Method Article

通过实验设计和自动化工作流程实现基因编码生物传感器设计空间的高效采样

DOI:

10.3791/68448

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October 17th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Manchester Institute of Biotechnology (MIB), Department of Chemistry, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议提供了一种通过自动化辅助遗传文库生成和评估对基因编码的生物传感器进行系统全局优化的方法。这与实验设计方法相结合，以简化实验并能够选择遗传成分，以调整生物传感器以适应特定的设计结果。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因编码的生物传感器是高通量信息处理的强大工具，能够将环境或化学输入信号转导到各种输出中。这允许在广泛的生物技术应用中对基因表达进行动态传感、直接控制和微调调控，包括酶优化、菌株开发和微生物过程控制。为了使它们适合用途，可以通过修改生物传感器电路组件（例如，转运蛋白、输入和输出模块）的化学计量和/或调整相关的宿主-生物传感器分子间相互作用（例如，DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质）来改进生物传感器的性能。然而，在这里，大量可能的生物传感器排列创造了一个复杂的组合设计空间，需要仔细优化筛选策略，以确定提供所需表型性能的配置。生物传感器的性能特征（例如可调性）进一步加剧了这种复杂性，这需要在单克隆筛选条件下进行效应子滴定分析。因此，探索不同序列和实验空间的需要使得分数抽样方法特别适合此目的。支持该工作流程的是实验设计 （DoE） 算法，这些算法能够很好地实现基于统计的高效结构化映射和对这种组合实验设计空间进行分数抽样。

其中报告了一种结合高通量自动化和计算方法，用于有效地对基于变构转录因子的生物传感器的设计空间进行采样，以提供具有数字和模拟剂量反应曲线的不同配置。该协议从启动子和核糖体结合位点文库的创建和自动选择开始。这些库及其相应的表达式数据被转换为结构化的无量纲输入，从而允许对整个实验设计空间进行计算映射。然后使用 DoE 算法进行分数采样，并使用高通量自动化平台与效应器滴定分析相结合。该工作流程为未来生物传感器系统和遗传回路的开发和优化提供了一个不可知论的框架，为合成生物学界提供了一个监管工具包。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

调节基因表达的能力是所有生命形式的基本功能，促进对内部和外部影响（从化学效应器到生物物理刺激）的动态、实时反应1。在自然界中发现的无数转录调节系统在合成生物学促进代谢工程和生物技术研究的增强和加速方面具有巨大潜力。在原核生物中，细胞中发生的大部分调节是通过变构转录因子（aTF）与许多小分子效应子2的相互作用驱动的单组分调节机制控制的。aTF通常由效应子结合结构域（EBD）和DNA结合结构域（DBD）组成，在与特定的小分子效应子结合时充当分子开关，调节其DBD对位于基因组启动子区域的特定DNA纵子序列的亲和力，从而导致转录的激活或抑制3.这种看似简单的机制催生了许多不同的调节策略，从抑制/去抑制系统到能够检测和响应数量惊人的小分子效应子或环境刺激的激活剂4。因此，合成生物学利用这种多样性来构建基因编码的生物传感器，能够将大量输入信号耦合到定制输出中，即荧光报告蛋白的产生和合成途径的调节。当应用于生物技术工作流程时，此类系统能够实时监测细胞内代谢物浓度、动态调节途径和易于读数，有助于开发更有效的途径、菌株和生物过程5,6,7,8。

从根本上说，生物传感器根据许多参数进行表征，包括特异性，作范围，动态范围，灵敏度和斜率，生物传感器的剂量反应曲线通过输出信号将这些参数描述为配体浓度的函数（图1）9,10,11,12 .希尔方程可用于拟合生物传感器的性能特征，为上述每个参数提供半经验证据，从而提供了一种表征生物传感器系统的方法，同时也能够评估调整系统以实现应用驱动的结果所需的工作。特异性可以定义为与一系列其他潜在效应分子相比，一个效应器诱导的信号输出的相对差异，并且通常在 aTF 的 EBD 水平上进行调制。工作范围定义为生物传感器能够感知的配体浓度范围，决定了生物传感器能够响应的浓度范围。相比之下，动态范围描述了最高可测量激活 （ON） 状态与失活 （OFF） 状态的比率，是确保生物传感器可靠地报告高于背景自发荧光10 的效应器浓度的重要参数。效应分子的灵敏度被描述为引发特定输出信号所需的浓度，由效应器13的一半最大浓度（EC50）测量。最后，曲线的斜率由aTF在启动子处的作位点的协同性（nH）表示，并产生更数字或模拟的响应输出曲线。合作性源于配体结合的aTF之间的蛋白质-蛋白质相互作用，形成多聚体复合物，增强对作位点的亲和力，导致电路的响应性急剧增加，配体浓度饱和，响应曲线更加数字化14。

生物传感器的剂量响应特性会显着影响其应用的适用性，并且通常是任何概念应用的“成败”点。生物传感器的性能因系统而异，工作范围通常在 0.1nM-10mM13 之间变化，而动态范围可以从 1.4-2000 倍15 不等。此外，虽然报告的 aTF 效应化合物数量广泛（代谢产物、氨基酸、金属、抗生素、群体传感等）11，它并不是包罗万象的，当文献中尚不存在适合其效应器的生物传感器时，这给研究人员带来了挑战。合成生物学使生物传感器能够设计出应对此类挑战，允许调整效应器范围和剂量反应特性，以更紧密地与应用的研究成果保持一致，并已分别用于解决上述两个问题，16,17。工程的两个关键领域可以通过合成生物学进行靶向，即生物传感器的启动子区域和 aTF 本身，在转录和蛋白质水平上介导它们的作用。专注于生物传感器的遗传元素以调节启动子水平的性能的方法包括RBS，作位点和-35，-10（六角盒）的工程设计，以调整灵敏度，作和动态范围，并且是本手稿中概述的方法的重点（图1）。或者，通过分析其效应子结合域和参与效应器协调的残基突变（使用序列同源性和/或结构生物学）来改变生物传感器的选择性和灵敏度，可以调节其对同源效应子的反应18,19,20或将其完全改变为感兴趣的非同源效应子16,17,21.然后，这种调整工作可以将生物传感器引导到特定的应用，这些应用通常是代谢控制器（反馈回路、控制电路）、初级筛选工具（酶或菌株发现）、二级筛选工具（酶变体筛选、代谢工程）和转运蛋白生物勘探 22,23,24.其中一个例子涉及使用粘蛋白酸响应性 aTF CatM 与工程启动子序列相结合，以提高动态和作范围。该系统与荧光激活细胞分选相结合，以根据适应性实验室进化25的GFP荧光分离出最有效的粘康酸生产菌株。

虽然上述工程策略的成功是不言而易见的，但合成生物学家可用于调整生物传感器的杠杆的相互依赖性可能会使设计过程复杂化并延长生物传感器开发所花费的时间，这可能会阻止一些研究人员将生物传感器实施到他们自己的工作流程中。如图1所示，尝试通过修改六角盒来调整生物传感器以适应特定结果可能会无意中衰减其他参数，这种相互依赖性是生物传感器工程中公认的挑战12。生物传感器调优的常见方法包括合理设计和定向进化工程，前者依靠对系统结构和机制特征的先验理解，将实验重点放在成功可能性高的组件上;而后者依赖于随机诱变和自然进化与高通量筛选相结合，以选择表现出优化特征的变体26,27,28,29,30。虽然有效，但这两种技术也存在一些缺点：例如，通过关注特定的结构或功能元素，有针对性的工程，容易对整个实验空间的有限探索，并且可能忽略变构或次要效应30。非靶向文库生成和筛选虽然非常适合以非指导方式优化设计，几乎不需要前期设计工作（即文库设计和生成），但确实需要偏向于有用的突变。如果没有这种偏差，预计更大比例的突变可能是有害的，需要更多的筛查31。因此，不仅考虑生物传感器组成部分（aTF、RBS、作部位和六角盒）的主要影响，还考虑这些组件如何相互作用以影响生物传感器参数的整体方法非常有吸引力。

