一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

Summary

该方案引入了一种用于识别蛋白质合成天然产物/小分子抑制剂的荧光筛查方法。其实用性使其既适合本科阶段的药物发现技术教学，也适用于药物化学活动的实施。

Abstract

天然产物是多种疾病，尤其是癌症中，具有丰富的治疗成分来源。通过利用这些生物分子作为药物发现的结构模板，研究人员实现了比全合成化合物更快的开发周期和更高的生物效能。蛋白质合成途径已成为天然产物的有力靶点，尤其考虑到其在难治癌症中的参与。强效蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺，源自 灰链霉菌，体现了天然化合物在该领域的潜力。随着这些天然产物衍生物被开发成类药分子，确认其蛋白质合成的抑制活性仍是验证的关键步骤。其主要目标是提供一个适合本科生的快速评估化合物抑制活性的方案。该方案采用荧光底物和先进的荧光显微镜技术，系统地检测和测量这些天然产物的抑制能力。该研究考察了两种植物的化合物： 仙子松 和 鞭毛叶松。以环己酰胺为参考抑制剂，这两种天然产物在蛋白质合成抑制方面表现各异。

Introduction

蛋白质合成涉及高度调控的过程：转录和翻译。转录过程中，基因的DNA序列被复制，产生信使RNA（mRNA）。RNA聚合酶通过分离DNA双螺旋，并利用其中一股作为导引构建匹配的mRNA分子。mRNA完全形成后，会从细胞核传送到细胞质进行翻译。翻译发生在核糖体中，mRNA被用作模板，将氨基酸组装成多肽链。这条多肽链在离开核糖体出口隧道后，被折叠成功能性蛋白。转录主要由转录因子、染色质修饰和调控RNA调控，而翻译则受起始因子、信号通路和RNA稳定性机制调控。这些调控系统使细胞能够维持细胞功能，并有效应对压力或损伤，¹.

绝大多数人类癌症——约85%——表现为实体^肿瘤2.虽然这些肿瘤在具体特征和行为上差异很大，但它们往往共享某些共同的生理特征和模式，例如蛋白质合成上调，无论其病因或^{解剖位置如何}。癌细胞通过劫持翻译机制来调节蛋白质合成，以支持其高能量需求和不受控制的生长。这种重编程是由于几乎所有主要致癌信号通路失调的结果，促进细胞存活、增殖和转移，同时抑制细胞死亡通路⁴。在肿瘤细胞中，核糖体的制造机制进入超速运转，促进蛋白质生成和细胞快速分裂。由于这种增强的蛋白质合成对癌症存活至关重要，针对并阻断该过程的治疗被视为潜在疗法^5。因此，聚焦癌症特异性翻译因子、独特核糖体组成或调节蛋白质合成的信号通路改变的研究，可能带来更具针对性的抑制剂，治疗窗口更为显著。

由于天然产物（NPs）以其广泛的生物活性而闻名，利用其支架开发选择性蛋白质合成抑制剂用于癌症治疗是一种有前景的方法 ^6,7。NPs可以靶向蛋白质合成机制的不同组成部分，从核糖体结合到干扰起始因子或延长过程，使其成为实体肿瘤蛋白质合成抑制剂药物开发中极为宝贵的起^点6。快速筛选化合物活性的能力，是药物发现平台高效识别NP命中性的关键切入点。通常，化合物的高通量筛选利用荧光分析快速缩小先导候选^{分子范围。}

全球科学家依赖基于荧光的技术作为分析生物系统的重要工具。这些方法被广泛用于研究细胞过程，使研究人员能够实时追踪生物分子^{相互作用9。}结合生物正交点击化学反应，这些方法可以实现蛋白质合成的精确^可视化。本研究的荧光蛋白合成测定是一种非放射性蛋白质合成技术，利用 O-前丙基-普罗霉素（OPP），一种细胞通透性含烔烃的普霉素类似物。细胞处理后，OPP被整合在延长多肽链的C端，导致翻译终止。这些烴标记的截断蛋白随后通过铜催化的点击化学结合5个FAM-叠氮化物进行检测。

这种荧光测定法是一项宝贵的研究工具，也是本科生培训的易用化学生物学方法。通过提供一个易于访问、高效的方案，且数据处理最少，它为学生提供了现代药物发现技术的实践经验，加速了药物发现的进程。随着对新型蛋白质合成抑制剂需求的增长，这种方法为本科生提供了有意义的研究机会，同时推动癌症治疗的进步。

