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方法文章

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

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DOI:

10.3791/68463

2025年11月7日

本文内容

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摘要

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下,对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例,展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。

摘要

G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的跨膜受体家族,在细胞信号转导中发挥关键作用,可将胞外刺激转化为胞内反应。GPCR的激活会引起构象变化,从而使其能够与异源三聚体G蛋白相互作用。受体激活后,G蛋白α 亚基发生GDP-GTP交换,从而与G蛋白解离βγ 二聚体并触发下游信号级联反应。为研究G蛋白偶联受体(GPCR)介导的G蛋白激活,基于生物发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)的生物传感器是一种高度敏感且非侵入性的方法。Schihada等人开发的基于G蛋白的三顺反子活性传感器(G-CASE生物传感器)通过检测异源三聚体的解离来间接反映激活状态,可在单质粒转染条件下实现对GPCR活性的实时监测,从而克服了共转染策略的局限性。相较于基于荧光的技术,BRET检测具有背景噪声低、光漂白效应弱以及灵敏度更高等优势。在本实验方案中,基于BRET的G-CASE生物传感器被应用于活细胞体系,并在96孔板中进行检测。具体而言,我们评估了β2-肾上腺素能受体(β2-AR)和1型大麻素受体(CB1R)在G蛋白激活方面的活性。通过瞬时转染β2-AR的HEK 293T野生型细胞以及稳定表达CB1R的HEK293T细胞,验证了Gs 和 Gi3 G-CASE生物传感器已得到验证。本方案支持该方法在药理学研究和高通量GPCR筛选中的应用,以更深入地理解配体激活特定信号通路的能力,例如 通过 偏向性信号转导,从而促进新型治疗化合物的发现。

引言

G蛋白偶联受体(GPCR)是最大的跨膜受体超家族,负责将胞外刺激信号转导为胞内信号级联反应,从而引发特定的生物学响应。GPCR是关键的药理学靶点,约30%的上市药物作用于GPCR1。GPCR配体结合会诱导受体发生构象变化,促进其与异源三聚体G蛋白和/或GPCR激酶(GRKs)及β-阻遏蛋白(β-arrestins)相互作用,从而启动下游信号传导或受体内化过程2

异源三聚体G蛋白是G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导的主要细胞内媒介,由三个亚基组成:Gα、Gβ和Gγ。根据Gα亚型的不同,这些异源三聚体可分为四类——Gi/o、Gs、Gq和G12/13,每类激活不同的信号通路:Gi/o亚型抑制腺苷酸环化酶,而Gs亚型则刺激其活性,Gq亚型激活磷脂酶C-β,G12/13亚型则调控Rho家族GTP酶。

GPCR 的激活会引发其构象重排,从而在亚秒级动力学时间内快速招募 G 蛋白。该过程诱导 G 蛋白发生构象变化,促进 Gα 亚基中的 GDP-GTP 交换。....

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方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 培养板接种(第1天)

注意:所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩内进行,以维持无菌条件。使用白色孔板并配以透明平底,以便观察细胞生长和存活情况。请使用完整的白色孔板,避免在步骤 3.2.1 中使用贴纸。

  1. 酶标板包被
    注意:可使用预包被板以跳过此步骤。
    1. 将约 6 mL 经无菌过滤的聚-L-赖氨酸(PLL)溶液(0.01%)倒入多通道储液槽中。使用多通道移液器,向 96 孔白色酶标板的每孔加入 60 µL PLL 溶液。
    2. 将酶标板置于避光处,孵育 20 分钟。
    3. 在孵育期间,按照步骤 1.2.1–1.2.3 的描述开始细胞制备。
    4. 用多通道移液器吸除 PLL 溶液,并将溶液转移至 15 mL 离心管中,于 4 °C 保存。
    5. 用 DPBS 洗涤酶标板三次,以去除未结合的 PLL,避免其可能导致细胞降解。
  2. 细胞制备与接种
    1. 在含 10% 胎牛血清(FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中,于 37 °C、5% CO2 条件下培养 ....