结构化多变量实验和统计建模方法已广泛应用于过程工程工作流程中，以便使用尽可能少的实验次数来询问多维实验空间。这种方法结合了实验和建模，称为实验设计（DoE），至关重要地使研究人员能够优化复杂的多变量过程以获得定义的结果，同时不需要广泛的先验知识23,30。虽然通常应用于结构化实验探索更容易的连续变量的优化，但DoE也已用于遗传水平的代谢途径优化31,32,33。这涉及一个初始筛选步骤，其中选择被认为对预期结果最重要的因素，然后是优化步骤，通过调整所选因素以获得所需的输出，在这种情况下，优化特定的生物传感器参数以扩大其应用范围。至关重要的是，该技术可以与自动化液体处理器平台相结合，以将筛选通量提高到103 - 104的中型文库，从而在数据驱动的基础上全局优化生物传感器性能23。下面，我们描述了一种实施 DoE 驱动的生物传感器优化方法的协议，该方法与液体处理机器人技术相结合，以简化文库生成、筛选和数据收集，以全局优化生物传感器灵敏度。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. RBS/启动子部件设计

  1. 确定生物传感器特定的调控元件，这些元件可以作为 DoE 过程中的连续变量进行系统调整。将这些监管元素分组为不同的模块。这可以包括调节效应子转运、转录因子表达和/或输出基因表达的模块。确保每个模块可由启动子或RBS在转录和/或翻译水平上调节（例如，分别为RBS反式，Preg，RBS输出和P输出）。
  2. 确定选定启动子和RBS区域内的关键功能位点，例如十六进制盒、作位点和RBS序列。
    注意：文献中存在许多表征启动子和 RBS，以创建来自 34,35,36 的文库。然而，对于未表征的启动子序列（通常是 Preg 启动子），如果文献中没有可用的可调基因序列元件，请参阅下文以获取定位可调节基因序列元件的进一步步骤。
    1. 通过具有所需传感输入的 aTF 的 BlastP 搜索 ，找到 包含感兴趣的生物传感器序列的其他纵子。提取aTF的基因间区域及其调控基因，获得启动子序列。
      注意：启动子序列的位置和数量将根据所使用的aTF类别而有所不同。
  3. 使用多个序列比对工具和其他基序软件在假定的启动子中搜索保守基序，例如六盒和作位点。基于启动子序列分析，选择核苷酸序列进行简并碱基的随机化，例如，N = 任何东西，R = 任何嘌呤，Y = 任何嘧啶等。
    注意：读者被引导至源出版物，了解有关启动子分析和碱基随机化的更多详细信息23。

2. 零件库组装和验证

  1. 设计和订购引物，以特异性扩增所需的表达载体，以允许在荧光标记物（例如 GFP）上游插入启动子/RBS 序列变体。到达后将冻干引物稀释至终浓度为 100 μM，在无菌去离子H 2O 中。
    1. 根据特定聚合酶的参数，在PCR管中的冰上组装PCR反应混合物。确保使用高保真聚合酶来防止突变携带到表达载体的骨架中。根据引物的需要和所需PCR产物的长度调整退火温度和延伸时间。
    2. 通过凝胶电泳 分析 PCR 产物，并使用 PCR 纯化或凝胶提取试剂盒纯化线性化载体。测量线性化载体DNA的浓度并储存在-20°C。
  2. 订购设计的变体文库（RBS 或启动子）以单链简并寡核苷酸的形式插入线性化载体中，在 5' 和 3' 末端均具有 30 bp 质粒同源臂，以靶向同源重组到表达载体中。
    1. 到达后，将冻干的寡核苷酸重悬于无菌去离子H2O中，终浓度为100ng / μl。
  3. 使用在线计算器确定线性化载体和变体库的等摩尔量的体积。确保反应的最终体积为 20 μL，并且使用插入片段与载体的 2：1 摩尔比。
    1. 在冰上解冻等分试样的商业 Gibson 组装预混液 （X2），并根据所选计算器提供的体积将反应组装在 PCR 管中。
      注意：Gibson 预混液也可以在实验室37,38 中制作。
    2. 将 10 μL 2x Gibson 预混液加入 DNA 片段中，并在 50 °C 下在热循环仪或类似设备中孵育 1 小时。
    3. 将所有 20 μL 连接产物应用于微量离心管中的 200 μL 感受态大肠杆菌。 在冰上孵育 30 分钟，然后在 42 °C 下热休克 45 秒。
    4. 将细胞放回冰中2分钟，将800μL含有分解代谢物抑制（SOC）培养基的超最佳肉汤加入管中，并让细胞在摇动培养箱中在37°C下恢复1小时。
    5. 将 50 μL 转化细胞铺展到多个 60 mm Luria-Bertani （LB） 琼脂培养皿上，并选择相关的抗生素。将板在37°C下孵育18小时。
  4. 检查板中的转化体，计算代表理论文库多样性 3 倍的菌落数量，以捕获每个变体的充分表示。如果菌落数量低/零，则优化等温组装。
    注意：在考虑由高保真试剂或合成生成的理想文库时，需要过采样。这通常是库总大小的 3 倍。例如，4 个简并位置 （NNNN） = 44 = 256 个唯一序列。因此，刮擦 ~768 个菌落。
    1. 将所需数量的菌落刮入单个无菌 125 mL 烧瓶中，其中装有 25 mL 补充有适当抗生素的 LB 培养基。将烧瓶在37°C下在摇动培养箱（180rpm）中孵育18小时，确保培养物在这段时间过去后明显致密。
    2. 使用质粒 midi-prep 纯化试剂盒从制备的转化体培养物中纯化变体文库。测定质粒文库DNA的浓度;下游步骤需要 1-10 μg。确保使用无菌去离子 H2O 洗脱文库 DNA。
      注意：超过这一点的步骤将侧重于 恶臭假单胞 菌（P. putida）表达宿主中变体文库的克隆和验证;使方案适应其他宿主可能需要修改孵育时间、孵育温度和转化方法。
  5. 通过从甘油原液中剥离并将板在30°C下孵育18小时，制备所需表达宿主 恶臭假单胞菌 的LB琼脂平板。
    1. 从LB琼脂平板中挑选一个臭 恶魔菌 落，接种10mL LB培养基，并在30°C下生长18小时，振荡180rpm。
    2. 通过将生长的培养物在18°C下以4000× g 离心2分钟来制备细胞以进行电能力。倒出上清液，重悬于 1 mL 无菌去离子 H2O 中，并将重悬的细胞转移到无菌微量离心管中。
      注意： P. putida 细胞在沉淀时应呈粉红色。
    3. 在微量离心机中以 4 x g 离心细胞 1 分钟，倒出上清液，重悬于 1 mL 无菌去离子 H2O 中。再重复离心和重悬步骤 4 次。
      注意：在洗涤过程中倒出上清液时可能会发生细胞丢失;这是正常现象，不应影响产量。
    4. 将 100 μL 洗涤的细胞转移到 0.2 cm 电穿孔比色皿中，向比色皿中加入 1-10 μg 质粒文库 DNA，然后混合。
    5. 打开电穿孔器，确保 0.2 cm 比色皿的电压设置为 2.5 kV，将比色皿插入电穿孔室，并脉冲。
    6. 将 900 μL SOC 培养基加入比色皿中，混合细胞，然后将细胞转移到无菌微量离心管中。让细胞在30°C下在摇动培养箱中恢复2小时。
  6. 将 50 μL 转化细胞铺展到补充有相关抗生素的 LB 琼脂的大方形培养皿 （230 mm） 上，并在 30°C 下孵育 18 小时。
    注意：确保文库板上的菌落密度适中（2-3 CFU/cm2）。这将取决于细菌的能力和电镀量。如果太低，则可以使用转化的优化或连续的几轮转化来增加菌落数量。
  7. 从所有转化板中选择 25-50 个菌落进行序列验证。使用在简并序列中扩增的引物，通过 PCR 扩增该区域，并将其送去进行 Sanger 测序，以评估序列多样性以及多克隆性。
    注意：如果多克隆性成为问题，将转化分布在含有 1 μg DNA 的多批比色皿中有助于减少这种影响。

