需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤 关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂

1.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68469

⸱

2025年10月17日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过彗星实验来定量分析I型和II型抑制剂在FLT3突变细胞中诱导DNA损伤差异的有效方法。

摘要

FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是一种III类受体酪氨酸激酶，在急性髓系白血病（AML）患者中的突变频率约为30%，是重要的治疗靶点。吉列替尼和奎扎替尼（AC220）分别为典型的I型和II型FLT3抑制剂，临床上用于FLT3突变型AML的治疗。

吉列替尼可抑制活化和非活化的FLT3蛋白，同时还能额外抑制AXL靶点，有助于克服耐药性。AC220仅抑制活化的FLT3。本研究系统地采用彗星实验来定量并比较I型与II型FLT3抑制剂在突变细胞中诱导的DNA损伤模式。实验结果表明，AC220引起的DNA损伤显著高于吉列替尼。对于强烈的DNA损伤，FLT3抑制剂可与DNA损伤修复抑制剂联合使用，以靶向DNA修复缺陷。该结果为DNA损伤靶向药物的合理联合策略提供了实验依据。

引言

急性髓系白血病（AML）是一种克隆性造血干细胞疾病，其特征是未分化髓系前体细胞发生病理性扩增，导致造血功能受抑及骨髓衰竭。AML固有的分子异质性为其治疗带来重大挑战1。其中具有重要临床意义的是，FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）突变是AML中最常见的遗传学改变之一，发生率约为30%，且与不良临床预后密切相关2。FLT3受体酪氨酸激酶在细胞膜上被激活，介导PI3K/AKT和RAS/MAPK信号通路；而FLT3-ITD突变体则滞留在内质网中，引起信号转导子和转录激活子5（STAT5）持续性磷酸化。这些遗传学改变通过多种致癌机制驱动白血病的发生，主要机制包括信号转导失调、增殖信号失控以及凋亡抵抗3。

AC220 和吉列替尼作为典型的 FLT3 抑制剂，均可通过抑制 FLT3 表达来抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，但二者的作用机制不同。吉列替尼（I 型抑制剂）不仅能覆盖更广泛的 FLT3 激活突变，还可抑制与 FLT3 密切相关的 AXL 酪氨酸激酶。通过双重抑制作用，吉列替尼能够更全面地阻断癌细胞的生长4。AC220（II 型抑制剂）通过竞争性结合活化构象的激酶发挥作用，特异性靶向 ATP 结合口袋，具有高度特异性5。这种抑制作用可能导致细胞周期阻滞以及 DNA 复制压力增加。

吉列替尼与较低的耐药风险相关，适用于复发/难治性FLT3突变型急性髓系白血病（AML）的单药治疗。AC220对FLT3-ITD突变具有高效性和选择性，临床反应率良好，但对FLT3-TKD突变无效，并且可能由于继发性FLT3-TKD突变（如D835或F691L）而产生耐药性。这些抑制剂因其已证实的临床疗效和改善的治疗指数而在AML治疗中受到广泛关注6。然而，这些药物的临床应用仍面临获得性耐药和脱靶效应的挑战。AC220在临床长期使用后常因FLT3-TKD突变导致耐药，而吉列替尼尽管不会因FLT3-TKD突变产生耐药，但在应对复合突变（如FLT3-ITD与TKD联合突变）时可能仍存在局限性7,8。

这两类FLT3抑制剂通过抑制FLT3并阻断增殖信号通路——RAS-MAPK、PI3K-AKT-mTOR和STAT5信号通路，间接诱导复制应激，从而产生双重治疗效应。细胞增殖受阻通常会导致细胞周期停滞、代谢紊乱（氧化还原稳态失调），最终引发细胞凋亡9,10。该机制最终产生DNA损伤，激活耐药细胞群体中的代偿性DNA修复适应反应。彗星实验可实现对FLT3突变细胞中不同抑制剂特异性DNA损伤谱的定量比较。这一实验方法为开发合理设计的联合疗法提供了关键见解，有望利用DNA损伤的脆弱性克服获得性治疗耐药。