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结果

实验设置与操作的通用示意图详见图2。使用G-CASE生物传感器评估了两种GPCR在配体激活后对Gs或Gi/o家族蛋白的激活情况。首先研究了一个典型的A类GPCR,即在HEK 293T细胞中瞬时转染的β2-肾上腺素受体(β2-AR)。当将激动剂(例如异丙肾上腺素)施加于共表达β2-AR和Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞时,观察到BRET信号呈浓度依赖性下降,表明Gs蛋白被激活(图3B)。随着配体浓度增加,ΔBRET值逐渐降低直至达到饱和,配体刺激后约5分钟出现平台期。相比之下,转染空载体pcDNA3.1质粒及Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞对异丙肾上腺素刺激表现出微弱且无统计学意义的相反反应(图3B)。在本方案中,绘制的是配体刺激15分钟后获得的数据。为确保结果的一致性和不受时间点选择的影响,应测试其他时间.......

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讨论

本实验方案描述了使用BRET生物传感器实时测量活细胞中G蛋白在特异性配体刺激GPCR后激活情况的方法。该方法基于生物发光供体-受体能量转移原理,能够检测受体激活后异源三聚体G蛋白的构象变化及其解离过程,为研究GPCR信号转导提供了可靠且灵敏的平台。本方案可适用于多种GPCR家族,包括B类和C类GPCR以及孤儿GPCR10,12。本文以A类GPCR中的β2-AR和CB1R为例报告了实验结果。

G蛋白偶联受体(GPCR)在其相应激动剂的刺激下会招募G蛋白,最终导致其解离为两个亚基:一侧为Gα,另一侧为必需的Gβγ二聚体。在本实验方案中,可通过检测与不同G蛋白组分相连的BRET配对分子所介导的G蛋白解离过程,来监测GPCR的激活状态。

实验结果表明,基于BRET的G-CASE生物传感器在配体刺激β2-AR或CB1R后,可有效检测Gs或Gi

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

HEK-CB1 细胞由 M. Guzman(西班牙马德里康普顿斯大学)惠赠,β2-肾上腺素能受体质粒由 D. Perrais(法国波尔多神经科学跨学科研究所 IINS)惠赠。Gi3-CASE 和 Gs(short)-CASE 由 Gunnar Schulte 惠赠(Addgene 质粒 # 168122;Addgene 质粒 # 168124)。部分示意图使用 BioRender.com 制作。本研究得到法国高等教育与研究部以及法国国家科研署(ANR)PolyFADO(ANR-21-CE44-0019)、AlzCaBan(ANR-24-CE44-4647)和 SCHIZOLIP(ANR-22-CE44-0034)项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级96孔培养板,白色,带透明平底,带盖,Greiner bio-oneDutscher655983
BrightMax ClearLine 白色封膜Dutscher760245
ClarioSTAR LVFBMG Labtech
二甲基亚砜(DMSO)SigmaD4540
不含氯化钙和氯化镁的改良型DPBS,液体,经无菌过滤,适用于细胞培养Sigma D8537
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基(DMEM)GlutaMAXSigmaD0822使用前在37 °C 水浴中预热
胎牛血清(FBS)Sigma F9665
Galphai3-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-VenusAddgene168122https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
由Gunnar Schulte惠赠
Galphas(短亚型)-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-VenusAddgene168124https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/
由Gunnar Schulte惠赠
稳定表达CB1R的HEK-293T细胞(HEK CB1)由M. Guzman(西班牙马德里康普顿斯大学)惠赠
野生型HEK-293T细胞(HEK wt)
异丙肾上腺素SigmaI6504溶于H2O中,储存于–20 °C
Lipofectamine 2000Invitrogen 11668019
Opti-MEM I 低血清培养基,含GlutaMAX补充剂Fischer11564506
pcDNA3 Flag β2-肾上腺素受体 C端标签载体(pcDNA3 Flag beta-2-adrenergic-receptor tag FLAG C-ter)由D. Perrais(IINS,波尔多)惠赠
pcDNA3.1-(空载体)-TAGAddgene138209
青霉素/链霉素Sigma P4333
聚-L-赖氨酸溶液(PLL)SigmaRNBL7086
胰蛋白酶-EDTA Sigma T3924
WIN-55,212-2Cayman Chemicals10009023溶于DMSO中,储存于–20 °C

参考文献

  1. Sriram, K., Insel, P. A. G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Zhang, M., et al. G protein-couple....

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells
Posted by JoVE Editors on 3/31/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68463

标签

GPCR BRET G 96 HEK293T 2 CB1