3. 部件库克隆筛选 - 自动化

  1. 液体处理器设置
    1. 在液体处理器平台上创建 7 个程序，以确保移液密集型步骤变得简单。
    2. 创建“MTP 液体转移”程序，确保液体处理器设置为将可调节体积的液体从准备好的储液器移液到其布局中的空微量滴定板 （MTP） 中。
    3. 创建“将甘油添加到 MTP”程序，确保液体处理器被编程为将 100 μL 体积的 50% 甘油移液到板中，确保分配和抽吸速度为 5-20 μL/s。
      注意：创建了一个单独的程序来解释 50% 甘油的较高粘度，如果不加以控制，这可能会导致气泡形成、抽吸不完全或由于飞溅而导致邻近孔的交叉污染。
    4. 创建一个“DWB 液体转移”程序，将液体处理器设置为移液到具有可调节体积设置的深孔块 （DWB） 中，并确保液体处理器从预装储液器中移液。
    5. 创建一个“从解冻的 MTP 中接种”程序，确保液体处理器被编程为从含有选定菌落的解冻 MTP 中吸出 5 μL，并将其转移到布局中相应的 DWB 板中。
      注意：密切注意布局中的 MTP 和 DWB 排列，确保事件的逻辑顺序，以避免意外的双重接种或错过板。
    6. 创建一个“转移到测定 DWB”程序，确保液体处理器设置为将 5 μL 细胞从一个 DWB 板位置转移到另一个 DWB 板位置。然后，程序必须重复此动作 4 次，每次转移接种不同的板位置，即 P1 -> P2、P1 -> P3 等。
      注意：该程序确保将 96 个变体无缝传代培养成不同的测定浓度。
    7. 创建一个“测定设置 - PBS 重悬 （DWB）”程序，确保液体处理器用 500 μL PBS 移液布局中的每个 DWB，该程序还必须包括一个混合步骤，以确保细胞沉淀正确重悬。
    8. 创建“检测设置 - 细胞和 PBS 添加 （MTP）”程序，确保该程序包括将 200 μL 重悬细胞从一个 DWB 板位置转移到空 MTP 位置的步骤。
      注意：对于 3.1 的所有步骤，编程和液体处理器布局都会有所不同;研究人员应参考特定商业液体处理器的手册来修改上述程序，以适应实验的能力和需求。
  2. 变异文库培养和条形码
    1. 确定理论文库大小并计算单个变体的数量，以确保文库覆盖率> 95%（建议使用 3 倍文库大小）（参见步骤 2.5 的注释）。
    2. 根据要筛选的菌落数量计算所需补充抗生素的LB培养基体积（每个菌落200μL + 10%以上）。
    3. 打开液体处理器软件，然后单击 MTP 液体传输程序旁边的运行（参见补充文件 1）。将准备好的培养基放置在相应的储液器位置，并根据布局用空的 MTP 填充甲板。将程序设置为分配 200 μL 培养基。点击 OK 确认程序启动。
      注意： 在确认程序启动之前，请务必确保将储液罐和吸头充分供应给液体处理器平台，以防止中断。
    4. 根据需要多次重复该程序，用透气膜密封填充的 MTP 以保持无菌。
    5. 将填充的MTP板转移到菌落选择器平台上并打开密封，同时将用质粒变异文库DNA转化的 恶臭假单胞菌 的方形板转移到菌落选择器平台上。使用菌落选择器将来自转化文库板的单个菌落接种每个预装微量滴定板孔。
      注意：确保琼脂的最小深度为25mL，以避免损坏菌落采摘头。
    6. 重新密封并将接种板转移到 30 °C （800 rpm） 的摇动离线培养箱中，确保湿度控制在 75% 以避免培养物蒸发。让它们生长 16 小时。
      注意：孵育后，培养物在肉眼看来会明显致密，如果不是这种情况，请重新检查培养基和抗生素要求。
    7. 生长16小时后，将生长的板放回液体处理器平台并打开密封。单击“将甘油添加到 MTP”方案旁边的“运行”（参见补充文件 1），确保屏幕上的板布局与液体处理器底座的布局相匹配。单击确定并允许协议运行。
    8. 完成后，再次密封板并在离线摇动培养箱（800 rpm）中短暂混合5分钟，然后条形码并储存在-80°C。
    9. 重复步骤 3.2.7。和 3.2.8。直到所有MTP都添加了甘油，混合，条形码并储存在-80°C下。
      注意：此时可以暂停协议，为以下表征步骤做准备。此外，可以计划将板块分到不同的实验运行中，以适应使用中的液体处理器平台的容量或一次性减少工作量。
  3. 变异文库筛选
    1. 计算要填充的DWB数量所需的抗生素补充培养基体积（每孔~495μL + 10%以上）。
    2. 单击 DWB 液体传输程序旁边的运行（参见补充文件 1），确保将介质添加到程序布局中的正确储液罐中。确保将空 DWB 添加到相应的布局位置，并且有足够的提示供应。将程序设置为分配 495 μL 培养基。准备就绪后，单击“确定”启动程序。
    3. 用透气膜密封填充的DWB并转移到4°C的临时储存中，重复步骤3.3.2。直到用介质填充了所需数量的 DWB。
    4. 单击“从解冻的 MTP 中插入”程序旁边的“运行”（参见补充文件 1），确保根据布局将 MTP 低温储液和填充的 DWB 转移到液体处理器平台。确保提供足够的提示供应。单击“确定”以初始化程序。
      注意：仅当准备好先决条件程序和板以确保细胞的最佳活力时，才将储备板在冰上解冻30分钟。
    5. 程序完成后，用透气膜密封接种过夜的DWB，并转移到湿度控制为75%的离线摇板培养箱中，并在30°C（180rpm）下生长过夜16小时。
    6. 按照步骤 3.2.8 重新密封、混合并将冷冻储存 MTP 放回 -80 °C 冰箱中。
    7. 重复步骤 3.3.4。到 3.3.6。在接种所需数量的过夜 DWB 并将其转移到培养箱之前，需要多次。
      注意：建议记录每批板何时添加到培养箱中，以考虑接种期间运行之间的时间滞后，并对下游步骤使用相同的顺序。
    8. 根据要筛选的过夜DWB数量（每孔495μL+超过10%）计算补充有不同浓度效应子和抗生素的所需培养基体积。每种效应器浓度都需要在液体处理器中单独的储液器。
      注意：对于初始表征，例如 ON/OFF 筛选，两种效应器浓度就足够了（例如，0 和 1000 μM 终浓度）。为了生成剂量反应数据以进行更稳健的表征，该范围增加到至少四种浓度（例如，0、1、25 和 1000 μM 终浓度）。阻遏器系统不需要添加效应器来确定功能，而对于激活剂，例如概述的系统，需要效应器。
    9. 单击 DWB 液体传输程序旁边的运行（参见补充文件 1）。根据布局，确保含有效应器补充培养基的储液器处于正确的位置。将空的 DWB 添加到液体处理器平台中。确保平台有足够的提示。准备就绪后，单击“确定”以启动协议以生成测定 DWB。
    10. 填充后，用透气膜密封测定DWB并转移到4°C的临时储存中，并用更多的空板重新填充液体处理器平台。
    11. 根据需要多次重复步骤 3.3.9 和 3.3.10，直到填满所需数量的 DWB。
    12. 单击“转移到检测 DWB”程序旁边的“运行”（参见补充文件 1）。确保将含有效应子补充培养基的未密封测定DWB添加到液体处理器布局中的正确位置。
    13. 转移并打开含有步骤3.3.4中接种的生长的 恶臭假单胞菌 的过夜DWB。到液体处理器平台，再次确保严格遵守布局。确保平台有足够的提示。准备就绪后，单击 “确定 ”以启动协议。
      注意：传代培养物的转移和排列到测定板中通常需要分批进行，具体取决于液体处理器平台的大小。
    14. 程序完成后，应用密封并将测定板转移到30°C的离线培养箱中，湿度为75%，持续16小时（180rpm），此阶段的最终测定体积为500μL。
    15. 接种后丢弃过夜DWB，并根据需要重复步骤3.3.12至3.3.14，直到所有必需的测定DWB都已接种并在离线培养箱中生长。
    16. 从培养箱中取出DWB，转移到离心机中，并在4000 x g，18°C下沉淀细胞5分钟。倒出上清液并将离心的DWB置于液体处理器平台上。
      注意：细胞沉淀体积可能因效应器浓度或变体而异，此外，某些沉淀在眼睛中可能比其他沉淀更明显。
    17. 根据要筛选的DWB数量计算所需的1x PBS体积（每孔500μL + 10%以上）。
    18. 单击测定设置 - PBS 重悬 （DWB） 程序旁边的运行（参见补充文件 1），将分配体积设置为 500 μL，确保将 1x PBS 添加到正确的储液器中，然后根据液体处理器的布局排列离心板。确保有足够的提示可用。单击“确定”启动程序。
      注意：洗涤细胞以去除残留的生长培养基，这可能会产生一些自发荧光。
    19. 重新密封并从液体处理器上取下重悬的板。通过检查板的底面，确保颗粒完全重悬。继续将颗粒状的DWB转移到液体处理器中，并重复步骤3.3.18。直到所有板都被重新悬挂。
    20. 单击“检测设置 - 细胞和 PBS 添加 （MTP）”程序旁边的“运行”（参见补充文件 1）。从步骤 3.3.18 中转移重新悬浮的 DWB。根据建议的布局进入液体处理器。根据布局将空的 MTP 转移到液体处理器中。确保分配体积设置为 200 μL，并且有足够的吸头可用。单击“确定”启动程序。
    21. 将填充的 MTP（最终测定体积 200 μL）转移到离线多模式酶标仪中，测量板中每个孔在适当激发发射波长（例如，sfGFP lEx/lEm = 488/520）和 OD600 下的相对荧光。
      注意：激发发射波长设置将取决于表达载体中编码的荧光基因的选择。确保酶标仪上的增益设置始终一致，并能够区分低变体和高变体，而不会使检测器饱和。
    22. 重复步骤 3.3.20。和 3.3.21。直到所有测定DWP都转移到MTP并进行测量。