目前用于DNA损伤检测的现代方法包括免疫组织化学分析、DNA片段的琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链式反应（PCR）以及高通量测序（NGS），这些方法均具有较高的分析灵敏度和特异性11。然而，这些技术受限于高昂的成本、较长的处理时间以及严格的实验条件。这凸显了采用兼顾分析准确性与操作简便性的检测策略的必要性。

彗星试验由于其高灵敏度、技术易操作性、可直观定量DNA损伤以及在多种生物系统中的广泛适用性，已在环境毒理学和遗传毒性评估中得到广泛应用12,13。目前已建立三种主要的方法学变体：用于单/双链断裂检测的碱性彗星试验、用于双链断裂分析的中性彗星试验，以及用于特异性DNA损伤识别的酶修饰彗星试验14。

该方法学原理包括：（1）通过实验处理诱导DNA链断裂；（2）裂解缓冲液溶解细胞膜和核膜，使胞质/核内蛋白质和RNA扩散至电泳缓冲液中，而高分子量DNA仍固定于琼脂糖基质中；（3）碱性变性（pH > 13）导致DNA解旋并释放受损的DNA片段；（4）在电场驱动下，断裂的DNA向阳极迁移，形成典型的彗星形态，而完整的DNA则保持球形核样结构15,16。通过计算机分析尾部DNA百分比（TDP），可实现对单细胞水平基因毒性效应的精确定量17。

本研究采用系统的实验框架，比较吉列替尼（gilteritinib）与AC220在经验证的FLT3突变型32D细胞中不同的基因毒性效应。实验设计包括两个主要部分：（i）建立针对FLT3突变的DNA损伤模型；（ii）通过碱性彗星实验方法定量评估药物诱导的DNA损伤。FLT3突变型32D细胞系在暴露于系列稀释的FLT3抑制剂之前，均维持于标准的体外（in vitro）培养条件下。采用CCK-8法检测细胞活力，并通过非线性回归分析计算半数抑制浓度（IC50）值。选择五倍IC50值作为诱导DNA损伤的阈值。药物处理后的细胞被收集并包埋于载玻片上的低熔点琼脂糖中，用于后续分析。在碱性缓冲液中进行电泳分离，条件为24 V（约0.74 V/cm）和300 mA，持续30分钟；在此过程中，断裂的DNA片段向阳极迁移，形成典型的彗星形态，而完整的DNA则保持球形核样结构。DNA损伤程度通过计算机图像分析彗星实验软件项目（CASP） 测量尾矩进行定量，Olive尾矩值的增加与DNA断裂程度呈直接正相关。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 构建携带 FLT3-ITD 突变的 32D 细胞 DNA 损伤模型18

