使用 DNA 荧光发光适配子作为信号报告基因进行序列特异性核酸分析的分流杂交探针

摘要

该协议概述了利用荧光发光适配体 DAP-10-42 作为信号报告基因的分离杂交探针的设计，以及它们在核酸检测和单核苷酸取代靶标之间区分的应用。

摘要

与用于瞬时核酸检测的传统杂交探针不同，基于 DNA 的荧光发光适配子 （FLAP） 在生物分析分析中很有前途，因为它们提供了低成本的荧光信号读数，而无需用荧光团和/或淬灭基团标记核酸信号报告基因。相反，FLAP 非共价结合染料配体，染料配体在水溶液中表现出固有的低荧光，但在 FLAP 结合时变得高度发光。该协议描述了一种利用 DAP-10-42 设计分体发光适配子传感器 （SLAS） 的算法，DAP-10-42 是迄今为止报道的最高效的 DNA FLAP。当配备与目标核酸靶标互补的核酸序列时，SLAS 是一种很有前途的核酸分析工具，允许对核酸靶标进行序列特异性检测，选择性低至一个核苷酸，从而能够分析单核苷酸替换 （SNS）。SLAS 具有基于荧光的无标记信号读出的优势，可以使用传统的基于比色皿的荧光分光光度计、便携式荧光计进行测量，也可以在使用手持式光源激发时目视观察。SLAS 方法有利于疾病诊断、环境监测和生物分子研究中的生物传感应用。

引言

通常使用杂交探针进行核酸分析，以检测和定量特异性 DNA/RNA 序列¹。最成功的杂交探针之一是 Molecular Beacon （MB） 探针，它是一种发夹状 DNA
在相反的末端用荧光基团和淬灭基团标记的寡核苷酸 ^2,3。它可即时（无需从探针的过量中洗涤探针-靶标复合物）检测是否存在与探针环片段互补的核酸序列，通常用于定量 PCR （qPCR）。需要将两种染料（荧光基团和淬灭基团）共价连接到探针的寡核苷酸序列上，这增加了成本，特别是当需要靶向新核酸序列的新 MB 探针时。或者，MB 探针可以用作多组分（分裂）杂交探针形式的信号报告基因，其中两个未标记的寡核苷酸与靶标和 MB 探针报告基因⁴ 相互作用。多组分探针方法增强了核酸识别的选择性，并改善了探针与结构化靶标的结合 ^5,6,7，然而，这种方法并不能消除用荧光团对报告基因进行共价标记的需要⁸。

荧光发光适配子 （FLAP）⁹ 是对低荧光环境敏感染料（荧光原）具有亲和力的适配体，其中 FLAP 结合可增强荧光歧管的荧光。与荧光标记的探针和信号报告基因不同，FLAP 不需要用一种或多种染料共价标记传感元件，因此具有无标记荧光检测的优势¹⁰。这在优化步骤中尤为重要，因为需要测试数十种核酸构建体以获得令人满意的检测性能。此外，可以通过调整荧光原和/或 FLAP 传感器的浓度来优化 FLAP 分析，而不是改变传感器的设计。这些优势对于低预算的研究和教学实验室来说可能非常重要。DNA FLAP 作为多组分杂交探针的信号报告基因特别有前途，称为分体式发光适配子传感器 （SLAS）¹¹。迄今为止报道的最有效的 DNA FLAP 是 DAP-10-42，它最初被选择用于增强 dapoxy 磺酰染料的荧光¹²，具有结合和增强多种芳基甲烷染料（例如金胺 O、AO;结晶紫、CV）的荧光的混杂能力¹³。DAP-10-42 已转换为 SLAS，用于核酸分析 13,14,15。

此处描述的方法的目标是使用无标记的 SLAS 链和荧光染料作为缓冲组分，对感兴趣的核酸靶标进行序列特异性分析。该协议描述了一种基于 DAP-10-42 设计 SLAS 的算法，并强调了 SLAS 在高选择性检测核酸序列方面的性能，这些序列在单核苷酸上存在差异。

SLAS 核酸检测分析需要两个定制合成的未修饰 DNA 寡核苷酸，终浓度为 0.5-1 μM，以获得最佳性能。此处描述的方案使用市售的 Auramine O （AO） 染料作为荧光原。测定中的最终 AO 浓度范围为 1-10 μM，以确保在空白存在特定核酸靶标（没有靶标; 补充图 1）。测定缓冲液的必要组分是钾离子和镁离子（补充图 2）。钾离子 （1.25-40 mM） 稳定用作信号报告基因的 FLAP 的拟议 G-四链体结构域。镁离子 （2.5-50 mM） 可减少 SLAS -靶标相互作用时带负电荷的磷酸基团的排斥。使用信号报告域报告序列的 SLAS 测定温度不应超过 28 °C，以避免性能损失¹⁶。

