基于 BRET 的 G 蛋白生物传感器，用于测量活细胞中 G 蛋白偶联受体活性

G 蛋白偶联受体 （GPCR） 是最大的跨膜受体超家族，负责将细胞外刺激转导到细胞内信号级联反应中，从而产生特定的生物反应。它们是关键的药理学靶点，大约 30% 的上市药物作用于 GPCR¹。GPCR配体结合诱导受体的构象变化，促进与异源三聚体G蛋白和/或GPCR激酶（GRK）和β抑制素的相互作用，从而启动下游信号传导或受体内化²。

异源三聚体 G 蛋白作为 GPCR 信号传导的主要细胞内转导器，由三个亚基组成：G_α、G_β 和 G_γ。这些异源三聚体根据 G_α 亚型分为四个家族——G_i/o、G_s、G_q 和 G_12/13，每个家族都激活不同的信号通路：G_i/o 亚型抑制腺苷酸环化酶，而 G_s 刺激它，G_q 激活磷脂酶 C-β，G_12/13 调节 Rho 家族 GTP 酶。

GPCR 激活导致它们的构象重排，从而在亚秒动力学内实现 G 蛋白的快速结合。这一过程诱导 G 蛋白构象变化，促进 G_α 亚基中的 GDP-GTP 交换。GTP 结合进一步改变 G_α亚基构象，导致其与 G_βγ 二聚体解离，从而允许信号传播。因此，G蛋白通过调节多种效应蛋白（如腺苷酸环化酶或离子通道）在调节细胞反应的特异性和时间动力学方面至关重要^3,4,5。

该协议概述了在活细胞中GPCR配体刺激时使用基于生物发光共振能量转移（BRET）的生物传感器测量G蛋白的激活或失活。受G蛋白生物传感器^6,7,8,9的开创性工作的启发，由Schihada等人¹⁰引入的G-CASE（G蛋白三顺反子活性传感器）系统基于标记的G_α和G_βγ亚基之间的BRET，并提供了一种简化的方法，只需要单个质粒转染。这一特性提高了灵敏度并减轻了与编码异源三聚体 G 蛋白的三个亚基（G_α、G_β 和 G_γ）的多个质粒的共转染相关的挑战。这些传感器已在商业上提供给学术研究小组（参见 材料表）。

BRET 比 Förster 共振能量转移 （FRET） 具有显着优势。在 BRET 中，能量转移发生在生物发光供体和荧光受体之间，无需外部光源。这种固有的生物发光减少了与 FRET 相关的问题，例如自发荧光和光散射，从而降低背景信号并提高测定灵敏度 ^6,7,11。

与 FRET 相比，BRET 中没有外部激发，最大限度地减少了光漂白和光毒性效应，从而导致较低的背景信号。因此，BRET 测定通常表现出更高的灵敏度，允许测量组成型活性 GPCR 的 G 蛋白激活。BRET 测定的灵敏度提高有助于检测细微的生物相互作用，这在精确测量受体活性至关重要的药理学研究中特别有价值。

正如Scott-Dennis等人最近证明的那样，这些生物传感器可以转化为96孔或384孔板中的高通量筛选，其中已经在基于膜的384孔测定中开发了一种使用这些生物传感器的方法，以分析大麻素受体CB1R和CB2R¹²的活性。本文通过测量β2-AR作为A类原型GPCR的活性，描述了这些生物传感器在活细胞中96孔板中的使用，该活性结合_Gs 蛋白和属于A类GPCR的CB1R并激活G_{i / o} 家族蛋白。两种 G-CASE 生物传感器的使用已得到验证：在 HEK 293T 细胞中的 G_s 和 G_i3，GPCR 瞬时表达（使用 β2-AR）或稳定表达（使用 CB1R）。

值得注意的是，该实验可以在各种细胞系中进行，证明了该技术在各种细胞环境中的多功能性和稳健性。这确保了该方法可以应用于不同的实验模型，使其成为在不同生理和药理学环境中研究 GPCR 信号传导的宝贵工具。 图 1 说明了基于 BRET 的 G 蛋白活性传感器的原理。

