本方案介绍了一种优化的荧光检测筛选方法，用于鉴定天然产物/小分子蛋白合成抑制剂。该方法具有良好的实用性，既适用于本科生药物发现技术的教学，也适用于药物化学研究项目的实施。
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本文内容
摘要
摘要
天然产物是多种疾病（尤其是癌症）治疗化合物的重要来源。与完全合成的化合物相比，研究人员通过将这些生物分子作为药物发现中的结构模板，实现了更快的研发速度和更高的生物学有效性。蛋白质合成通路已成为天然产物的一个极具吸引力的作用靶点，特别是因其参与了难治性癌症的发生发展过程。源自Streptomyces griseus的强效蛋白质合成抑制剂放线菌酮，便是此类天然化合物潜力的典型代表。当这些天然产物衍生物被开发为类药分子时，确认其蛋白质合成抑制活性仍是关键的验证步骤。本研究的主要目标是提供一种适合本科生操作的、用于快速评估化合物抑制活性的实验方案。该方案采用荧光底物结合先进的荧光显微技术，系统性地检测并量化这些天然产物的抑制能力。研究考察了来源于两种植物物种的化合物：Pinus sylvestris 和 Psoralea corylifolia。以放线菌酮作为参照抑制剂，这两种天然产物均表现出不同程度的蛋白质合成抑制活性。
引言
蛋白质合成涉及高度调控的过程：转录和翻译。在转录过程中，基因的DNA序列被复制，生成信使RNA（mRNA）。RNA聚合酶发挥作用，使DNA双螺旋解旋，并以其中一条链为模板合成互补的mRNA分子。一旦mRNA完全形成，便从细胞核转运至细胞质进行翻译。翻译发生在核糖体中，mRNA作为模板指导氨基酸组装成多肽链。该多肽链在离开核糖体的出口通道后，折叠形成具有功能的蛋白质。转录主要由转录因子、染色质修饰和调控性RNA进行调控，而翻译则受起始因子、信号通路和RNA稳定性机制的调控。这些调控系统使细胞能够维持正常的细胞功能，并有效应对压力或损伤1。
绝大多数人类癌症——约85%——表现为实体瘤2。尽管这些肿瘤在具体特征和行为上可能存在显著差异，但它们往往具有一些共同的生理特性与模式，例如无论其病因或解剖位置如何，均表现出蛋白质合成的上调3。癌细胞通过劫持翻译机制来满足其高能量需求和不受控制的生长，从而导致蛋白质合成失调。这种重编程是由于几乎所有主要致癌信号通路失调所致，可促进细胞存活、增殖和转移，同时抑制细胞死亡通路4。在肿瘤细胞中，核糖体生成机制处于过度活跃状态，从而实现蛋白质产量增加和快速细胞分裂。由于这种增强的蛋白质合成对癌症的存活至关重要，因此靶向并阻断该过程的治疗方法有望成为潜在的治疗策略5。因此，针对癌症特异性翻译因子、独特的核糖体组成或调控蛋白质合成的异常信号通路的研究，可能产生更具靶向性的抑制剂，并具有更优的治疗窗口。
由于天然产物（NPs）具有广泛的生物活性，利用其骨架结构开发用于癌症治疗的特异性蛋白质合成抑制剂是一种颇具前景的策略6,7。天然产物可靶向蛋白质合成机制中的不同组分，从核糖体结合到干扰起始因子或延伸过程，使其成为开发针对实体瘤的蛋白质合成抑制剂药物的重要起点6。快速筛选具有理想活性的化合物的能力，是药物发现平台高效识别天然产物活性分子的关键切入点。通常，化合物的高通量筛选采用荧光检测法，以快速缩小候选先导分子的范围8。
全球科学家依赖基于荧光的技术作为分析生物系统的重要工具。这些方法被广泛用于研究细胞过程，使研究人员能够实时追踪生物分子相互作用9。当与生物正交点击化学反应结合时，这些方法可实现对蛋白质合成的精确可视化10。本文介绍的荧光蛋白质合成检测是一种非放射性技术，用于评估蛋白质合成，该技术利用了O-丙炔基嘌呤霉素（OPP），一种含有炔基、可穿透细胞膜的嘌呤霉素类似物。在细胞处理后，OPP会掺入正在延伸的多肽链的C末端，导致翻译终止。随后通过铜催化的点击化学反应结合5 FAM-叠氮化物对这些带有炔基标记的截短蛋白进行检测。