SLAS 与单链核酸靶标兼容，例如不对称 PCR 或等温 DNA 扩增反应（例如重组酶聚合酶扩增、RPA¹⁷）的 DNA 扩增子、来自转录介导扩增 （TMA） 或基于核酸序列的扩增 （NASBA） 的 RNA 产物¹⁸，以及 miRNA、rRNA 或 ncRNA 等天然 RNA 分子。使用 SLAS 方法可以检测靶标核苷酸序列到单个核苷酸的变化^13,14。

方案

1. 以 DAP-10-42 作为信号报告器的分体式发光适配子传感器 （SLAS） 的设计

1. 设计构成 SLAS 的两条未修饰的 DNA 寡核苷酸链的序列。使用含有 DAP-10-42 核苷酸 （nts） 4,6-39 的片段（表 1，图 1A）。
2. 通过去除 nt 5 位处凸起的胸腺嘧啶残基，将茎 1 的序列（nts 1-8 和 36-42）转换为茎 1'，将茎 1 的序列缩短至 4 bp（nts 4,6-8 和 36-39），并添加末端 CG bp（图 1A，步骤 1）。此外，其中一个 SLAS 链包含 DAP-10-42 核心序列的 nts 9-29，而另一个 SLAS 链包含序列的 nts 30-35。
3. 用 d（GGTCAT） 扩展含有 nts 9-29 的片段的 3'-末端序列，用 d（ATGACC） 延伸含有 nts 30-35 片段的 5'-末端序列，形成 6-bp 茎 2（图 1A，步骤 2）。
   注：DAP-10-42 中茎 1 的碱基对 T4-A39、A6-T38、C7-G37 和 G8-C36 是适配体的发光功能所必需的。茎 1' 的序列只能在末端 bp 处修饰，可以是 G-C、A-T、T-A 碱基对，也可以根据需要扩展 1-2 个碱基对。词干 2 的顺序是任意的，可以更改。然而，建议保持茎 2 的热力学稳定性，除非测定温度升高到 28 °C 以上。 如果观察到基于 SLAS 的荧光测定的高背景，缩短或以其他方式破坏茎 2 可防止没有靶标的染料过早结合。也允许在 nts 28-29、27-28 或 26-27 之间分裂 DAP-10-42 核苷酸序列，而不是在 nts 29-30 之间分裂（图 1B）。
4. 为了根据核酸靶标或目标定制设计的 SLAS，通过 d（TT） 接头用与靶标结合片段（臂）互补的 DNA 序列延伸茎 1'（图 1A，步骤 3）。这产生了构成探针的链 SLAS-U 和 SLAS-S 序列。
5. 使 SLAS-S 的靶标结合臂与包含 SNS 位点的靶标的 7-10-nt 片段互补，使 SLAS-U 的靶标结合臂 - 与邻近 SLAS-S 靶标结合臂的靶标的 15-25 nt 片段互补（表 1）。
   注意：是否将 SLAS-S 的靶标结合臂连接到 DAP-10-42 序列的 nt 4 或 nt 39 是可选的（分别为图 1、臂 1 或臂 2）。
6. 使用 UNAFold Web 服务器 （unafold.org）¹⁹ 评估目标靶标与 SLAS-S 和 SLAS-U 的靶标结合臂之间双链体的熔解温度 （T_m）。
   1. 单击网页顶部的 DINAMelt 选项卡;转到应用程序并选择 两态熔解杂交 （补充图 3A）。在“双态熔解杂交”页面上，在左侧框中输入其中一个相互作用序列，在右侧框中输入另一个相互作用序列（补充图 3B）。确保两个序列都按 5' 到 3' 的顺序排列。您可以输入多对交互序列，方法是用分号分隔它们。
   2. 在页面底部，标明检测温度 （22 °C）、一价和二价阳离子浓度（分别为 20 mM 和 25 mM）以匹配检测条件。指示相互作用序列的浓度。
   3. 按 提交 （补充图 3B）。观察结果，包括结合的吉布斯能量变化、焓变和熵变，以及相应双链体的 T_m 值（补充图 3B）。
   4. 确保完全匹配的靶标 （M） 与 SLAS-S 和 SLAS-U 的靶标结合臂之间的双链体的 T_m 值高于测定温度，在当前方案中为 22 °C。在这里，T_m 值分别为 32.2°C 和 74.4 °C（补充图 3C）。
   5. 确保 SLAS-S 和包含 SNS 的不匹配靶标 （MM） 之间的双链体比检测温度低 T_m 。这确保了探针-靶标识别的高选择性，如果 SLAS 结合片段中含有 SNS，则可防止 AO 荧光原向目标核酸分析物发出信号（图 2）。在这里，T_m 为 21.3 °C（补充图 3C），这足以区分错配与匹配的复合物。
   6. 如果需要，通过缩短或延长靶标互补片段来调整靶标结合臂的序列，以满足所示的稳定性要求。
7. 从任何提供定制 DNA 寡核苷酸的商业供应商处获得设计好的 SLAS-S 和 SLAS-U 链，或使用自动寡核苷酸合成仪在内部合成 DNA 链。