  1. 细胞复苏
    1. 使用镊子迅速转移保存在 -80 °C 的冻存 FLT3-ITD 突变型 32D 细胞。用镊子取出冻存管，立即浸入温度可控的水浴中（37 °C ± 0.5 °C），精确解冻 60 秒，完成程序化复苏。
      注：解冻过程中，间歇性摇动冻存管，确保均匀受热。
    2. 将冻存样本在 150 × g 条件下离心 5 分钟，温度为 25 °C ± 1 °C。使用无菌移液管小心吸除上清液，保留细胞沉淀。
    3. 向冻存管中加入 1 mL 完全培养基（RPMI 1640 + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素）。通过连续吹打 10 次（每次 1 mL 体积）进行轻柔重悬，确保细胞完全分散。将细胞悬液转移至 100 mm 细胞培养皿中，并加入 7 mL 完全培养基，使终体积为 8 mL。
    4. 轻轻晃动培养容器，进行五次水平移动和五次旋转动作。将细胞置于加湿培养箱中，维持 37.0 °C ± 0.2 °C、5% CO2 和 95% 湿度的环境。实验处理前孵育 24 小时。
  2. 细胞活力评估
    1. 选择处于对数生长期且状态良好的 FLT3-ITD 突变型 32D 细胞用于实验。
      注：处于对数生长期的细胞通常具有较短的分裂周期和较高的分裂频率。
      1. 使用电子显微镜观察 FLT3-ITD 突变型 32D 细胞的形态和生长状态。确保满足细胞增殖阈值标准：细胞呈单个球形，边缘光滑，分布均匀，聚集体少，细胞大小一致，质膜完整性完好，细胞碎片< 5%。
    2. 使用细胞计数仪测定细胞悬液浓度。
      注：混匀细胞悬液（使用 1 mL 无菌吸头，以最大移液速度的 50% 进行连续 10 次吹打）。
    3. 通过梯度稀释法，将细胞悬液调整至 2.0 × 105 个细胞/mL 的浓度。使用移液器将 50 µL 分装至 96 孔平底板的中央孔（B2-G7）。在周边孔（A1-H12）中加入 100 µL 无菌 PBS，以维持湿度并减少边缘蒸发效应。
    4. 含 FLT3 抑制剂培养基的配制：在 12 孔细胞培养板中选择九个孔，根据 FLT3 抑制剂浓度梯度（0、3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500 和 1000 nM）进行标记。向标记为 10.0 µM 的孔中加入 400 µL 完全培养基，其余各孔加入 200 µL 完全培养基。
      1. 吉列替尼（Gilteritinib）稀释：使用移液枪向每个标记为 1000 nM 的孔中加入 4 µL 100 µM 吉列替尼试剂（吉列替尼溶于二甲基亚砜），并充分混匀。将 200 µL 1000 nM 吉列替尼移入标记为 500 nM 的孔中并混匀；再将 200 µL 500 nM 吉列替尼移入标记为 250 nM 的孔中并混匀。每次取前一稀释液 200 µL 加入下一孔并混匀，以获得目标浓度。
      2. AC220 稀释：使用移液枪向每个标记为 1000 nM 的孔中加入 4 µL 100 µM AC220 试剂（AC220 溶于二甲基亚砜）。其余孔的操作参照步骤 1.2.4.1。
        注：确保移液器中的 FLT3 抑制剂母液完全转移至孔中，避免残留。稀释前务必充分混匀溶液。
    5. 孵育：使用移液器将含 FLT3 抑制剂的培养基（50 µL/孔）加入指定孔中。将 96 孔板置于生理培养条件下（37.0 °C ± 0.2 °C，5% CO2，95% 湿度），精确孵育 72 小时 ± 15 分钟。
    6. 使用移液器向所有实验孔和空白对照孔中加入 10 µL CCK-8 试剂。避光保护，于常氧条件下（37 °C，5% CO2）孵育 2.0 小时 ± 10 分钟。
      注：以低速移液，吸头浸入深度为 2 mm，以减少气泡形成。加样时避免产生气泡，防止干扰 OD 值读数。
    7. 从培养箱中取出 96 孔板，使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。记录结果。
    8. 根据 IC50 计算公式计算抑制率：
      抑制率 (%) = MTT 实验分析公式，显示光密度（OD）测量计算方法。 × 100%
      药物实验孔指经药物处理的细胞孔。细胞对照孔指未经药物处理的细胞孔。空白对照孔指仅含培养基、不含细胞的孔。
    9. 通过非线性回归分析标准化的剂量-反应数据，采用四参数逻辑模型。点击“拟合曲线”按钮进行曲线拟合。根据模型收敛性（R2 > 0.98，残差平方和 < 0.15）推导半最大抑制浓度（IC50），并通过 1000 次迭代的自助重采样法计算 95% 置信区间。
  3. FLT3 抑制剂诱导的 FLT3-ITD 突变型 32D 细胞 DNA 损伤实验
    1. 选择表现出快速增殖（群体倍增时间 < 24 小时）的 FLT3-ITD 突变型 32D 细胞用于 DNA 损伤评估。
    2. 计数细胞（详见步骤 1.2.2）。
    3. 细胞接种：将细胞悬液密度调整为每皿 1 × 106 个细胞，使用直径 6 cm 的培养皿，每皿加入 4 mL 细胞悬液。
    4. 为每个抑制剂浓度设置三个重复：55 nM 吉列替尼：4 mL 培养基 + 2.2 µL 100 µM 母液；0.15 nM AC220：4 mL 培养基 + 6 µL 100 nM 母液。涡旋混匀溶液，并在 37 °C 平衡 15 分钟；轻轻振荡管子以确保充分混合。使用无菌移液管吸除原培养基，更换为 4 mL/皿新配制的含抑制剂培养基。
    5. 将处理后的细胞置于生理条件下（37 °C，5% CO2，95% 湿度）孵育指定时间（0、2、4、6 小时）。立即处理零时点对照组，用于基线 DNA 损伤评估。
    6. 台盼蓝排斥实验
      1. 将收集的细胞在 150 × g 条件下离心 1 分钟。弃去上清液，用 1 mL 培养基重悬细胞。
      2. 取 100 µL 重悬细胞加入塑料离心管中，加入 100 µL 台盼蓝染液（2 倍浓度），轻柔混匀，染色 3 分钟。
      3. 计数细胞（详见步骤 1.2.2）。
      4. 按以下公式计算细胞活力：
        细胞活力计算公式；用于评估样本分析中活细胞比例的方程。