4. 数据处理/转换和差异排名

  1. 通过将记录的GFP荧光（RFU）除以每个评估的效应器浓度（0和1000μM）的每个变体的记录OD600 测量值，对收集的数据进行归一化。
    注意：大多数酶标仪都可以编程为在数据收集期间自动将荧光归一化 OD600 。
  2. 通过将 1000 μM （ON） 处的 RFU/OD600 除以 0 μM （OFF） 处的 RFU/OD600 来计算 ON/OFF 以获得每个变体的动态范围。使用基础生物传感器结构的 ON/OFF 将所有变体 ON/OFF 值绘制为散点图，以确定表现出高于基础水平活性的变体。
    注意：根据野生型序列23的初始表征，方案中使用的初始生物传感器构建体的开/关被确定为3.6倍。
  3. 为了进行深入的表征，使用具有可变斜率的希尔函数拟合剂量反应数据，以使用分析软件提取EC50和/或希尔斜率值。
    注意：要估计灵敏度和 EC50，请收集至少四个数据点，这些数据点跨越响应从低激活过渡到高激活的范围，通常是曲线的最陡峭部分。虽然更多的数据点可以提高分辨率和准确性，但四个点足以估计灵敏度排名。
  4. 从完整的变体集中，选择变体的子集（例如，N = 100），以确保平衡覆盖所需排名，在本例中为 EC50。为此，请识别 EC50 中跨越广泛范围的变体，确保高排名和低排名的变体按比例代表。删除多余的变体（例如，排名相似且对分发覆盖范围影响最小的变体）。
  5. 选择最终变体样本库（例如，N = 100）后，使用以下线性对数（lin-log）变换方程（等式1）对数据进行变换。
    式1：
    figure-protocol-1
    哪里
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  6. 对于 EC50 值，将 +1 分配给最高值（最不敏感），将 -1 分配给最低值（最敏感值）。几何平均值 0 对应于中间表达水平。

5. 最终筛选设计生成/DoE

  1. 要系统地探索生物传感器设计空间，请使用最终筛选设计 （DSD）。这种设计是首选，因为它能够有效地探索设计空间，同时根据特定的系统需求定制研究。
  2. 单击 DOE 类别 ，然后在统计软件中选择最终 筛选设计 按钮（参见 补充文件 2）。
  3. 通过单击“连续”按钮并命名它们，将实验因子（例如RBStrans、Preg、RBSout和Pout）定义为连续变量，确保将值设置为+1和-1（参见补充文件3）。
  4. 通过单击“ 添加响应 ”按钮并自定义名称来定义所需的响应（例如，ON、OFF、ON/OFF、EC50、斜率）（参见 补充文件 4）。
    注意：通过单击目标下拉列表来设置响应的目标，根据设计的目标（例如，探索与优化）选择无或最大化。
  5. 定义因子和响应后，单击 继续 以打开设计选项选项卡。选择 “无需块”，然后单击“ 进行设计 ”按钮（参见 补充文件 5）。
    注意：可以添加块以使设计免受滋扰因素（非主要关注因素）的影响。这会增加实验的复杂性;但是，它的使用由研究人员自行决定。
  6. 该软件将生成一个实验设计表，概述要测试的因素的具体组合。来自相应 lin-log 转换库的遗传部分将用于生成相应的 17 个构建体。通过单击“ 制作表 ”保存并导出设计表（参见 补充文件 6）。