图 1：将荧光发光适配体 （FLAP） DAP-10-42 转换为分体发光适配子传感器 （SLAS）。 （一）DAP-10-42¹² 的二级结构是通过 UNAFold Web Server¹⁹ 在 22 °C、20 mM Na⁺、25 mM Mg²⁺ 下的 DNA 折叠应用来预测的。适配体具有发夹二级结构， 其核心 可能折叠成由 茎 1 稳定的 G 四链体基序。为了将 DAP-10-42 转化为 SLAS，（1） 将适配体的 茎 1 缩短至 4 bp，并在两侧附加一个 GC bp 以形成 茎 1';（2） 核心 序列在 NTS 29 和 30 之间分裂，分裂位点的 3'- 和 5'- 侧分别用互补序列 d（GGTCAT） 和 d（ATGACC） 延伸，形成 茎 2;（3） 茎 1' 延伸，序列与目标靶标臂的相邻片段互补 - 靶标结合臂，在靶标结合臂和探针的信号报告域之间有一个 d（TT） 接头。（B） 核心也可以在 nts 28-29、27-28 或 26-27 之间分裂，而不会显着丢失信号和/或荧光倍数增加。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：SLAS 信号生成机制。 SLAS 由两条链 - SLAS-U 和 SLAS-S - 和一种荧光染料（例如，金胺 O;AO） 的在没有目标核酸靶标的情况下，两条链都处于解离状态，无法结合染料;未观察到任何信号（中）。在存在完全匹配的靶标 M 的情况下，SLAS-U 和 SLAS-S 都与 M 的相邻片段杂交，以使核心片段接近。这允许形成染料结合位点。AO 的结合增强了其荧光，其荧光以荧光信号读数的形式测量（左）。在与 SLAS-S 相互作用的片段中存在包含单核苷酸替换 （SNS） 的不匹配靶标 MM 的情况下，只有 SLAS-U 可以与 MM 靶标杂交，而 SLAS-S 处于解离状态。这阻止了染料结合位点的形成，并且没有观察到信号（右）。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 扩增目标序列

1. 扩增要用 SLAS 检测分析的基因片段。对于 PCR 或 RPA 扩增，使用不对称条件（例如，正向引物的添加量是反向引物的 10 倍）以生成单链扩增子。要使用线性指数后 （LATE） PCR²⁰ 扩增 NANOGP8 基因的 126 nt 片段，请使用表 2 中列出的引物序列。在这里，使用了对应于基因 126-nt 片段的单链 DNA 模板（模板 NANOGP8 或模板 G1423C，表 2）。该模板由 Integrated DNA Technologies， Inc. 定制合成。
   1. 通过混合 10 μL 10x 标准 Taq 反应缓冲液、2 μL 10 mM dNTP 混合物（终浓度为 0.2 mM）、10 μL 10 μM 正向引物和 10 μL 1 μM 反向引物（终浓度为 1 μM 和 0.1 μM， ）、0.5 μL 5U/μL Taq DNA 聚合酶、DNA 模板和无核酸酶水。对于无模板控件，请添加水而不是模板。
   2. 使用以下热循环条件：在 95 °C 下初始变性 1 分钟;45 个循环：（1） 在 95 °C 下变性 15 秒，（2） 引物在 60 °C 下退火 30 秒，（3） 引物在 68 °C 下延伸 30 秒;并在 68 °C 下最终延伸 5 分钟。
      注：可以使用基于转录的扩增技术（如 NASBA¹⁸ ）代替 PCR 或 RPA，尤其是在 RNA 模板可用于扩增的情况下。NASBA 以微摩尔范围内的最终产物浓度生成单链 RNA 扩增子，该浓度足够高，可用于下游 SLAS 测定，无需产物浓度。
2. 通过添加 0.1 倍体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.5） 和 3 倍体积的乙醇，用乙醇沉淀扩增的样品。在 -20 °C 下孵育 1 小时，以 12,000-18,000 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
3. 用 70% 乙醇洗涤沉淀，重新离心，然后再次弃去上清液。将沉淀物风干并溶于 10 μL 无核酸酶水中，用于 SLAS 检测。