图 1：基于 BRET 的 G 蛋白活性传感器的原理。 G 蛋白传感器由三个亚基组成：G_α、天然 G_β 和 G_γ。G_α 亚基与小而明亮的纳米荧光素酶 （Nluc） 融合，而 G_γ 亚基用环形排列的金星 （cpVenus¹⁷³） 进行 N 末端标记。编码这些工程化 G 蛋白亚基的基因组合成单个质粒。配体与 GPCR 结合诱导 GPCR 构象变化，促进 G 蛋白募集和随后的解离，然后是 GTP 水解。这种解离会破坏伙伴之间的能量转移，导致 BRET 信号减少。 请点击此处查看此图的大图。

本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 孔板播种（第 1 天）

注意：在无菌层流罩中遵循所有细胞培养方案，以保持无菌条件。具有透明平底的白色孔板用于跟踪细胞生长和活力。使用全白色孔板以避免在步骤 3.2.1 中使用贴纸。

1. 孔板涂层
   注意：可以使用预涂板绕过此步骤。
   1. 将大约 6 mL 无菌过滤的聚 L-赖氨酸 （PLL） 溶液 （0.01%） 倒入多通道储液器中。使用多通道移液器，用 60 μL PLL 填充 96 白孔微孔板的每个孔。
   2. 将微孔板置于黑暗处并孵育 20 分钟。
   3. 在孵育期间，按照步骤1.2.1-1.2.3中所述继续制备细胞。
   4. 用多通道移液器吸出PLL溶液，并将其储存在4°C的15mL管中。
   5. 用DPBS洗涤板3次，以去除可能导致细胞降解的游离PLL。
2. 细胞制备和电镀
   1. 在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基中培养 HEK293 细胞，该培养基补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，在 37°C 的 5% CO₂ 中。
      注意：将FBS添加到培养基中，以提供适当的细胞活力所需的必要营养物质和生长因子。
   2. 取出培养基并用 2 mL DPBS 冲洗细胞。
   3. 加入0.5mL胰蛋白酶，在37°C下孵育3-5分钟，以分离细胞。
   4. 向烧瓶中加入 4.5 mL DMEM 以中和胰蛋白酶，然后反复上下移液以分离细胞并重悬它们。
   5. 将分离的细胞转移到 15 mL 管中，并在 1000 x g（室温，室温下）离心 5 分钟。
   6. 除去上清液并将沉淀重悬于 2 mL DMEM 中。
   7. 用马拉西斯计数室计数细胞，并以 300,000 个细胞/mL 制备 9 mL。将它们放入多通道储液器中，并用多通道移液器（最终密度为 30,000 个细胞/孔）每孔倒入 100 μL，接种 96 孔微孔板。
   8. 将微孔板 à 37°C，5% CO₂ 孵育约 24 小时。
      注意：细胞应达到约 70%-80% 的汇合度，以实现高效转染。

2. 质粒转染（第 2 天）

注意：细胞转染可以在铺板前的第一天对悬浮细胞进行，在步骤1.2.7期间进行，并在第3天进行数据采集。

1. 稀释 10 μg 所需的质粒 DNA（例如，在 HEK wt 细胞中稀释 5 μg β2-肾上腺素能受体和 5 μg G_s（短）-CASE 或在 HEK CB1 细胞中仅稀释 10 μg G_i3-CASE）和 20 μL Lipofectamine 在含有 500 μL Opti-MEM 培养基的试管中。在室温下孵育5分钟。
   1. 对于阴性对照，用相同浓度的空质粒pcDNA 3.1替换β2-肾上腺素能受体。将溶液混合到一个管中并混合以获得转染混合物 （1 mL）。
2. 将转染混合物在室温下孵育20分钟。
3. 将步骤 2.2 中的 10 μL 转染混合物滴加到每个孔中，并轻轻来回摇动板以确保完全混合。
   注意：获得每孔 100 ng DNA 的最终浓度。
4. 将微孔板在37°C，5%CO₂ 的加湿培养箱中孵育24小时。