Protocol

1. 试剂盒制备试剂

注意：充分混合、甩壳，并在使用前将所有试剂冰藏保存。

1. 整理并获取蛋白质合成抑制试剂盒、PBS缓冲液、细胞培养基、细胞培养基、15毫升锥形无菌聚丙烯离心管、2毫升离心管、p10、p20、p200和p1000移液管及相应的吸头。
2. 准备洗涤缓冲液。
   1. 用手捧着10倍洗涤缓冲液，在37°C解冻。利用手中的体温解冻，并经常检查解冻是否完成。
   2. 将10倍洗涤缓冲液稀释在离心管中，1：10比例的去离子水。通过倒置或上下移液法进行悬浮混合。冰藏保存，直到使用。
3. 室温下解冻固定液。冰藏保存，直到使用。
4. 准备渗透缓冲液。
   1. 在37°C下，用手托住10倍渗透缓冲液。利用手中的体温解冻，并经常检查解冻是否完成。
   2. 将10倍原汁原汁1：10稀释在离心管中去离子水中。通过倒置或再悬浮，上下移液混合成分。冰藏保存，直到使用。
5. 在室温下解冻400倍蛋白标记、100倍荧光叠氮化物、100倍环己酰亚胺、DNA染色和20倍还原剂。使用时保持冰敷在黑暗环境中。不用时用锡纸盖住染料，或者放在2°C的冰箱里保存。

2. 对照组和实验细胞的标记

注意：该方案使用稳定的上皮性乳腺癌MDA-MB-231细胞开发。任何粘附细胞系都可以使用。以下所有步骤均使用96孔板，所有体积和浓度均计算为两种测试化合物和两个工作体积为100微升的对照组。

1. 培养附着性哺乳动物细胞
   注意：细胞应在达到80-90%汇聚率前通过，以保持健康的指数级生长，防止接触抑制或分化。
2. 将一瓶冷冻保存的细胞解冻至室温，然后用合适的培养基稀释。
3. 用离心机分离悬浮液，让细胞沉淀并抽取上清液。将沉淀重新悬浮到新鲜培养基中，转移到相应密度的新烧瓶中。
4. 当细胞达到80%的汇合度时，取出培养基并从瓶中抽取古老培养基。然后用无菌PBS冲洗细胞，去除残留血清，该血清抑制胰蛋白酶。加入胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞层，培养3-5分钟或细胞在37°C下脱离。
5. 加入含完全血清培养基使胰蛋白酶失活，然后将细胞悬浮液转移到管子中，轻轻混合，计数细胞数。
6. 筛分板中的种子细胞以适当的分离比例（如1：3或1：5）稀释细胞，放入新培养基的新鲜瓶中并培养（通常为37°_C，CO2为5%）以获得所需的细胞浓度。
   注：在此描述的实验中，细胞系在每孔2 × 10⁴ （96孔板）中进行培养，并在37°C下培养12小时。

3. 添加化合物

1. 准备母混音A。
   1. 把离心管标记为“A”。移液器将598.5微升培养基和1.5微升蛋白标记液移入“A”中。通过上下移液，重新悬浮混合物以确保均匀。
2. 准备母混B。
   1. 把离心管标记为“B”。移液器将1.5微升蛋白标记、6.6微升环己酰胺和591.9微升培养基注入“B”中。通过上下移液，重新悬浮混合物以确保均匀。
3. 用所需化合物（图1）、阳性和阴性对照处理细胞。
   1. 从培养箱中取出细胞，并通过抽吸取出培养基。倾斜板子，从孔侧面吸气，而不是中心，以防止细胞受到扰动。
   2. 移液器将1微升测试化合物移入井中，1微升测试化合物载体（0.1% v/v DMSO）移液器入井。对于重复研究，将每个样品加入第二口井，重复此过程。向这些孔中加入99微升主混合液A。轻轻地以斜角度移液器插入孔侧，以防止细胞的动力学破坏。
      注意：化合物筛选中DMSO的最大浓度取决于细胞类型和检测方法，但一般指南为：0.1-0.5% DMSO——对大多数细胞基检测法通常安全且毒性极低;DMSO为1%——DMSO常用且适用于多种细胞类型，短期检测中最高且可接受。
   3. 移液器将100微升主混合液B分成两孔。移液器斜插在井侧，防止细胞受损。
   4. 轻轻敲击板，通过将所需成分与细胞混合实现。在37°C下培养细胞0.5-2小时。

4. 实验终止及细胞清洗

1. 通过吸入去除培养基。倾斜板子，从孔侧面吸气，而不是中心，以防止细胞受到扰动。
2. 向每个孔中加入100微升PBS缓冲液，并以900 ×克 离心5分钟。
3. 通过抽吸去除PBS缓冲液。