该荧光检测法是一种有价值的研究工具，也是一种便于本科生培训的化学生物学方法。通过提供一种简便高效、数据处理量少的实验方案，使学生能够获得现代药物发现技术的实践经验，并加速药物发现进程。随着对新型蛋白质合成抑制剂需求的不断增长，该方法为本科生提供了有意义的研究机会，同时推动了癌症治疗领域的发展。
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方案
1. 从试剂盒中制备试剂
注意：所有试剂在使用前应充分混匀，离心后置于冰上保存。
- 准备并获取蛋白质合成抑制试剂盒、PBS缓冲液、细胞培养基、细胞培养处理板、15 mL锥形无菌聚丙烯离心管、2 mL离心管、p10、p20、p200和p1000移液器及相应吸头。
- 配制洗涤缓冲液。
- 将10倍浓缩洗涤缓冲液置于手心，通过体温在37 °C下解冻。利用手部热量解冻，并频繁检查是否完全溶解。
- 在离心管中用去离子水将10倍浓缩液按1:10比例稀释。通过倒置混匀或上下吹打重悬混合。置于冰上保存，待用。
- 将固定液在室温下解冻。使用前置于冰上保存。
- 配制通透缓冲液。
- 将10倍浓缩通透缓冲液置于手心，通过体温在37 °C下解冻。利用手部热量解冻，并频繁检查是否完全溶解。
- 在离心管中用去离子水将10倍浓缩液按1:10比例稀释。通过倒置或上下吹打重悬混合组分。置于冰上保存，待用。
- 将400倍蛋白标记剂、100倍荧光叠氮化物、100倍环己酰亚胺、DNA染料和20倍还原剂在室温下解冻。使用时置于避光环境的冰上。不使用时用铝箔包裹染料或将其存放于2 °C冰箱中。
2. 标记对照细胞和实验细胞
注意：本实验方案使用稳定的贴壁性上皮乳腺癌 MDA-MB-231 细胞系开发。任何贴壁细胞系均可使用。以下所有步骤均采用 96 孔板，所有体积和浓度均按两种待测化合物和两种对照组、工作体积为 100 µL 的条件计算。
- 培养贴壁的哺乳动物细胞
注意：为保持细胞健康并处于指数生长期，防止接触抑制或分化，应在细胞融合度达到80-90%之前进行传代。 - 将一管冻存细胞在室温下解冻，然后用适当的培养基稀释。
- 离心悬浮液以沉淀细胞，并吸除上清液。将沉淀重悬于新鲜培养基中，按适当细胞密度接种至新的培养瓶中。
- 当细胞融合度达到80%时，移除培养基并吸去旧的生长培养基。随后用无菌PBS洗涤细胞，以去除会抑制胰蛋白酶活性的残留血清。加入胰蛋白酶-EDTA溶液覆盖细胞层，在37 °C孵育3-5分钟，直至细胞脱落。
- 加入含血清的完全培养基以灭活胰蛋白酶，然后将细胞悬液转移至离心管中，轻轻混匀并进行细胞计数。
- 将细胞接种至筛选用培养板中——按适当的传代比例（例如1:3或1:5）将细胞稀释后接种至含新鲜培养基的新培养瓶中，并在适宜条件下孵育（通常为37 °C、5% CO2），以获得所需细胞浓度。
注意：本实验所描述的条件下，细胞系以每孔2 × 104个细胞的密度接种于96孔板中，并在37 °C孵育12小时。
3. 添加化合物
- 配制主混合液 A。
- 标记一个离心管为 "A"。向标记为 "A" 的离心管中加入 598.5 µL 培养基和 1.5 µL 蛋白标记物。通过上下吹打重悬混合物，确保其均匀。
- 配制主混合液 B。
- 标记一个离心管为 "B"。向标记为 "B" 的离心管中加入 1.5 µL 蛋白标记物、6.6 µL 环己酰亚胺和 591.9 µL 培养基。通过上下吹打重悬混合物，确保其均匀。
- 用目标化合物、阳性对照和阴性对照处理细胞（图 1）。