6. 重复步骤 2 - 设计和组装 DoE 知情的遗传设计

  1. 根据最终筛选设计（DSD）计划开始构建多变量质粒。
    1. 确定初始变量（例如，启动子、RBS 等）。设计和订购引物以线性化表达载体，确保引物位于目标可变区域的两侧，确保去除任何预先存在的序列元件。
    2. 设计和订购引物，这些引物将特异性扩增与每个调节节点的预定义文库水平（例如，-1、0、+1）相对应的变异序列（Pout Preg RBSout RBStrans）。确保每个引物都包括与表达载体插入位点互补的 30 bp 同源臂。
    3. 通过 miniprep 从 相关冷冻储备培养物中纯化质粒 DNA，对应于已鉴定变量的 +1、0 和 -1 文库水平。
  2. 在冰上设置线性表达载体和文库片段的 PCR 反应，并确定产物浓度，如步骤 2.1.1 和 2.1.2 中所述。
    1. 重复方案的步骤 2.3 至 2.4，以执行线性化表达载体和文库片段的 Gibson 组装。确保在此阶段使用标准尺寸的培养皿。
    2. 使用Sanger测序筛选菌落，以确认每个建议的DSD设计的正确构建体组装，然后进行 P. putida 的转化（步骤2.5-2.6）。
    3. 使用 PCR，确认转化菌落中存在正确的质粒。挑选确认的转化体并将它们接种到补充有抗生素的 10 mL LB 中，以便在 30°C 下过夜生长 18 小时 （180 rpm）。创建冷冻储备液（25% 甘油最终）并储存在 -80 °C。

7. 筛选和数据合理化

  1. 从冷冻库存中，将用相关DSD设计构建体转化的 恶臭假单胞菌 划到补充有抗生素的LB琼脂上，在30°C下孵育18小时以生长菌落。
    1. 从每个板中挑选三个与建议的DSD设计相对应的单个菌落，并在30°C下在10mL补充有抗生素的LB培养基中培养过夜18小时。
    2. 第二天，加载具有每行 0 mM 至 1 mM（终浓度）的效应器浓度梯度的 DWB，每孔总体积为 50 μL。将过夜培养物以 1/100 稀释到新鲜的 LB 中，并沿浓度梯度向 DWB 中加入 450 μL 培养物。
    3. 手动重复步骤 3.3.14 和 3.3.16 以获取增长的 DWB，然后跳到并手动执行步骤 3.3.18、3.3.20。和 3.3.21。以获取每个建议变体的 RFU/OD 数据。
  2. 使用 Hill 函数（具有可变斜率）拟合剂量反应 （RFU/OD） 数据，提取适当的参数（因子）进行优化，例如 EC50、Hill 斜率、动态范围或作范围。将结果数据转换为log10，并将提取的参数输入到每个测试设计的DSD表中。
    1. 进行两级筛选分析，以确定影响生物传感器性能的重要因素。使用 Lenth 的 t 比和半正态图分析23， 30 来确定哪个因子偏离了预期分布并保留在模型中。保持遗传的影响，确保任何仅在相互作用中显着的因素也单独包括在内。
    2. 对每个响应变量独立进行标准最小二乘回归 （SLSR） 建模30 ，仅纳入已识别的显着因素。评估回归模型诊断，包括残差图、拟合缺失检验和 R² 值，以确保数据拟合正确。
    3. 使用响应分析仪根据所需的生物传感器特性确定最佳因子设置。为每个响应定义目标函数（例如，最大化动态范围，同时最小化 EC50），以生成因子设置，在考虑系统约束和权衡的同时，在所有响应中实现最佳平衡。
  3. 返回变体库，按照协议的步骤6.1至6.2，根据响应分析器建议的模块构建优化的生物传感器。通过剂量反应表征 验证 优化构建体的性能。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最初，必须选择被认为会影响生物传感器功能的模块以进行变异;这可以包括对转运蛋白的调节，这会影响配体的细胞内浓度，从而影响生物传感器的输出，但也包括 aTF 本身的相对转录和翻译水平，以及荧光报告基因或输出基因（图 1）。 图 2 展示了开发基于 DoE 的生物传感器优化实验时使用的典型工作流程;首先将调控元件组织成不同的模块，这些模块可以通过合成生物学 通过 序列水平的改变进行作，特别是在操作员位点、六盒或RBS'（图2A）。因此，DoE工作流程的下一步是序列位点的随机化，以生成变体文库（图2B）。必须仔细考虑随机化程度，因为筛选的菌落数量应与随机化程度 4N 成正比，其中 N 等于随机化碱基位置的数量。在DoE中将每个唯一的启动子或RBS序列视为唯一的分类变量将使所需构建体的数量增加到实验上不可行的水平，因为通过表征文库将这种转换为连续变量是衡量通过随机化获得的功能范围并定义上、中、 以及功能下限。这首先是通过分析文库的输出来实现的，作为通过报告基因衡量RBS或启动子变体强度的指标（图2C）。如图所示，执行 lin-log 转换，将连续变量离散化为水平，DoE 可以使用这些水平来探索不同的组合，并开发描述这些变体影响的模型。然后使用3个水平实施筛选设计，以组合方式描述每个因子的活性范围（图2D）。通过对建议设计的组装和测试，有效地探索了实验空间，揭示了因素之间的相互作用。对结果数据进行统计分析用于确定哪种因素组合对生物传感器输出影响最显着，SLSR用于预测系统在不同标准下的行为，从而促进生物传感器针对特定结果进行优化，例如增加动态范围或灵敏度（图2D）。

图3 演示了aTF调节的启动子文库的组装和筛选。使用简并寡核苷酸进行等温组装以创建质粒编码文库，其中每个质粒在特定位置被唯一随机化。文库多样性的程度最终将决定要筛选的菌落数量，较大的理论文库规模将从自动化中受益匪浅。与 TphR 同源纵子的启动子序列分析提供了碱基保守图，用于告知随机化位置，特别是显示出一定程度变异的碱基，因此可以调节活性，但不是绝对必要的23.除了作部位的六个碱基外，-35 和 -10 六角盒中的每个碱基中的三个碱基被作为完全随机化的目标（图3A），导致理论启动子库为 ~500,000。质粒文库随后用于转化宿主菌株。在这个阶段，良好的转换效率至关重要，以便通过常见的故障排除方法获得足够的文库覆盖率 图3B.优化DNA浓度、转化方法和克隆设计可以显着提高转化子产量。 图3C 展示了获得转化体后的典型工作流程，在开始任何表征工作之前，必须首先在培养基中生长与独特变体相对应的单个菌落。为了覆盖理论文库大小，需要挑选大量变体并将其排列到板中。利用液体处理器和菌落采摘机等自动化系统可以使这一劳动密集型步骤变得微不足道。步骤 1 图3C 说明了将生长培养基转移到已手动装入液体处理器底座的 MTP 中，然后由菌落拣选机自动接种。某些阶段，例如密封板并将其转移到离线培养箱，是手动的，但如果需要，也可以自动化。随着培养物的生长，液体处理器也可用于通过添加甘油来生成冷冻储备液，如图所示 图3C.在此阶段，板的条形码将确保每个拾取的变体都将链接到特定的板和孔位置，从而能够轻松参考以进行进一步的下游表征。除了减少劳动力之外，自动化方法的主要优势之一是减少人为错误，文库准备阶段的错误不太可能被遗留。第 2 步 图3C 说明文库制备的自动表征阶段。这开始了 via 使用液体处理器平台用培养基填充DWB，然后使用条形码冷冻库存进行接种。此阶段的自动化再次确保将移液错误和劳动力降至最低。然后将板密封并手动转移到离线培养箱中进行生长，此时可以开始将效应子化合物排列到新鲜的深孔板中。对于零件库的初始筛选，可能需要一个简单的 ON/OFF 屏幕，因为它可用于预筛选表现出与基础结构相同或更差活性的非功能性变体，并丰富那些表现出增强活性的变体池。这还有一个额外的好处，即降低吸头和板的材料成本，这在大型文库筛选方案中可能会变得令人望而却步。然而，在需要优化更复杂的生物传感器性能指标的情况下（例如，EC50），将需要额外的效应器浓度。随着培养物的生长，将板返回到液体处理器平台，该平台开始接种含有效应化合物的板，然后在测定期间再次手动返回培养箱。 图3D 演示数据收集之前的最后一个自动化步骤。在生长和生物传感器激活的时间过去后，将板从离线培养箱中取出并返回液体处理器平台。为了去除可能干扰荧光数据收集的残留生长培养基，需要离心，去除上清液，并用1x PBS洗涤细胞。使用液体处理器可以再次使这一过程变得简单，通过培养物的自动重悬，可以快速处理板，包括将洗涤后的细胞转移到 96 孔格式的 MTP 中进行筛选。数据收集可以以手动或自动方式执行，一些读卡器具有板堆，可以与液体处理器连接，以进一步自动化数据收集过程。通过比较存在效应器 （ON） 与不存在效应器 （OFF） 时生物传感器激活的比率，使用生物传感器激活程度（倍数变化）评估 5,000 个变体以确定生物传感器功能;只有活性高于碱基构建体（3.6倍）的变体才被推进进行进一步表征，如散点图的红粉色阴影区域所示（图3D).根据富集变体池的板和孔位置，然后可以通过参考工作流程步骤 1 中生成的原始条形码冷冻原液板，使用生物重复或不同效应器浓度进行稳健表征。