5. 固定与渗透

1. 每孔加入100微升固定液。将细胞在室温下、黑暗环境中孵育15分钟。
2. 通过抽吸去除固定液。倾斜板，从井侧而非中心吸气。
3. 用100微升洗涤液冲洗细胞，然后通过吸入法取出缓冲液。重复这个步骤两次。
4. 向每个孔加入100微升渗透缓冲液，并在室温下孵育10分钟。
5. 通过抽吸去除渗透缓冲液。倾斜板，从井侧而非中心吸气。

6. 蛋白质反应与染色

1. 准备反应鸡尾酒主调配液。
   1. 向离心管加入651微升PBS缓冲液、7.0微升100倍铜试剂、7微升荧光叠氮化物，最后35微升还原剂。重新休用该混合物以确保均匀。
      注意：添加试剂时请严格按照这个顺序进行。准备后15分钟内使用。
2. 向每个孔加入100微升反应混合物。将细胞在室温下、黑暗环境中孵育30分钟，以防止光漂白。
3. 离心机电池在900× 克 下加热5分钟。通过添加空板来平衡离心机，以均匀分配重量。通过吸入去除混合物。
4. 用100微升洗涤液冲洗细胞，然后通过吸入法取出缓冲液。重复这个步骤两次。

7. DNA染色

1. 准备1倍稀释的总DNA染色，并向每个孔加入100微升。在室温下，在黑暗环境中孵育20分钟，以防止光漂白。
2. 将板子以900× 克 离心5分钟。通过添加空板来平衡离心机，以均匀分配重量。通过吸入去除混合物。
3. 用100微升洗涤液冲洗细胞，然后通过吸入法取出缓冲液。重复这个步骤两次。
4. 用100微升冷却PBS缓冲液重新悬浮细胞，准备成像。

8. 成像

1. 将车牌插入车牌读卡器。
2. 把 放大 倍率设为 20倍。
3. 用GFP 469/525 nm通道分析核染色。使用自动分位和自动对焦来提升成像效果。
4. 用Texas Red 586/647nm通道分析活性蛋白合成。使用自动分位和自动对焦来提升成像效果。

Results

该检测利用荧光来可视化和量化不同天然产物抑制蛋白质合成的能力。环己酰亚胺（CHX）是一种已知的蛋白质合成抑制剂，其作用机制涉及在¹¹条延长过程中干扰易位过程。本研究通过绿色荧光核染料检测到活细胞。OPP是普霉素的衍生物，能共价结合于新生蛋白¹²。MDA-MB-231细胞系因其广泛可及性和可靠的实验表现，成为了一个合适的模型¹³。在铜存在下，荧光叠氮化物与OPP发生点击化学反应，从而通过红色荧光检测到活性蛋白质合成。如果检测的化合物抑制蛋白质合成，细胞显示为绿色，随后红色细胞数量减少（见图2A-D）。抑制癌细胞中的蛋白质合成可以成为阻止或减缓细胞增殖、诱导细胞凋亡或其他细胞死亡方式的有力工具。

检测控制是该方案的关键组成部分。载体处理细...

Discussion

该方案提供了一种荧光筛查方法，用于检测天然产物和小分子，以评估其抑制蛋白质合成的能力。该协议的简洁性使本科研究人员能够正确实施，从而为科学知识做出实质性贡献。该方案要求基本了解生物方法和技术，步骤需谨慎执行以确保准确可靠的结果。

例如，协议步骤2.1要求所有井的单元分布均匀且定量准确，以确保可重复性。不准确的细胞计数会改变化合物与细胞的比例，从而影响剂量-反应关系并干扰数据解释。在步骤3.3.2中，以一定角度添加化合物以防止细胞承受剪切应力。同样，在孔边缘吸取培养基，板倾斜以避免扰动细胞单分子层。细胞脱离表明机械性破坏已发生¹⁵。脱离细胞通过显微镜可识别为非粘附的球形悬浮细胞，其形态变化与健康附^{着细胞典型}的扁平外观不同。

在协议步骤5.2中，修复后应简要检查这些细胞。固定单元的固定失败或作不当可能导致单元层叠加折叠，阻碍结果的可视化。简短的显微镜检查可以验证细胞在孔...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
安捷伦Biotek Cytation 1细胞成像多模式读取器	安捷伦	BTCYT1V
化合物1（脱氢abietylamine，CAS 1446-61-3）	伊娜峰	EN300-7409771
化合物2（巴库奇醇，CAS 10309-37-2）	化学面孔	CFN99047
赫雷厄斯·梅加弗格 16R	热力科学	75004271
Ibidi Gmbh-滑套96孔板	伊比迪	80826
MDA-MB-231细胞系	空军交通管制委员会	ATCC中队HTB-26
磷酸盐缓冲盐水pH 7.4	空军交通管制委员会	ATCC 30-2200
蛋白质合成检测套件（绿色）	阿布卡姆	AB239725