本方案概述了利用荧光信号增强型适体 DAP-10-42 作为信号报告分子的分裂杂交探针的设计方法，并介绍了其在核酸检测中的应用，以及对存在单核苷酸替换的目标序列进行区分的能力。
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摘要
摘要
基于DNA的荧光点亮适体（FLAPs）在生物分析检测中具有广阔前景，因其可在无需将核酸信号报告分子与荧光团和/或淬灭剂共价标记的情况下，提供低成本的荧光信号读出，这与用于即时核酸检测的传统杂交探针不同。相反，FLAPs通过非共价结合染料配体，这些配体在水溶液中本底荧光极低，但在与FLAP结合后会发出强烈荧光。本实验方案描述了一种利用DAP-10-42设计分裂型点亮适体传感器（SLASs）的算法，DAP-10-42是迄今为止报道效率最高的DNA FLAP。当SLAS被赋予与目标核酸序列互补的核酸序列时，便成为一种极具潜力的核酸分析工具，可实现对目标核酸的序列特异性检测，其选择性可达到单个核苷酸水平，从而能够分析单核苷酸替换（SNSs）。SLAS具有无需标记、基于荧光信号读出的优势，该信号可通过传统的比色皿式荧光分光光度计、便携式荧光仪检测，或在手持光源激发下直接肉眼观察。SLAS方法在疾病诊断、环境监测和生物分子研究等生物传感应用中具有重要价值。
引言
使用杂交探针进行核酸分析是检测和定量特定 DNA/RNA 序列的常规方法1一种最成功的杂交探针是分子信标（Molecular Beacon, MB）探针，它是一种发夹结构的DNA
寡核苷酸 在两端分别标记有荧光基团和淬灭基团2,3它可瞬时检测探针环状片段互补的核酸序列的存在（无需将探针-靶标复合物从过量探针中洗涤），并常用于定量PCR（qPCR）。由于需要将两种染料——荧光团和淬灭剂——共价连接至探针的寡核苷酸序列，导致成本升高，尤其当需要针对新的核酸序列设计新的分子信标（MB）探针时。或者，MB探针也可用作多组分（分裂）杂交探针体系中的信号报告探针，其中两个未标记的寡核苷酸分别与靶标及MB探针报告分子相互作用4多组分探针方法可增强对核酸识别的选择性，并改善探针对结构化靶标的结合能力5,6,7，然而，这种方法并未消除对 报告分子与共价标记 荧光团8.
荧光增强型适体（Fluorescent Light-up Aptamers, FLAPs）9 是一类能够与低荧光性的环境敏感型染料（即荧光原，fluorogens）特异性结合的适体，FLAP 与荧光原结合后可显著增强其荧光强度。与传统的荧光标记探针或信号报告分子不同，FLAP 无需将传感元件共价连接一个或多个荧光染料，因而具有无需标记即可实现荧光检测的优势10。这一点在优化实验条件时尤为重要，因为在建立检测方法的过程中，通常需要测试数十种核酸构建体以获得满意的分析性能。此外，FLAP 检测可通过调节荧光原和/或 FLAP 传感器的浓度进行优化，而无需重新设计传感器序列。这些优势对于经费有限的科研和教学实验室尤为显著。DNA FLAP 作为多组分杂交探针（称为分裂式荧光增强适体传感器，Split Light-up Aptamer Sensors, SLASs）的信号报告元件具有广阔的应用前景11。目前报道的最高效的 DNA FLAP 是 DAP-10-42，该适体最初被筛选用于增强 dapoxyl sulfonyl 类染料的荧光12，并被发现具有广谱性，能够结合并增强多种芳基甲烷类染料的荧光（例如 auramine O, AO；结晶紫，CV）13。DAP-10-42 已被改造为 SLAS，用于核酸分析13,14,15。
本方法的目的是利用无标记的SLAS链和作为缓冲液组分的荧光染料，实现对目标核酸序列的序列特异性分析。本方案描述了一种基于DAP-10-42设计SLAS的算法，并展示了SLAS在高度选择性检测仅单个核苷酸差异的核酸序列方面的性能。
SLAS 核酸检测法需要两种定制合成的未修饰 DNA 寡核苷酸，其最佳工作终浓度为 0.5–1 µM。本方案采用市售的金胺 O（Auramine O, AO）染料作为荧光原。AO 在反应体系中的终浓度范围为 1–10 µM，以确保在存在特异性核酸靶标时产生显著的荧光增强，而阴性对照（无靶标）中荧光信号较低（补充图 1）。检测缓冲液的关键组分为钾离子和镁离子（补充图 2）。钾离子（1.25–40 mM）可稳定作为信号报告元件的 FLAP 中所形成的 G-四链体结构域。镁离子（2.5–50 mM）可减少 SLAS 与靶标相互作用过程中带负电荷的磷酸基团之间的静电排斥。使用本方案所述信号报告序列时，SLAS 检测的反应温度不应超过 28 °C，以免导致性能下降16。
SLAS 可用于检测单链核酸靶标，例如不对称 PCR 或等温 DNA 扩增反应（如重组酶聚合酶扩增，RPA17）产生的 DNA 扩增子、转录介导扩增（TMA）或基于核酸序列的扩增（NASBA）18 产生的 RNA 产物，以及 miRNA、rRNA 或 ncRNA 等天然 RNA 分子。SLAS 方法能够检测靶标中低至单个核苷酸水平的序列差异13,14。
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方案
1. 以 DAP-10-42 作为信号报告分子的分裂式荧光适体传感器（SLAS）设计
- 设计构成SLAS的两条未经修饰的DNA寡核苷酸链序列。使用包含DAP-10-42中第4,6-39位核苷酸（nts）的片段表1， 图1A).