图 4 展示了从初始文库筛选中筛选分类的变体，旨在开发用于优化灵敏度的启动子文库。使用来自上一个工作流程中筛选的 5,000 个变体的数据，从初始 ON/OFF 屏幕中确定比亲本序列更活跃的 226 个变体的分类池，然后进一步表征并根据其敏感性进行排名，以便作为可以设计 DSD 的水平。作为第一步，必须将分类变量（在本例中为 Pout top 变量）转换为跨越宽敏感性范围的连续变量。为了筛选灵敏度，需要剂量反应曲线从绘制的希尔函数中获得 EC50 数据;这大大增加了电镀工作，并且非常适合使用液体处理器的自动化，以简化测定设置和筛选过程，如 图4A所示。按照 图 3C 的步骤 2 中建立的工作流程，使用与富集的变体池相对应的板条形码和孔位置来接种充满生长培养基和抗生素的 DWB。为了增强实验稳健性，对生物一式三份筛选了变体。将板转移到离线培养箱进行生长后，使用液体处理器用0,1,25和1000μM效应子补充生长培养基填充新鲜DWB以减少劳动力。为了减少测定所需的板数量，选择了包含曲线底部、中间和顶部的浓度范围，中点浓度揭示了每种变体的相对灵敏度，如 图4A所示。在接种每种效应器浓度的变体池并分析荧光和OD600后，绘制剂量反应曲线，并使用非线性回归分析确定EC50。在此阶段，生成了具有唯一EC50 值的每个变体的原始文库，并选择了前100个最稳健的变体，如 图4B 所示，以进一步减小文库大小。然而，在将该库用于 DoE 之前，必须生成将唯一变体转换为排名库，表示其中包含的灵敏度范围。这是通过对数据执行lin-log转换来实现的，该转换对数据进行排名和重新缩放，以便每个变体从最敏感（-1）到最不敏感（+1）进行排名，并定义一个中点值（0），它代表数据集的几何平均值图 4C。原始数据的转换产生了 图4D所示的蓝色图，从中，对应于+1、0和-1的离散P输出 序列被作为P输出 因子水平前进到最终筛选设计中。

图5 演示了文库生成后从DSD生成到建模以及基于DoE辅助学习的生物传感器全局优化的完整工作流程。 图5A 将典型的生物传感器分解为 3 个模块，具有 1 个（传输和调节器模块）或 2 个（输出模块）调节节点。以 图4，RBS 或启动子库将被开发出来，并选择范围为 +1、0 和 -1 的水平以涵盖每个因子的最大变化。筛选的文库的大小通常决定了充分探索设计空间所需的实验数量，例如，如果每个文库的大小为 22，则相当于 224 （234,256） 种组合。DoE 旨在通过结构化筛选设计减少组合数量来简化实验工作量。虽然有许多方法都是可能的，但DSD是生物传感器开发的理想选择，因为它可以识别主要因素和双因素相互作用，同时避免混杂的二阶效应。此外，由于 DSD 设计使用 3 个水平，因此可以估计曲率（非线性）。 图5A 演示了典型的 DSD 输出，其中 4 个模块中的每一个都设置为不同的电平;由于每个水平对应于特定的启动子或RBS变体，因此等温组装用于生成与DSD推荐设计相对应的遗传构建体。在用推荐的构建体组装和转化宿主菌株后，然后使用全范围的效应器浓度获得剂量反应曲线，以对每个构建体的性能提供更大的信心 图5B.由于 DSD 大大减少了构建体的数量，因此此步骤通常可以手动执行，也可以根据需要使用自动液体处理器执行。 图5C 显示从 DSD 屏幕构建和测试建议组合并构建基于希尔系数 （nH） 和 EC50 每个测试组合的输出。该实验的目的是开发一种生物传感器结构，该结构针对H 和 EC50 通过调节 4 个调节节点的表达来最大化这两个参数。每个调节因子都显示在自己的列中，表达程度沿x轴指示，对应于lin-log转换的启动子和RBS部件库（-1至+1）。改变节点表达式对两个 EC 的影响50 和 nH 由子图中的曲线表示。剖面图突出了生物传感器优化通常不直观的性质，即一个调节节点的调整可能会对输出参数产生相反的影响。例如，苏格兰皇家银行反式 与 n 没有很强的相关性H,然而，它与 EC 呈正相关50 以非线性方式。在RBS的情况下，还隐含了高阶（非线性）相互作用外 强度的增加将增加斜率（更高的 nH）伴随灵敏度增加（较低的 EC50），从而产生具有更数字斜率的曲线，并且对效应器浓度增加的反应更敏锐。从这些模型中，可以更清楚地呈现生物传感器调整的不直观方面，从而能够优化调节节点以实现全局最佳。这些模型用于预测两个 EC 的全局最优50 和 nH ，图中的红线表示每个调节节点的最佳水平（图5C). 图5D 展示了初始亲本生物传感器结构（蓝色）与性能最佳的 DSD 设计（绿色）和全局优化结构（丁香色）相比的剂量反应曲线。使用该模型预测理想模块强度，以最大化 EC50 和 nH，对应于 RBS 的变量反式 （-1）、P注册 （-0.7）、P外 （-0.3）和RBS外 （+1）强度被组装并表征，优化后的结构显示出EC的增强50 和 nH (图5D).虽然 DSD 和全球优化的生物传感器都显示出相似的 EC50 （0.8 vs 0.7 μM），nH 在不影响 EC 的情况下得到了显着改善50 已经取得的成果。结果清楚地证明了数据驱动设计相对于基于直觉的方法的优势，并有助于验证 DoE 作为简化和简化生物传感器调整过程的一种手段。

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图1：基因编码的生物传感器参数的调整。 基因编码生物传感器的遗传模块布局，包括 aTF、作位点 （OS）、六盒 （-35、-10） 和 RBS 组件。彩色框对应于通常影响生物传感器参数的相互作用，例如：配体-aTF 亲和力（灰色）、aTF 操作员（粉红色）、RNAP-Hexbox（绿色）和 RBS（橙色）。每个参数对剂量反应特征的影响在代表性图表中显示。 请点击此处查看此图的大图。