- 从培养箱中取出细胞，通过抽吸去除生长培养基。倾斜培养板，从孔的侧壁而非中心位置抽吸，以避免扰动细胞。
- 向一个孔中加入 1 µL 待测化合物，向另一孔中加入 1 µL 化合物溶剂（0.1% v/v DMSO）。对于重复实验，将每种样品加入第二个孔中，并重复此步骤。向这些孔中加入 99 µL 主混合液 A。以一定角度沿孔壁轻柔吹打，避免对细胞造成动力学干扰。
注意：化合物筛选中 DMSO 的最高浓度取决于细胞类型和实验体系，一般指导原则如下：0.1–0.5% DMSO 对大多数基于细胞的实验是安全的，毒性最小；1% DMSO 是短期实验中许多细胞类型常用的最高可接受浓度。 - 向两个孔中各加入 100 µL 主混合液 B。沿孔壁以一定角度吹打，避免扰动细胞。
- 轻轻敲击培养板，使目标组分与细胞充分混匀。将细胞在 37 °C 下孵育 0.5–2 小时。
4. 实验终止与细胞清洗
- 通过抽吸去除培养基。倾斜培养板，从孔的侧边而非中心进行抽吸，以避免扰动细胞。
- 向每个孔中加入 100 µL PBS 缓冲液，并以 900 × g 离心 5 分钟。
- 通过抽吸去除 PBS 缓冲液。
5. 固定和透化
- 向每个孔中加入 100 µL 固定液。将细胞在室温下避光孵育 15 分钟。
- 通过抽吸去除固定液。倾斜培养板，从孔的侧壁处抽吸，避免直接抽吸孔的中心区域。
- 用 100 µL 洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过抽吸去除缓冲液。重复此步骤 2 次。
- 向每个孔中加入 100 µL 通透缓冲液，在室温下孵育 10 分钟。
- 通过抽吸去除通透缓冲液。倾斜培养板，从孔的侧壁处抽吸，避免直接抽吸孔的中心区域。
6. 蛋白质反应与染色
- 配制反应鸡尾酒主混合液。
- 在离心管中依次加入 651 µL PBS 缓冲液、7.0 µL 100 倍铜试剂、7 µL 荧光叠氮化物，最后加入 35 µL 还原剂。充分重悬混合物以确保均匀。
注意：添加试剂时必须遵循此精确顺序。配制后 15 分钟内使用。
- 在离心管中依次加入 651 µL PBS 缓冲液、7.0 µL 100 倍铜试剂、7 µL 荧光叠氮化物，最后加入 35 µL 还原剂。充分重悬混合物以确保均匀。
- 向每个孔中加入 100 µL 反应鸡尾酒溶液。将细胞在避光环境中室温孵育 30 分钟，以防止光漂白。
- 以 900 × g 离心 5 分钟。通过添加空板平衡离心机，使重量分布均匀。用抽吸法去除上清液。
- 用 100 µL 洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过抽吸去除缓冲液。重复此步骤 2 次。
7. DNA 染色
- 制备总DNA染料的1倍稀释液，向每孔中加入100 µL。将细胞在室温下避光孵育20分钟，以防止荧光淬灭。
- 以900 × g 离心5分钟。通过添加空板平衡离心机，使重量分布均匀。用抽吸法移除混合液。
- 用100 µL洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过抽吸去除缓冲液。重复此步骤2次。
- 用100 µL预冷的PBS缓冲液重悬细胞，以准备成像。
8. 成像
- 将培养板放入酶标仪中。
- 将放大倍数设置为20倍。
- 使用GFP 469/525 nm通道分析细胞核染色。采用自动合并像素（autobinning）和自动对焦（autofocus）以提高成像效果。
- 使用Texas Red 586/647 nm通道分析活性蛋白质合成。采用自动合并像素（autobinning）和自动对焦（autofocus）以提高成像效果。
