一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

摘要

本方案介绍了一种优化的荧光检测筛选方法，用于鉴定天然产物/小分子蛋白合成抑制剂。该方法具有良好的实用性，既适用于本科生药物发现技术的教学，也适用于药物化学研究项目的实施。

摘要

天然产物是多种疾病（尤其是癌症）治疗化合物的重要来源。与完全合成的化合物相比，研究人员通过将这些生物分子作为药物发现中的结构模板，实现了更快的研发速度和更高的生物学有效性。蛋白质合成通路已成为天然产物的一个极具吸引力的作用靶点，特别是因其参与了难治性癌症的发生发展过程。源自Streptomyces griseus的强效蛋白质合成抑制剂放线菌酮，便是此类天然化合物潜力的典型代表。当这些天然产物衍生物被开发为类药分子时，确认其蛋白质合成抑制活性仍是关键的验证步骤。本研究的主要目标是提供一种适合本科生操作的、用于快速评估化合物抑制活性的实验方案。该方案采用荧光底物结合先进的荧光显微技术，系统性地检测并量化这些天然产物的抑制能力。研究考察了来源于两种植物物种的化合物：Pinus sylvestris 和 Psoralea corylifolia。以放线菌酮作为参照抑制剂，这两种天然产物均表现出不同程度的蛋白质合成抑制活性。

引言

蛋白质合成涉及高度调控的过程：转录和翻译。在转录过程中，基因的DNA序列被复制，生成信使RNA（mRNA）。RNA聚合酶发挥作用，使DNA双螺旋解旋，并以其中一条链为模板合成互补的mRNA分子。一旦mRNA完全形成，便从细胞核转运至细胞质进行翻译。翻译发生在核糖体中，mRNA作为模板指导氨基酸组装成多肽链。该多肽链在离开核糖体的出口通道后，折叠形成具有功能的蛋白质。转录主要由转录因子、染色质修饰和调控性RNA进行调控，而翻译则受起始因子、信号通路和RNA稳定性机制的调控。这些调控系统使细胞能够维持正常的细胞功能，并有效应对压力或损伤¹。

绝大多数人类癌症——约85%——表现为实体瘤²。尽管这些肿瘤在具体特征和行为上可能存在显著差异，但它们往往具有一些共同的生理特性与模式，例如无论其病因或解剖位置如何，均表现出蛋白质合成的上调³。癌细胞通过劫持翻译机制来满足其高能量需求和不受控制的生长，从而导致蛋白质合成失调。这种重编程是由于几乎所有主要致癌信号通路失调所致，可促进细胞存活、增殖和转移，同时抑制细胞死亡通路⁴。在肿瘤细胞中，核糖体生成机制处于过度活跃状态，从而实现蛋白质产量增加和快速细胞分裂。由于这种增强的蛋白质合成对癌症的存活至关重要，因此靶向并阻断该过程的治疗方法有望成为潜在的治疗策略....

方案

1. 从试剂盒中制备试剂

注意：所有试剂在使用前应充分混匀，离心后置于冰上保存。

1. 准备并获取蛋白质合成抑制试剂盒、PBS缓冲液、细胞培养基、细胞培养处理板、15 mL锥形无菌聚丙烯离心管、2 mL离心管、p10、p20、p200和p1000移液器及相应吸头。
2. 配制洗涤缓冲液。
   1. 将10倍浓缩洗涤缓冲液置于手心，通过体温在37 °C下解冻。利用手部热量解冻，并频繁检查是否完全溶解。
   2. 在离心管中用去离子水将10倍浓缩液按1:10比例稀释。通过倒置混匀或上下吹打重悬混合。置于冰上保存，待用。
3. 将固定液在室温下解冻。使用前置于冰上保存。
4. 配制通透缓冲液。
   1. 将10倍浓缩通透缓冲液置于手心，通过体温在37 °C下解冻。利用手部热量解冻，并频繁检查是否完全溶解。
   2. 在离心管中用去离子水将10倍浓缩液按1:10比例稀释。通过倒置或上下吹打重悬混合组分。置于冰上保存，待用。
5. 将400倍蛋白标记剂、100倍荧光叠氮化物、100倍环己酰亚胺、DNA染料和20倍还原剂在室温下解冻。使用时置于避光环境的冰上。不使用时用铝箔包裹染料或将其存放于2 °C冰箱中。

2. 标记对照细胞和实验细胞

结果

本实验利用荧光技术来观察并量化不同天然产物抑制蛋白质合成的能力。环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）是一种已知的蛋白质合成抑制剂，其作用机制是干扰延伸过程中肽链的转位过程¹¹。在本研究中，使用绿色荧光核染料检测活细胞。OPP 是嘌呤霉素的衍生物，可共价结合新生蛋白质¹²。MDA-MB-231 细胞系因其广泛可及性和稳定的实验表现，被选为合适的模型¹³。在铜离子存在下，荧光叠氮化合物与 OPP 发生点击化学反应，从而通过红色荧光检测活跃的蛋白质合成。若受试化合物具有抑制蛋白质合成的作用，则细胞呈现绿色，而显示红色荧光的细胞数量减少（图 2A-D）。在癌细胞中抑制蛋白质合成可成为阻止或减缓细胞增殖并诱导凋亡或其他细胞死亡方式的有效手段⁴。

检测对照是本方案的关键组成部分。经溶剂处理的细胞（D.......

讨论

本方案提供了一种荧光检测方法，用于筛选天然产物和小分子，以评估其抑制蛋白质合成的能力。该方案操作简便，便于本科生研究人员正确实施，从而对科学知识做出实质性贡献。本方案要求具备生物学方法与技术的基本理解，各步骤需谨慎执行，以确保结果的准确性和可靠性。

例如，实验步骤 2.1 要求所有孔中的细胞分布均匀且定量准确，以确保实验的可重复性。细胞计数不准确会改变化合物与细胞的比例，从而影响剂量-反应关系，并干扰数据解读。在步骤 3.3.2 中，应以一定角度加入化合物，以避免对细胞造成剪切应力。同样，吸除培养基时应将培养板倾斜，从孔的边缘进行操作，以避免扰动细胞单层。细胞脱落表明已发生机械性损伤¹⁵。通过显微镜可识别脱落的细胞：这些细胞呈悬浮状态、不贴壁、形态呈球形，其形态学变化与健康贴壁细胞典型的扁平形态明显不同¹⁶。

在实验步骤5.2中，固定后应短暂检查细胞。固定不成功或对固定后的细胞操作不当，可能导致细胞层折叠和堆积，从而影响结果的观察。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
安捷伦 BioTek Cytation 1 细胞成像多功能读板仪	Agilent	BTCYT1V
化合物 1（脱氢枞胺，CAS 1446-61-3）	Enamine	EN300-7409771
化合物 2（补骨脂酚，CAS 10309-37-2）	ChemFaces	CFN99047
Heraeus Megafuge 16R 离心机	Thermo Scientific	75004271
Ibidi Gmbh 96 孔成像板	Ibidi	80826
MDA-MB-231 细胞系	ATCC	ATCC HTB-26
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	ATCC	ATCC 30-2200
蛋白质合成检测试剂盒（绿色）	Abcam	Ab239725