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图 2：典型的 DoE 生物传感器优化工作流程概述。 （A）生物传感器组件的模块化概述，显示编码转运蛋白以导入目标效应器的运输模块、与aTF相关的调节模块以及编码报告蛋白（如sfGFP）的输出模块。还显示了调节节点，例如 RBS反式、Preg、Pout 和 RBSout， 它们对应于将进行随机化以探索生物传感器参数的遗传节点。（B） 选择适合碱基随机化的序列元件，包括启动子和 RBS'。启动子的亲本序列显示在顶行，最终的突变体序列如下所示，星标表示碱基未改变，而 K、M 和 N 分别指鸟嘌呤/胸腺嘧啶、腺嘌呤/胞嘧啶或任何核苷酸。启动子通过靶向六盒或作位点提供更大的随机化潜力，还可以包括复制或修改序列间距。RBS文库提供更有限的随机化选项，但是，由于其最大多样性较小，它们更容易筛选。（C）表征变异的表达水平，然后转换为排名lin-log库，以将分类变异因子转换为3个离散水平，这些水平更适合通过DoE 进行 分析。（D）使用每个模块的三个级别的多重组合来执行实验空间的映射，以生成一个模型，该模型可用于为设计选择提供信息，以调整生物传感器性能以达到预期结果，这可以是动态范围，也可以是灵敏度。 请点击此处查看此图的大图。

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图3：生物传感器模块化，启动子库构建和自动化工作流程。 （A）aTF启动子中特定序列的随机化并通过等温组装 插入 生物传感器构建体的示例。粗体字母表示在简并寡核苷酸合成过程中根据提供的键在操作员位点或六角盒中随机化的位置。（B）描述所得生物传感器变体文库转化为克隆宿主（如 大肠杆菌 ）的面板，以及取决于转化体产量的后续步骤。转换效率低会导致理论库覆盖率差和设计空间探索不足。在此阶段进行故障排除对于确保大部分变体可用于表征至关重要，并概述了常见的故障排除措施。（C）方案中概述的步骤1和2的工作流程，红色指针符号表示手动步骤，齿轮表示自动步骤。第 1 步工作流程重点介绍了方案中从菌落选择到冷冻原液生成的关键步骤。步骤 2 工作流程演示了冷冻储备液的恢复和重新排列，以便通过剂量反应曲线进行测定。（D）展示筛选前最终程序的面板，包括在测量荧光和OD之前洗涤细胞并转移到测定板。面板中显示了 5000 个筛选的变体库，其中显示 ON/OFF 的变体超过了橙色框中突出显示的亲本启动子序列（3.6 倍）。可以看到许多变体聚集在 1 附近，表明性能差且变异性低，这可能是由于序列水平的随机化导致功能丧失。图中显示的 226 个变体被带入框中，以进行稳健的表征。数据改编自 Alvarez Gonzalez 等人的原始出版物23. 请点击此处查看此图的大图。

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图 4： 通过 lin-log 转换筛选启动子库顶部变体和离散化。 （A） 为 RBS 或启动子文库生成表达数据的标准程序概述。使用代表良好表达水平范围的分类变体，液体处理器用于生成预填充预定浓度效应器的测定板，从中得出分类的 226 个变体的剂量反应曲线。（B）在EC50 测定并将表征文库进一步减少到100个变体后，数据被绘制为条形图，显示启动子随机化产生的不同灵敏度的混合。（三）使用 lin-log 速率方程对 EC50 数据进行转换，以将连续数据集转换为更适合 DSD 中分解的分类数据集。（D） 转换后的 EC50 变体数据现在显示为简化的尺度，并从 EC50 活性从高到低排名。由此，选择对应于顶部 （+1） 几何平均值 （0） 和底部 （-1） 变体的 3 个水平，并将被结转到 DSD 以探索实验空间。 请点击此处查看此图的大图。

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图 5：DSD 实验设计、测试和基于模型的学习成果。 （A）示意图工作流程，显示基于RBStrans、Preg、Pout和RBSout模块的lin-log转换排名库生成DSD设计表。DSD设计表建议了最小数量的组合，以有效地映射实验空间。给出了一个示例输出，其中 +1、0 和 -1 指的是每个调节节点的顶部、中间和底部性能变体，如 lin-log 变换所述。这些通过等温组装构建并通过测序确认，然后转化为表达宿主进行表征。（B）转化后，细胞生长并针对广泛的效应子浓度进行测定，并测量荧光输出以生成剂量反应曲线。从剂量反应曲线中提取各种参数，例如 nH 和 EC50，并输入 DSD 以生成每个因素的预测模型。（C）使用这些模型，可以预测通过改变任何调节模块的表达水平来调节一个生物传感器参数的影响。重要的是，调节节点的全局调整成为可能，从而能够同时最大化一个或多个生物传感器参数，由每个子图中的红色虚线表示。（D）将模型优化为最大灵敏度，产生全局优化的结构（淡紫色），其剂量反应曲线与性能最佳的DSD结构（绿色）和亲本生物传感器结构（蓝色）绘制。提取的n、H和EC50参数显示在图下方，表明这两个参数都比性能最佳的DSD结构有所改进，验证了从DSD生成的预测模型的有效性。数据改编自 Alvarez Gonzalez 等人的原始出版物23.请点击此处查看此图的大图。

补充图 1：用于生物传感器文库制备和测定设置的自动液体处理方案步骤。请点击此处下载此文件。

补充图 2 到补充图 6：逐步生成最终筛选设计 （DSD）。请点击此处下载此文件。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

包含广泛遗传变异性的遗传元件库对于基于 DoE 的方法的成功至关重要。如 图2A所示，理论变异的数量随着诱变目标位置的数量以及随机化程度的增加而增加，这种不断增加的文库大小造成了重大的筛选瓶颈。减少目标位置的数量或随机化程度可以减少需要筛选的变异的数量，并且如果需要更有针对性的调整方法，或者如果存在重要的系统先 验 知识作为指导，则是一种有吸引力的方法。然而，对于像生物传感器这样的系统，它们具有许多重叠的特征或可能没有明确表征的遗传元素，因此很难规避文库大小要求。使用自动液体处理器可以减轻采摘菌落和培养变体的工作，特别是当需要增加数据点收集来绘制更高级的功能（如剂量反应曲线）与两个数据点比较器（例如 ON/OFF）时。虽然很难具体量化包含自动化工作流程所节省的时间， 其实施的主要好处在于可以用于其他平行实验的时间38.