3. 数据采集（第 3 天）

1. 配体制备
   注意：汉克平衡盐溶液（HBSS）缓冲液：NaCl 140 mM，氯化钾5 mM，氯化钙1 mM，七水硫酸镁0.4 mM，六水氯化镁0.5 mM，磷酸氢二钠二水合物0.3 mM，磷酸一氢钾0.4 mM，D-葡萄糖（葡萄糖）6 mM，碳酸氢钠4 mM，pH 7.4，过滤0.22μm。
   1. 在适合不同配体的适当增溶溶剂中制备尽可能高浓度的储备溶液（在本协议中，异丙肾上腺素在H₂0 mQ中制备，WIN-55.212-2在DMSO中制备）。
      注意：配体储备溶液的浓度需要根据配体的溶解度和已知解离常数（K_d）进行调整。
   2. 从该储备液中，在适当的增溶溶剂中制备配体 K_d 周围的配体连续稀释液，范围为 10 μL。将该连续稀释液储存在-20°C下。
      注意：根据配体的不同，在降解发生之前，连续稀释范围可以冷冻和解冻多达十次。制备仅含有用于配体溶解的溶剂的溶液，以包括载体条件（在本协议中，H₂0 或 DMSO）。
   3. 对于每种配体浓度和载体，通过将每种浓度的 1.3 μL 添加到 130 μL 的总体积中，在 HBSS 中进行 1/100 稀释。这导致HBSS中的最终载体浓度为1%。
      注意：该最终稀释范围是用于实验的范围，通过添加 10 μL 以获得每孔 100 μL 总体积。这导致所有孔中的最终浓度为 0.1% 载体。130 μL 体积对应于填充一排 96 孔板所需的量：（10 x 12） ± 10%。每一行对应不同的配体浓度，最后一行作为载体对照。
   4. 从储备溶液中制备 980 μL 呋利马嗪 1/100 稀释液（9.8 μL 在 970.2 μL HBSS 中获得 980 μL 的总体积）。
      注意：制备新鲜的呋利马嗪溶液，让它孵育至少3分钟。然后，在获取之前立即添加它。不应过早制备，因为信号在室温下的半衰期约为 120 分钟。为了克服这一限制，可以使用长效呋嗪衍生物，例如维伐嗪和恩杜肼。这些基板可保持稳定的 BRET 信号长达 48 小时。
2. 板读数
   注意：使用多模式读板器。根据所研究的条件和重复次数调整测量值。在这里，数据采集分为 4 列的三个读数，对应于 32 个孔。所有读数均使用带有透明盖子的顶部光学器件完成，以防止缓冲液蒸发。在所有读数之前，调整测量增益。在这项研究中，增益固定为 3600。通过使用自动进样器或注射器系统可以避免手动添加配体，该系统在许多酶标仪中都有。
   1. 从 96 孔板的前 4 列中取出培养基。用 100 μL HBSS 冲洗每个孔并加入 80 μL HBSS。在盘子的底面贴上一张白色贴纸。这改善了荧光和/或生物发光测量。
   2. 记录 G 蛋白发光光谱：将 96 孔板插入酶标仪。使用 535/30 nm 单色仪记录 cpVenus¹⁷³ 发射，并以 2 nm 分辨率测量 500 至 600 nm 之间的发光发射。
      注意：此记录是确保在 cpVenus¹⁷³ 激发时发射荧光的对照。
   3. 记录G蛋白发光光谱：使用450 / 40 nm单色仪记录Nluc发射强度，并以5 nm分辨率测量400 nm至600 nm之间的发光发射。
      注意：此记录是确保在添加 Nluc 底物 furimazine 之前不会发射生物发光的对照。
   4. 从酶标仪中取出板，并在多通道移液器的帮助下在每个孔中加入 10 μL 先前制备的呋嗪溶液（步骤 3.1.4.）。
   5. 重复步骤 3.2.3。
      注意：此记录是确保在添加呋嗪时发出生物发光的对照。测量后直接进行步骤 3.2.6，以防止由于呋嗪消耗和/或降解而导致信号变化。由于呋喃马嗪的消耗和/或降解以及调节过程发生终止激动剂刺激诱导的反应，可能会发生 BRET 信号变化。为了克服这一限制，可以使用 GRK 抑制剂 （CMPD101） 和内化抑制剂 （dynasore） 或不含 GRK 或抑制素的基因编辑细胞。
   6. 记录G蛋白基础BRET：在添加GPCR配体之前，分别使用450/40nm和535/30nm单色仪记录Nluc和cpVenus¹⁷³ 发射强度。测量 3 个周期，每次 60 秒，测量间隔时间为 0.30 秒（总读数时间为 3 分钟）。
      注意：将测量间隔时间增加到 0.90 秒通常会显着提高信噪比，但会导致读取时间更长。实验者应决定更高的时间分辨率或改进的信噪比对于其应用来说更重要。
   7. 从酶标仪中取出板，并在多通道移液器的帮助下，在一根色谱柱的每个孔中分别加入 10 μL 先前制备的 GPCR 配体稀释范围（步骤 3.1）。对其他 3 列执行相同的步骤。
   8. 记录 G 蛋白配体诱导的 BRET：分别使用 450/40 nm 和 535/30 nm 单色仪记录 Nluc 和 cpVenus¹⁷³ 发射强度。测量 16 个 60 秒的循环，测量间隔时间为 0.30 秒（总读数时间为 16 分钟）。
      注意：设置测量参数以测量柱中的孔。读取重复项时差为 2.4 秒。
   9. 重复步骤 3.2。接下来的四列 2 次。

