分析，以追踪注射干细胞的迁移情况。我们的结果表明，该方法可有效靶向血管壁，保持干细胞的迁移能力，并显著增强主动脉瘤和主动脉夹层中的血管修复。
干细胞治疗包括静脉输注、直接手术和超声引导下的靶向递送23。由于主动脉的解剖位...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了国家科技重大专项（2023ZD0503304）、国家自然科学基金（32271231）和中国国家重点研发计划（2023YFC3606500）的资助。我们感谢郑超博士在3D成像方面的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 明胶溶液 | OriCell | GLT-11301 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μL 移液器吸头 | Labselect | T-001-10 | |
| 1000 μL 移液器吸头 | Labselect | T-001-1000 | |
| 15 mL 离心管 | Labselect | CT-002-15A | |
| 200 μL 移液器吸头 | Labselect | T-001-200 | |
| 5 mL 微型离心管 | biosharp | BS-50-M | |
| 50 mL 离心管 | Labselect | CT-002-50A | |
| 安替比林 | Macklin | A800873 | |
| 抗 Sca-1 微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-123-124 | |
| Bruker Luxendo MuVi -SPIM 系统 | |||
| CD31 | R&D | AF3628 | 稀释比例 1:100 |
| CUBIC-L | 组织透明化溶液 | ||
| CUBIC-RA | 折射率匹配溶液 | ||
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| 驴抗山羊二抗，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | A11055 | 稀释比例 1:800 |
| FBS | Corning | 35-076-CV | |
| HBLV-mcherry-PURO | HANBIO | ||
| 匀浆管 | Labselect | HGT-003-200 | |
| 图像引导针头注射装置 | Visualsonics | ||
| 胰岛素注射器 | BD | 328421 | |
| 异氟烷 | Ameixin | LAT-YFW | |
| 光片显微镜 | Bruker Luxendo | MuVi-SPIM | |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Microscan MS400 换能器 | Visualsonics | ||
| 小鼠操作与生理监测平台 | Visualsonics | ||
| N-丁基二乙醇胺 | Macklin | N802391 | |
| 烟酰胺 | Macklin | N814605 | |
| PBS | biosharp | BL302A | |
| 普拉洛贝眼科软膏 | EQUL | 1703321138 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 台盼蓝染色液 | Solarbio | C0040 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| Vevo 2100 成像系统 | yiswelsonics | ||
| Vevo 集成导轨系统 II | yiswelsanics |
参考文献
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