本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。
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摘要
摘要
G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的跨膜受体家族，在细胞信号转导中发挥关键作用，可将胞外刺激转化为胞内反应。GPCR的激活会引起构象变化，从而使其能够与异源三聚体G蛋白相互作用。受体激活后，G蛋白α 亚基发生GDP-GTP交换，从而与G蛋白解离βγ 二聚体并触发下游信号级联反应。为研究G蛋白偶联受体（GPCR）介导的G蛋白激活，基于生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer, BRET）的生物传感器是一种高度敏感且非侵入性的方法。Schihada等人开发的基于G蛋白的三顺反子活性传感器（G-CASE生物传感器）通过检测异源三聚体的解离来间接反映激活状态，可在单质粒转染条件下实现对GPCR活性的实时监测，从而克服了共转染策略的局限性。相较于基于荧光的技术，BRET检测具有背景噪声低、光漂白效应弱以及灵敏度更高等优势。在本实验方案中，基于BRET的G-CASE生物传感器被应用于活细胞体系，并在96孔板中进行检测。具体而言，我们评估了β2-肾上腺素能受体（β2-AR）和1型大麻素受体（CB1R）在G蛋白激活方面的活性。通过瞬时转染β2-AR的HEK 293T野生型细胞以及稳定表达CB1R的HEK293T细胞，验证了Gs 和 Gi3 G-CASE生物传感器已得到验证。本方案支持该方法在药理学研究和高通量GPCR筛选中的应用，以更深入地理解配体激活特定信号通路的能力，例如 通过 偏向性信号转导，从而促进新型治疗化合物的发现。
引言
G蛋白偶联受体（GPCR）是最大的跨膜受体超家族，负责将胞外刺激信号转导为胞内信号级联反应，从而引发特定的生物学响应。GPCR是关键的药理学靶点，约30%的上市药物作用于GPCR1。GPCR配体结合会诱导受体发生构象变化，促进其与异源三聚体G蛋白和/或GPCR激酶（GRKs）及β-阻遏蛋白（β-arrestins）相互作用，从而启动下游信号传导或受体内化过程2。
异源三聚体G蛋白是G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的主要细胞内媒介，由三个亚基组成：Gα、Gβ和Gγ。根据Gα亚型的不同，这些异源三聚体可分为四类——Gi/o、Gs、Gq和G12/13，每类激活不同的信号通路：Gi/o亚型抑制腺苷酸环化酶，而Gs亚型则刺激其活性，Gq亚型激活磷脂酶C-β，G12/13亚型则调控Rho家族GTP酶。
GPCR 的激活会引发其构象重排，从而在亚秒级动力学时间内快速招募 G 蛋白。该过程诱导 G 蛋白发生构象变化，促进 Gα 亚基中的 GDP-GTP 交换。....
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方案
本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 培养板接种（第1天）
注意：所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩内进行，以维持无菌条件。使用白色孔板并配以透明平底，以便观察细胞生长和存活情况。请使用完整的白色孔板，避免在步骤 3.2.1 中使用贴纸。
- 酶标板包被
注意：可使用预包被板以跳过此步骤。- 将约 6 mL 经无菌过滤的聚-L-赖氨酸（PLL）溶液（0.01%）倒入多通道储液槽中。使用多通道移液器，向 96 孔白色酶标板的每孔加入 60 µL PLL 溶液。
- 将酶标板置于避光处，孵育 20 分钟。
- 在孵育期间，按照步骤 1.2.1–1.2.3 的描述开始细胞制备。
- 用多通道移液器吸除 PLL 溶液，并将溶液转移至 15 mL 离心管中，于 4 °C 保存。
- 用 DPBS 洗涤酶标板三次，以去除未结合的 PLL，避免其可能导致细胞降解。
- 细胞制备与接种
- 在含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 ....