4. 数据分析

注意：将每次读数的数据收集到单独的数据电子表格文件中。

1. 控制读数
   1. 绘制发射强度与波长的关系。
2. 基础 BRET 读数
   1. 对于每个孔，计算三个读数的 BRET 比率。BRET 比率定义为受体发射/供体发射。
      
   2. 对于每个孔，计算配体添加前三个 BRET 比率的平均值。该值称为配体刺激前的基础 BRET 比率：_基础比率。
   3. 为了归一化所有孔的先前 BRET 比率，对于三个测量中的每一个，分别从相应测量时间的 BRET 比率中减去从载体控制孔计算的 BRET 比率值。
      注意：分析的数据对应于配体添加前的时间点。由于添加配体的孔是已知的，因此可以相应地识别载体控制孔。
3. G 蛋白配体诱导的 BRET 读数
   1. 对于每个孔，计算每个读数的 BRET 比率，如第 4.2.1 节所述。这些值称为 Ratio_stim。
   2. 为了量化配体诱导的变化，请计算每个孔的每个比率_刺激 的 ΔBRET 作为基础百分比。为此，请_{使用之前在} 第 4.2.2 节中计算的相应比率基础。
      
   3. 计算 ΔBRET（%） 以归一化每个孔的 ΔBRET 值。为此，减去车辆各自的 ΔBRET 值。
   4. 要在数据电子表格中可视化 ΔBRET 动力学，请添加在步骤 4.2.3 中归一化的三个基本 BRET 读数。在第 4.3.3 节中为每个孔计算的相应 ΔBRET（%） 值前面。
   5. 将先前的数据与读取时间进行绘制，以获得动力学图。
   6. 当达到平台期时，在选定时间获取 ΔBRET（%） 值，并将其与所用配体的浓度进行绘制，因为每个孔对应不同的配体浓度。获得剂量反应曲线。
      注意：通常在配体刺激后约 5 分钟达到平台期。在该协议中，绘制了配体刺激15分钟后获得的值。要比较来自不同实验的数据，请根据激活动力学调整时间。
   7. 在分析软件中绘制先前的数据，并根据以下方程使用S形剂量-反应三参数拟合进行拟合：
      
      其中，X 是所用配体的浓度，Y 是 ΔBRET（%） 值，顶部和底部代表平台期，EC₅₀ 是达到最大效果的 50% 所需的配体浓度。这允许人们获得 E_max 和 EC₅₀。
   8. 使用非参数 Mann-Whitney 检验比较控制条件的数据。结果在 p < 0.05 时被认为是显着的。

图 2：执行 BRET 测定的关键步骤。概述本协议中概述的三个主要实验步骤（细胞接种、细胞转染和 BRET 信号采集）以及数据采集的详细分步指南。实验设置：在第 1 天，将细胞接种在 PLL 预涂的白色 96 孔板中，该板底部平坦、透明，密度为 30,000 个细胞/孔。在第 2 天，用选定的 G 蛋白传感器以及研究的 GPCR 或 pcDNA3.1 质粒转染细胞。孵育24小时后，通过配体添加时的生物发光和荧光读数测量G蛋白传感器活性。数据采集：在细胞的HBSS洗涤后，将80μL的HBSS加入孔中，并使用535/30nm单色仪在500nm和600nm之间测量cpVenus¹⁷³荧光发射（1）。接下来，在添加呋马嗪之前（2）和（3）之后，使用450 / 40 nm单色仪在400 nm和600 nm之间测量Nluc生物发光。最后，分别使用450/40nm和535/30nm单色仪测量基础和配体诱导的G蛋白活性的BRET信号，分别在3分钟（3个周期，60秒，测量间隔为0.30秒）（4）和16分钟（16个周期，60秒，测量间隔为0.30秒）（5）。请点击此处查看此图的大图。