3. 使用 SLAS 进行荧光检测

1. 制备 AO（0.1 mM 的 DMSO 溶液，10x）、SLAS-S（10 μM 的无核酸酶水，10x）、SLAS-U（10 μM 的无核酸酶水，10x）和 4x 检测缓冲液（80 mM Tris-HCl，pH 7.4,100 mM MgCl_2,80 mM KCl）。
   注：钾离子对于稳定适配体的假定 G-四链体基序是必需的，该基序是染料结合位点的一部分。在 1x 检测缓冲液中，低至 1 mM KCl（在 25 mM MgCl₂ 下）就足以确保在空白（无靶标样品;补充图 2B）。镁离子稳定核酸链的相互作用（SLAS-S、SLAS-U 和靶标之间）。1x 检测缓冲液中 Mg²⁺ 的浓度应至少为 5 mM（20 mM KCl;补充图 2C，D）。在 DMSO 中制备 AO （~1 mM） 的储备溶液。SLAS-S 和 SLAS-U 的储备浓度是任意的，只要保持链的最终浓度，就可以根据需要进行调整（参见讨论中选择最终 SLAS 浓度的基本原理）。
   注意： AO 吞咽有害，与皮肤接触有毒，并怀疑会导致癌症。使用 AO 解决方案时，请始终戴手套。AO 的称量和其储备溶液的制备应在化学罩下进行。
2. 制备包含除目标之外的所有分析组分的预混液。通过将样品体积 （60 μL） 乘以样品数量加 1 （n+1） 来计算预混液体积 （V_混合物）：
   
   样本数 n 应包括必要的阴性对照和阳性对照。
3. 混合 0.25x V_混合物 μL 的 4x 检测缓冲液、 0.1x V_混合物 μL 的 0.1 mM AO、 0.1x V_混合物 μL 的 10 μM SLAS-S 和 0.1x V_混合物 μL 的 10 μM SLAS-S。加入无核酸酶的水至最终体积 ，使其适合在步骤 3.4 中添加的目标体积。涡旋并短暂离心预混液。将 50 μL 预混液分装到 n 个样品管中。
   注：样品体积可以根据用于检测荧光信号的仪器的特性进行调整。等分到样品管中的预混液的体积可以根据步骤 3.4 中添加的目标体积进行调整。应相应地调整为制备预混液而添加的无核酸酶水的体积。例如，如果以最终样品体积的 10% （V/V） 添加含目标的样品，则应将水添加到预混液中，最高可达 0.9x V_混合物。
4. 使用一个样品作为无靶标对照（空白），使用一个样品作为阳性对照。将 10 μL 含靶标的样品添加到预混液 （50 μL） 中，使最终样品体积为 60 μL，含有 10-1000 nM 靶标。对于空白，使用不含核酸酶的水 （10 μL） 代替靶标。对于阳性对照，使用含有靶向序列的合成 DNA 寡核苷酸（例如，靶标 M， 表 1）。加入 10 μL 的 0.6-3 μM 对照品，使最终浓度为 0.1-0.5 μM。
   注：该阳性对照中的高荧光可确保检测按预期工作，即使观察到测试的未知样品出现阴性信号。
5. 混合样品并使用微量离心机旋转。将样品在 22 °C 下孵育 10-60 分钟。信号在 40 分钟到 60 分钟之间仅增加 <15%（图 3）。
6. 使用荧光分光光度计在 475 nm 激发时测量样品在 540 nm 处的荧光。
   注：可以使用便携式荧光计来测量薄壁 PCR 管中的荧光。荧光计需要具有适合检测 AO 荧光的激发和发射滤光片。合适的激发滤光片的一个例子是 495 nm 短通。合适的发射滤光片的一个例子是 510-580 nm。或者，可以使用紫外或蓝光光源在样品中激发 AO 荧光时目视观察信号。
   注意： 如果使用紫外线灯，请佩戴防紫外线护目镜。