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结果
本实验利用荧光技术来观察并量化不同天然产物抑制蛋白质合成的能力。环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）是一种已知的蛋白质合成抑制剂，其作用机制是干扰延伸过程中肽链的转位过程11。在本研究中，使用绿色荧光核染料检测活细胞。OPP 是嘌呤霉素的衍生物，可共价结合新生蛋白质12。MDA-MB-231 细胞系因其广泛可及性和稳定的实验表现，被选为合适的模型13。在铜离子存在下，荧光叠氮化合物与 OPP 发生点击化学反应，从而通过红色荧光检测活跃的蛋白质合成。若受试化合物具有抑制蛋白质合成的作用，则细胞呈现绿色，而显示红色荧光的细胞数量减少（图 2A-D）。在癌细胞中抑制蛋白质合成可成为阻止或减缓细胞增殖并诱导凋亡或其他细胞死亡方式的有效手段4。
检测对照是本方案的关键组成部分。经溶剂处理的细胞（D...
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讨论
本方案提供了一种荧光检测方法，用于筛选天然产物和小分子，以评估其抑制蛋白质合成的能力。该方案操作简便，便于本科生研究人员正确实施，从而对科学知识做出实质性贡献。本方案要求具备生物学方法与技术的基本理解，各步骤需谨慎执行，以确保结果的准确性和可靠性。
例如，实验步骤 2.1 要求所有孔中的细胞分布均匀且定量准确，以确保实验的可重复性。细胞计数不准确会改变化合物与细胞的比例，从而影响剂量-反应关系，并干扰数据解读。在步骤 3.3.2 中，应以一定角度加入化合物，以避免对细胞造成剪切应力。同样，吸除培养基时应将培养板倾斜，从孔的边缘进行操作，以避免扰动细胞单层。细胞脱落表明已发生机械性损伤15。通过显微镜可识别脱落的细胞：这些细胞呈悬浮状态、不贴壁、形态呈球形，其形态学变化与健康贴壁细胞典型的扁平形态明显不同16。
在实验步骤5.2中，固定后应短暂检查细胞。固定不成功或对固定后的细胞操作不当，可能导致细胞层折叠和堆积，从而影响结果的观察。...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了NIGMS资助项目R15GM148983、路易斯安那州校董会LEQSF(2021-25)-RD-A-05项目以及美国国家科学基金会资助项目OIA-1946231（授予F.R.）的部分支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 安捷伦 BioTek Cytation 1 细胞成像多功能读板仪 | Agilent | BTCYT1V | |
| 化合物 1（脱氢枞胺，CAS 1446-61-3） | Enamine | EN300-7409771 | |
| 化合物 2（补骨脂酚，CAS 10309-37-2） | ChemFaces | CFN99047 | |
| Heraeus Megafuge 16R 离心机 | Thermo Scientific | 75004271 | |
| Ibidi Gmbh 96 孔成像板 | Ibidi | 80826 | |
| MDA-MB-231 细胞系 | ATCC | ATCC HTB-26 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | ATCC | ATCC 30-2200 | |
| 蛋白质合成检测试剂盒（绿色） | Abcam | Ab239725 |
参考文献
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