尽管如此，在许多文库大小超过 104 的情况下，即使是液体处理器辅助方法也变得不切实际39。在这种情况下，使用流式细胞仪对变体进行初步筛选是一种极具吸引力的方法，其分选能力要大得多，可达每小时 10个 7 个细胞40。在进行更广泛的表征之前，使用具有两轮正选择和至少一轮阴性选择的荧光激活细胞分选（FACS）已常规用于对生物传感器的最佳性能变体进行分类16,26,42。利用 FACS 制定和执行此类协议已在其他地方进行了详细审查31.如上述方案所述，可以使用基于板的液体处理器测定进行初始分类筛选;通过使用单一效应器浓度比较开/关数据，如图3D所示，只能选择具有明显功能增益（方法中提供的3.6倍）的变体生物传感器进行进一步详细的表征，简化文库开发和实验运行时间。然而，FACS和液体处理器平台都为实验室带来了大量的资本投资，并且通常需要一定程度的技术专业知识来作和维护。基于琼脂平板的筛选提供了较低的技术和财务进入壁垒，并已与 gfp 或蓝白菌落筛选结合使用，以根据荧光强度选择 RBS 文库变体以及酶突变体43,44。然而，这些变体在可以有效筛选的变体数量上也受到限制，但也需要荧光的显着差异才能检测到44。作为同时对多个元件进行完全组合同时突变之间的折衷方案，“分而治之”方法旨在将大型变体文库拆分为更易于管理的筛选块41。虽然模块化方法可能是实用的，但它并不能有效地探索组合设计空间，因为众所周知，生物成分的性能高度依赖于上下文，特别是在转录和翻译偶联普遍存在的细菌中。这可能导致针对局部最大值而不是全局最优值的设计选择。

特定诱导剂的运输和识别是生物传感器开发的另一个重要特征，值得一提，尽管不是概述的方案的主要焦点。缺乏适合靶分子的 aTF 对研究人员来说是一个重大挑战。合理选择结合目标效应子的结构类似物的现有aTF可以提供一个理想的模板，在该模板上应用密码子随机化，以调整aTF对所需效应子的特异性17。将目标序列与已解决的结构或 Alphafold 预测比对可以识别具有可疑氨基酸残基的效应结合位点，并经过半理性随机化和排名，适用于协议17。同样，负责效应子导入/输出的转运蛋白的选择和调节可以显着改变生物传感器剂量反应特征。转运蛋白基因表达被发现是生物传感器反应的重要参与者，多样化的Ptac 启动子和RBS文库控制MucK转运蛋白的表达，用于在多轮FACS中稳定其表达，增强生物传感器反应的稳健性17。类似地，筛选不同的转运蛋白本身可以调节生物传感器的特异性，使用PCA响应生物传感器筛选一组假定的PcaK转运蛋白，从而鉴定出两种能够独特地摄取3,5-羟基化底物的转运蛋白，从而扩大该系统可检测的化合物集24。

当将DoE原理与深度学习模型相结合时，自动化平台可以成为表征和探索的更强大的工具46,47。在首先探索了具有高通量平台的生物传感器的设计空间后，已利用机器学习算法以良好的准确度预测未表征序列的功能 47。该协议中概述的方法可以很容易地应用于用于启动子设计的新语言学习模型的测试，类似于基于跨RBS序列预测开发的模型48。此外，此类模型的集成可以利用非功能启动子设计中包含的序列功能数据，并为整个生物传感器的更广泛功能提供关键见解。也就是说，这将有可能解决 DoE 工作流程的一个关键限制，即误报（例如，无功能启动子）不一定等同于测量的零输出，存在诸如虚假转录或将噪声元素引入 DoE 数据等现象，这很难识别和控制。至关重要的是，为了涵盖整个实验设计空间，任何生成的库都必须表现出广泛的活动，因为活动范围不足将导致设计输出倾斜，并在从数据集30生成的任何统计模型中产生不可靠性。如果低文库变异性成为一个问题，可以探索其他序列元素或增加随机化程度，并且可以比较文库之间的变异，直到获得合适的变异池。

DoE 过程的一个重要方面涉及正确估计和选择从 DSD 获得的主要和次要影响，然后将其纳入统计分析。DoE是一种基于建模的方法，极易出现过度拟合和偏差，这可以通过将迭代工程工作引导到设计空间的次优部分而迅速使优化过程复杂化49。因此，确保任何设计在构思阶段和数据分析阶段都能稳健地免受此类影响至关重要。在初始筛选设计阶段，所有因素都设置为几何平均值（即0,0,0,0）的中心运行可以通过更好地考虑非线性相互作用来帮助减少模型偏差，同时不会增加显着的实验负担（1-3次额外的运行）49。此外，包括随机设计可以帮助解释未包含在实验设计中但仍可能影响正在测量的响应变量的无关变量。在生物学背景下，随机化解决了时空效应（例如板位置）或批次间变化等问题，防止此类影响显着影响数据解释。在这个早期阶段关注这些细节可以提高模型的鲁棒性并得出更可靠的结论。在进行 DSD 建议的实验后，需要对数据进行统计分析，以阐明那些对输出参数有重大影响的因素。半正态图提供了效应幅度的直观可视化表示，没有显着性的影响通常沿着一条直线下降，而具有显着影响的效应将偏离这条线，从而能够在生物传感器优化中轻松选择最重要的因素。考虑到这一点，与所有建模一样，应采取保守的效果选择方法，以降低模型过度拟合的风险。

快速设计和优化生物传感器和其他遗传回路的能力将大大加快生物技术领域的研究步伐，例如菌株和酶开发，以及实时诊断。该领域基于DoE的筛选方法的出现特别有希望，有助于有效利用时间和资源，同时探索最大可能的设计空间，并且已经在代谢途径和生物传感器的遗传回路优化中取得了巨大效果31,33,34,51.DoE 特别适合多因素优化问题，其中许多一阶、二阶甚至三阶相互作用在起作用，否则很难用典型的一次一个因素的实验设计方法来询问。此外，设计生物传感器的一个方面的努力经常无意中导致牺牲另一个参数，例如以牺牲动态范围为代价提高灵敏度51。通过 DoE 绘制此类隐藏交互以及创建预测生物传感器行为的模型的能力，构建测试学习周期大大加快。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GAG 和 PLR 得到了 BBSRC DTP 赠款 （BB/M011208/1） 的支持。MC 得到了 BBSRC 响应模式赠款 （BB/P01738X/1） 的支持。我们还要感谢亨利·罗伊斯先进材料研究所（由 EPSRC 拨款资助。EP/R00661X/1、EP/S019367/1、EP/P025021/1和EP/P025498/1）的访问权限。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1000 &微;L CO-RE 吸头，无菌非过滤汉密尔顿 235939
2.2 mL 96 深孔板，带 V 形底部的方形孔热11594754
300 &微型;L CO-RE 吸头，堆叠式 NTR，无菌汉密尔顿 235985
96 孔透明底部，黑色微量滴定板格雷纳 655097
琼脂糖 Invitrogen16500100
组装的质粒 DNA用户提供 那
ClarioStar Plus 酶标仪 BMG的那
右纽氯肽（dNTP）溶液混合物 NEBN0447L
二甲基亚砜（DMSO） Fisher BioReaggents BP231-100型
DNA 分子量标准 100bpNEBN3231L
DNA分子量标准 1KBNEBN3232L
DNA测序 来源：生物科学那
DNA合成 IDT那
大肠杆菌 DH5&α;能效细胞NEBC2987H
凝胶上样染料，紫色 X6 无 SDSNEBB7025S型
基因脉冲发生器/微脉冲发生器电穿孔比色皿，间隙 0.2 厘米Biorad 1652082
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LB 肉汤（米勒）与琼脂 西格马L3147型
MicroPulser电穿孔器 Biorad 1652100
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液NEBE2621S型
Q5 高保真 DNA 聚合酶NEBM0491S型
QIAprep 离心 Midiprep 试剂盒QIAGEN 12143
QIAprep 离心小型制备试剂盒QIAGEN27104
QIAquick凝胶提取试剂盒 QIAGEN28706X4
QIAquick PCR纯化试剂盒 QIAGEN28104
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SOC生长培养基 NEBB9020S
SYBR 安全 DNA 凝胶染色剂Invitrogen型号 S33102
TAE缓冲液（Tris-乙酸酯-EDTA，50X） 赛默飞世尔 B49
UltraPureTM不含 Dnase/Rnase 的蒸馏水 Invitrogen10977015

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