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结果
实验设置与操作的通用示意图详见图2。使用G-CASE生物传感器评估了两种GPCR在配体激活后对Gs或Gi/o家族蛋白的激活情况。首先研究了一个典型的A类GPCR，即在HEK 293T细胞中瞬时转染的β2-肾上腺素受体（β2-AR）。当将激动剂（例如异丙肾上腺素）施加于共表达β2-AR和Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞时，观察到BRET信号呈浓度依赖性下降，表明Gs蛋白被激活（图3B）。随着配体浓度增加，ΔBRET值逐渐降低直至达到饱和，配体刺激后约5分钟出现平台期。相比之下，转染空载体pcDNA3.1质粒及Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞对异丙肾上腺素刺激表现出微弱且无统计学意义的相反反应（图3B）。在本方案中，绘制的是配体刺激15分钟后获得的数据。为确保结果的一致性和不受时间点选择的影响，应测试其他时间.......
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讨论
本实验方案描述了使用BRET生物传感器实时测量活细胞中G蛋白在特异性配体刺激GPCR后激活情况的方法。该方法基于生物发光供体-受体能量转移原理，能够检测受体激活后异源三聚体G蛋白的构象变化及其解离过程，为研究GPCR信号转导提供了可靠且灵敏的平台。本方案可适用于多种GPCR家族，包括B类和C类GPCR以及孤儿GPCR10,12。本文以A类GPCR中的β2-AR和CB1R为例报告了实验结果。
G蛋白偶联受体（GPCR）在其相应激动剂的刺激下会招募G蛋白，最终导致其解离为两个亚基：一侧为Gα，另一侧为必需的Gβγ二聚体。在本实验方案中，可通过检测与不同G蛋白组分相连的BRET配对分子所介导的G蛋白解离过程，来监测GPCR的激活状态。
实验结果表明，基于BRET的G-CASE生物传感器在配体刺激β2-AR或CB1R后，可有效检测Gs或Gi
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
HEK-CB1 细胞由 M. Guzman（西班牙马德里康普顿斯大学）惠赠，β2-肾上腺素能受体质粒由 D. Perrais（法国波尔多神经科学跨学科研究所 IINS）惠赠。Gi3-CASE 和 Gs(short)-CASE 由 Gunnar Schulte 惠赠（Addgene 质粒 # 168122；Addgene 质粒 # 168124）。部分示意图使用 BioRender.com 制作。本研究得到法国高等教育与研究部以及法国国家科研署（ANR）PolyFADO（ANR-21-CE44-0019）、AlzCaBan（ANR-24-CE44-4647）和 SCHIZOLIP（ANR-22-CE44-0034）项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级96孔培养板，白色，带透明平底，带盖，Greiner bio-one | Dutscher | 655983 | |
| BrightMax ClearLine 白色封膜 | Dutscher | 760245 | |
| ClarioSTAR LVF | BMG Labtech | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D4540 | |
| 不含氯化钙和氯化镁的改良型DPBS，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养 | Sigma | D8537 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）GlutaMAX | Sigma | D0822 | 使用前在37 °C 水浴中预热 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F9665 | |
| Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Venus | Addgene | 168122 | https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ 由Gunnar Schulte惠赠 |
| Galphas（短亚型）-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Venus | Addgene | 168124 | https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ 由Gunnar Schulte惠赠 |
| 稳定表达CB1R的HEK-293T细胞（HEK CB1） | 由M. Guzman（西班牙马德里康普顿斯大学）惠赠 | ||
| 野生型HEK-293T细胞（HEK wt） | |||
| 异丙肾上腺素 | Sigma | I6504 | 溶于H2O中，储存于–20 °C |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基，含GlutaMAX补充剂 | Fischer | 11564506 | |
| pcDNA3 Flag β2-肾上腺素受体 C端标签载体（pcDNA3 Flag beta-2-adrenergic-receptor tag FLAG C-ter） | 由D. Perrais（IINS，波尔多）惠赠 | ||
| pcDNA3.1-(空载体)-TAG | Addgene | 138209 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液（PLL） | Sigma | RNBL7086 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | T3924 | |
| WIN-55,212-2 | Cayman Chemicals | 10009023 | 溶于DMSO中，储存于–20 °C |
参考文献
- Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
- Zhang, M., et al. G protein-couple....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/68463