  3. >


  3. >

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究系统采用彗星试验来定量分析吉列替尼和AC220在FLT3突变细胞系中诱导的差异性DNA损伤谱型。分析结果显示，未经吉列替尼与AC220处理的细胞群体之间DNA损伤的差异无统计学意义（P > 0.05）。在药物暴露2–6小时后，尾部DNA（%）和橄榄尾矩（Olive Moment Tail, OMT）值呈剂量依赖性升高，并达到统计学显著性（P < 0.05）。OMT表示尾部DNA百分比与“头部和尾部荧光重心之间距离”的乘积。尾部DNA（%）和橄榄尾矩（OMT）的差异表明，AC220对细胞造成的DNA损伤大于吉列替尼（图3 和 图4）。综上所述，该实验范式明确证实，彗星试验可用于评估FLT3抑制剂在突变细胞模型中的DNA损伤差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

彗星试验法代表了遗传毒性评估方法学的重要进展。该技术通过其技术上的可及性、单细胞分辨率以及通过电泳迁移图谱直接观察损伤模式的特点，相较于传统方法具有显著优势。在急性髓系白血病（AML）治疗药物的研发中，彗星试验法可在靶点验证阶段对候选药物的遗传毒性特征进行系统性评估，为临床前优化提供关键的药效动力学数据19,20。

实验过程中有几个关键步骤需要遵守，以确保结果的可靠性和可重复性。首先，实验过程中所有载玻片的裂解条件和裂解时间必须保持一致。处理细胞时，应避免不必要的光照，以防紫外线和某些化学物质可能引起的DNA损伤。琼脂糖凝胶必须完全覆盖加样孔，以防止凝胶从载玻片上脱落，且载玻片应始终保持水平放置。

然而，尽管彗星试验提供了一种简单且便捷的方法，但仍存在局限性。例如，彗星试验的通量受限于载玻片的数量，在需要大规模筛选的应用中可能效率不足。彗星试验的结果为半定量，主要检测DNA链断裂，可能无法检测某些类型的DNA损...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了江苏省高校科学技术创新团队（2021年）、江苏省高等职业院校工程技术研究中心项目（2023年）、浙江省医药卫生科技计划项目（2025KY1861）、中国江苏省高等教育机构自然科学重点基金（项目编号：24KJA310008）、苏州卫生职业技术学院院级项目（项目编号：SZWZYTD202201、szwzy202406）以及苏州大学放射医学与防护国家重点实验室项目（GZK12023013）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA碧云天ST066
1x YeaRed 核酸染料翊圣生物10202ES
32D 细胞科佰生物CBP60995
AC220TargetMolT2066
Cell Counting Kit-8同仁化学CK04
细胞计数板丘井XB-K-25
CO2 培养箱赛默飞51032872
彗星分析软件项目（CASP）
CometAssay 试剂盒 Trevigen4250-050-K
Cytation 5BioTek16280004
FBSPANST30-3302
吉列替尼TargetMolT4409
GraphPad Prism 9.0
高速离心机赛默飞 9AQ2861
L-1000XLS+ 移液器Rainin17014382
L-20XLS+ 移液器Rainin17014392
液氮罐MvecryogeYDS-175-216
Multiskan FC 酶标仪赛默飞1410101
Na2OH大茂1588
PBS索莱宝P1020
青霉素-链霉素溶液，100x碧云天C0222
RPMI 1640 培养基吉比科C22400500BT
三目活细胞显微镜Motic1.1001E+12
超低温冰箱海尔V118574