图 3：SLAS-29U/30S 信号生成的时间依赖性。 使用荧光分光光度计的动力学模式 （475 nm 激发，540 nm 发射，5 nm 激发/发射狭缝） 在 60 分钟内分析含有 AO 、 SLAS-29U 和 SLAS-30S 的样品。在 5 分钟的时间（用箭头表示），将靶标 M 添加到样品中。数据来自两项独立试验的平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。

结果

使用旨在询问对多形性胶质母细胞瘤 （GBM）（一种侵袭性脑癌）进展很重要的 NANOGP8 基因片段的探针，证明了使用 DAP-10-42 核心作为信号报告基因的 SLAS 的性能²¹。据报道，该片段在癌细胞来源的外泌体的 DNA 货物中含有 SNS²²。因此，SLAS 是根据基因的 SNS 位点量身定制的。合成 DNA 靶标 M 或 MM 分别模拟在 nt 1423 （GenBank NM_001355281.2） 处含有 G 或 C 的 NANOGP8 基因序列，用于证明该方案中的 SLAS 性能。靶标 M 与 SLAS-S 链完全互补，而靶标 MM 包含与 SLAS-S 的 G>C 错配（表 1）。SLAS-U 的靶标结合片段序列与 M 和 MM 靶标完全互补（表 1）。

讨论

在报告的协议中，关键步骤包括 （i） SLAS 设计;（ii） 测定温度;（iii） 存在单价和二价金属阳离子（K⁺ 和 Mg²⁺）;（iv） SLAS 链的浓度。

SLAS 设计
在设计 SLAS 链时，SLAS-S 和 SLAS-U 链在无靶标以及存在特异性或非特异性靶标（如果需要 SNS 分化）的情况下形成的复合物的热力学稳定性是需要考虑的。SLAS-S/U 复合物的稳定性可以通过改变茎 1' 和 2 的序列来调节（图 1）。茎的核苷酸序列的设计应防止在没有目标核酸序列的情况下 SLAS-S 和 SLAS-U 链的结合，从而确保在没有分析目标的情况下具有低背景信号。然而，通过缩短或改变序列使茎 1' 和/或 2 的极度不稳定会损害靶标诱导的信号，这取决于 SLAS-靶标复合物中荧光结合位点的有效形成。

SLAS ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金胺O	MP 生物医学	195064	一种用于信号报告的荧光染料
Cary Eclipse 荧光计	安捷伦科技	G9800A	测量样品的荧光信号
Dimethy Sulfoxide	MP 生物医学	196055	制备 Auramine O 储备溶液的溶剂
DNA 寡核苷酸（引物、SLAS 链、PCR 合成模板）	IDT	不适用	由供应商定制和脱盐，无需进一步纯化即可使用
dNTP 混合物，10 mM	赛默飞世尔科技	R0191	用于 LATE PCR 反应
氯化镁	Invitrogen	AM9530G	缓冲组件;探头链与分析目标的正确关联所必需的
微量离心管 （1.5 mL）	费雪布兰德	02-681-320	用于样品制备的塑料
微量移液器（0.1-2.5 µL)	埃彭多夫	K56877G	用于样品制备
微量移液器（100-1000 µL)	埃彭多夫	K13160F	用于样品制备
微量移液器（20-200 µL)	埃彭多夫	J05253M	用于样品制备
微量移液器（2-20 µL)	埃彭多夫	G24675G	用于样品制备
迷你离心机	康宁	6770	用于旋转样品 
无核酸酶水（未经 DEPC 处理）	赛默飞世尔科技	型号：AM9932	用于 PCR 和 SLAS 检测中的样品
PCR 管 （0.5-mL）	Invitrogen	型号：AM9932	使用 Quantus 荧光计测量荧光
移液器吸头（20-200 & micro;L)	大众	76322-150	用于样品制备的塑料
移液器吸头 （1-10 uL）	大众	76322-528	用于样品制备的塑料
氯化钾	Invitrogen	AM9640G	缓冲组件;需要正确折叠探针的荧光发光适配体结构域
Quantus 荧光计	普罗梅加	E6150型	便携式低成本荧光计，可用于荧光测量
石英比色皿	斯塔纳	16.50F-Q-10/Z15	用于使用 Cary Eclipse 荧光计进行荧光测量
含标准 Taq 缓冲液的 Taq DNA 聚合酶	新英格兰生物实验室	M0273S	用于扩增要用 SLAS 测定分析的基因片段
Tris-HCl 缓冲液 （pH 7.4）	波士顿生物产品	R-314型	缓冲区组件
紫外线灯	UVP的	95-0016-14	激发AO进行视觉信号观察
涡流混合器	大众	10153-838	用于混合样品