实验设置和执行的通用方案详见 图 2。使用 G-CASE 生物传感器评估两种 GPCR 配体激活后 Gs 或 Gi/o 家族蛋白的激活。首先，研究了一个原型家族A GPCR，即在HEK 293T细胞中瞬时转染β2-AR。当激动剂（即异丙肾上腺素）与Gs（short）-CASE蛋白传感器一起应用于表达β2-AR的HEK wt细胞时，观察到BRET信号的浓度依赖性降低，表明Gs 蛋白的激活（图3B）。ΔBRET 值随着配体浓度的增加而降低，直到达到饱和，在配体刺激后约 5 分钟观察到平台期。相比之下，用空pcDNA3.1质粒和Gs（short）-CASE蛋白传感器转染的HEK wt细胞对异丙肾上腺素刺激表现出反向但低且不显着的反应（图3B）。在该协议中，绘制了配体刺激15分钟后获得的值。为确保结果的一致性和独立于时间选择，应测试其他时间点，确保达到平衡。此外，为了比较不同实验的结果，应根据每个实验的激活动力学调整时间选择。

为了生成图3C所示的S形剂量反应曲线，将刺激后15分钟（平台稳定时）测量的ΔBRET值绘制成针对不同配体浓度的图。观察到的EC50（9.4 nM ± 2.1 nM）在受体已知的异丙肾上腺素Kd（13 nM ± 6 nM）13,14的范围内（图3C，D）。这些结果证明了 G-CASE 传感器在评估 G 蛋白激活方面的效率，观察到的响应与 β2-AR 的存在特别相关。

图3：评估HEK wt细胞中的Gs 蛋白传感器。 将激动剂异丙肾上腺素添加到转染 Gs 蛋白传感器和 β2-AR （A） 或 pcDNA3.1 （B） 的 HEK wt 细胞后的动力学 ΔBRET 读数。（C）在不同配体浓度下配体刺激15分钟后拟合ΔBRET（%）值获得的剂量反应曲线。（D）用异丙肾上腺素刺激的对照pcDNA3.1和β2-AR转染细胞之间的ΔBRET最大值比较。使用非参数 Mann-Whitney 检验 （**p < 0.01） 测试与 pcDNA3.1 条件的统计差异。数据显示±一式两份进行的三个独立实验的平均 SEM。 请点击此处查看此图的大图。

其次，在HEK CB1细胞（一种稳定表达CB1R的HEK 293T细胞系）中测试了生物传感器。用Gi3-CASE蛋白传感器瞬时转染这些细胞。用CB1R激动剂WIN-55,212-2刺激诱导浓度依赖性ΔBRET信号，表明Gi3通路被激活（图4A）。相比之下，用Gi3-CASE蛋白传感器转染并在相同条件下刺激的HEK wt细胞没有显示出任何反应，证实了CB1R激活的特异性（图4B）。配体激活后约 5 分钟达到平台期。相应的剂量反应曲线突出显示了 WIN-55,212-2 刺激在 HEK-CB1 细胞中诱导的浓度依赖性 ΔBRET 反应，而在 HEK wt 细胞中未观察到这种反应（图 4C）。观察到的EC50（112 nM ± 25 nM）在受体对WIN-55,212-2（354 nM ± 62 nM）15的已知EC50的范围内（图4C，D）。最后，在HEK CB1和HEK wt细胞中用10μM WIN-55,212-2激动剂刺激15分钟后获得的ΔBRET 值的比较说明了Gi3信号通路的CB1R依赖性激活（图4D）。

图 4：评估 HEK CB1 细胞中的 Gi3 蛋白传感器。 将激动剂 WIN-55,212-2 添加到 HEK CB1 （A） 或 HEK wt 细胞 （B） 时的动力学 ΔBRET 读数。通过拟合配体刺激 15 分钟后与配体浓度 （C） 拟合 ΔBRET （%） 值获得的剂量反应曲线。用 WIN-55.212-2 刺激的对照 HEK wt 和 HEK CB1 细胞之间的 ΔBRET 最大值比较 （D）。使用非参数 Mann-Whitney 检验 （****p < 0.0001） 检验与 HEK wt 条件的统计差异。数据显示五次独立实验的平均±SEM，一式两份。 请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。