参考文献

  1. Swaminathan, M., Wang, E. S. Novel therapies for AML: A round-up for clinicians. Expert Rev Clin Pharmacol. 13 (12), 1389-1400 (2020).
  2. Daver, N., Schlenk, R. F., Russell, N. H., Levis, M. J. Targeting flt3 mutations in AML: Review of current knowledge and evidence. Leukemia. 33 (2), 299-312 (2019).
  3. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  4. Mori, M., et al. a FLT3/AXL inhibitor, shows antileukemic activity in mouse models of FLT3-mutated acute myeloid leukemia. Invest New Drugs. 35 (5), 556-565 (2017).
  5. Papaemmanuil, E., Döhner, H., Campbell, P. J. Genomic classification in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 375 (9), 900-901 (2016).
  6. Cortes, J. Quizartinib: A potent and selective FLT3 inhibitor for the treatment of patients with FLT3-ITD-positive AML. J Hematol Oncol. 17 (1), 111(2024).
  7. Döhner, H., Wei, A. H., Löwenberg, B. Towards precision medicine for AML. Nat Rev Clin Oncol. 18 (9), 577-590 (2021).
  8. Kantarjian, H., et al. Acute myeloid leukemia: Current progress and future directions. Blood Cancer J. 11 (2), 41(2021).
  9. Miyamoto, K., Minami, Y. Cutting edge molecular therapy for acute myeloid leukemia. Int J Mol Sci. 21 (14), (2020).
  10. Yang, X., Wang, J. Precision therapy for acute myeloid leukemia. J Hematol Oncol. 11 (1), 3(2018).
  11. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  12. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  13. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  14. Azqueta, A., et al. Technical recommendations to perform the alkaline standard and enzyme-modified comet assay in human biomonitoring studies. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 843, 24-32 (2019).
  15. Cotelle, S., Férard, J. F. Comet assay in genetic ecotoxicology: A review. Environ Mol Mutagen. 34 (4), 246-255 (1999).
  16. Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: Guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
  17. Pu, X., Wang, Z., Klaunig, J. E. Alkaline comet assay for assessing DNA damage in individual cells. Curr Protoc Toxicol. 65, 3.12.11-13.12.11 (2015).
  18. Liu, S. B., et al. Impact of flt3-itd length on prognosis of acute myeloid leukemia. Haematologica. 104 (1), e9-e12 (2019).
  19. Wang, Y., Lin, X., Wang, Y., Wang, G. Synergistic effect of adavosertib and fimepinostat on acute myeloid leukemia cells by enhancing the induction of DNA damage. Invest New Drugs. 42 (1), 70-79 (2024).
  20. Kumar, S., Yedjou, C. G., Tchounwou, P. B. Arsenic trioxide induces oxidative stress, DNA damage, and mitochondrial pathway of apoptosis in human leukemia (hl-60) cells. J Exp Clin Cancer Res. 33 (1), 42(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

FLT3 I II
彗星实验定量分析表达FLT3突变体的32D细胞在暴露于I型和II型FLT3抑制剂后的DNA损伤 关键词：彗星实验，DNA损伤，FLT3突变，32D细胞，I型FLT3抑制剂，II型FLT3抑制剂
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。