- 将茎环1（第1-8位和第36-42位核苷酸）转化为茎环1'，方法是移除第5位突出的胸腺嘧啶残基，将茎部缩短为4个碱基对（第4、6-8位和第36-39位），并添加一个末端C-G碱基对图1A，步骤1）。此外，其中一条SLAS链包含DAP-10-42核心序列的第9-29位核苷酸（nts 9-29），另一条SLAS链包含该序列的第30-35位核苷酸（nts 30-35）。
- 将包含第9-29位核苷酸的片段的3'末端序列延伸d(GGTCAT)，并将第30-35位核苷酸片段的5'末端序列延伸d(ATGACC)，以形成一个6 bp的茎环结构2（stem 2）图1A，步骤 2。
注意：DAP-10-42 中茎环 1 的碱基对 T4-A39、A6-T38、C7-G37 和 G8-C36 对适配体的荧光激活功能至关重要。茎环 1' 的序列仅可在末端碱基对处进行修饰，可为 G-C、A-T 或 T-A 碱基对，或根据需要延长 1–2 个碱基对。茎环 2 的序列可任意更改，但建议保持其热力学稳定性，除非检测温度升高至上述范围以上 28 °C缩短或以其他方式使茎环2不稳定，可在观察到基于SLAS的荧光检测背景信号较高时，防止在无靶标情况下发生过早的染料结合。允许将DAP-10-42核苷酸序列在第28-29、27-28或26-27位核苷酸之间而非第29-30位之间进行分割。图1B). - 为了使设计的 SLAS 适配特定的核酸靶标或目标序列，可通过 d(TT) 连接子将茎环结构 1' 延伸，延伸部分包含与靶标结合片段（臂部）互补的 DNA 序列图1A，步骤3）。这将得到构成探针的SLAS-U和SLAS-S链的序列。
- 使SLAS-S的靶标结合臂与包含SNS位点的靶标7-10个核苷酸片段互补，以及 SLAS-U – 互补于15-25 nt 片段 与SLAS-S的靶标结合臂相邻的靶标部分表1).
注意：SLAS-S 的靶向结合臂可选择性地连接至 DAP-10-42 序列的第 4 位核苷酸（nt 4）或第 39 位核苷酸（nt 39）图1，分别对应臂1或臂2。 - 评估熔解温度（Tm使用 UNAFold Web Server（unafold.org）计算目标物与 SLAS-S 和 SLAS-U 的目标结合臂之间形成的双链体的最小自由能（ΔG）19.
- 点击 DINAMelt 网页顶部的标签；进入“Applications”并选择 双态熔解杂交 (补充图 3A）。在“双态熔解杂交”页面中，将其中一个相互作用的序列输入左侧框内，另一个序列输入右侧框内（补充图3B）。确保两条序列均为 5' 至 3' 方向。可通过分号分隔输入多对相互作用的序列。
- 在页面底部，注明检测温度（22 °C），单价和二价阳离子浓度分别为 20 mM 和 25 mM，以匹配实验条件。注明相互作用序列的浓度。
- 按压 提交 (补充图3B）。观察结果，包括结合反应的吉布斯自由能变化、焓变和熵变，以及Tm 对应双链的值（补充图3B).
- 确保 Tm 完全匹配的目标序列（M）与SLAS-S和SLAS-U的目标结合臂之间形成的双链体的解链温度值高于该检测的反应温度，即 22 °C 在本方案中。此处，Tm 值为 32.2°C 和 74.4 °C，分别（补充图3C).
- 确保SLAS-S与含有SNS的错配靶标（MM）之间的双链体具有Tm 低于检测温度。这能确保探针与靶标的识别具有高选择性，防止AO荧光团在目标核酸分析物的SLAS结合片段中含有SNS时发出信号图2）。在此，Tm 是 21.3 °C (补充图 3C），足以区分错配复合物与匹配复合物。
- 根据需要调整靶标结合臂的序列，通过缩短或延长与靶标互补的片段，以满足所指示的稳定性要求。
- 从任何提供定制DNA寡核苷酸的商业供应商处获取设计好的SLAS-S和SLAS-U链，或使用自动寡核苷酸合成仪在实验室内部合成DNA链。
图 1：将荧光信号增强型适配体（FLAP）DAP-10-42 转化为分裂型信号增强适配体传感器（SLAS）。（A）DAP-10-4212 的二级结构由 UNAFold Web Server19 的 DNA 折叠应用程序在 22 °C、20 mM Na+、25 mM Mg2+ 条件下预测得到。该适配体具有发夹型二级结构，其核心区域可能折叠形成由茎环 1稳定化的 G-四链体结构。为将 DAP-10-42 转化为 SLAS，需进行以下改造：（1）将适配体的茎环 1缩短至 4 个碱基对，并在其两侧添加一个额外的 G-C 碱基对，形成茎环 1'；（2）在核苷酸 29 和 30 之间切断核心序列，并在切口的 3' 和 5' 侧分别延伸互补序列 d(GGTCAT) 和 d(ATGACC)，以形成茎环 2；（3）在茎环 1'上延伸出与目标物相邻片段互补的序列——即靶标结合臂，并在靶标结合臂与探针的信号报告域之间插入 d(TT) 连接子。（B） 核心区域也可在核苷酸 28-29、27-28 或 26-27 之间切断，而不会显著降低信号强度或荧光倍增水平。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：SLAS信号生成机制。SLAS由两条链组成——SLAS-U和SLAS-S——以及一种荧光染料（例如：金胺O；AO）。在不存在目标核酸的情况下，两条链均处于解离状态，无法结合染料，因此无信号产生（中心）。当存在完全匹配的目标序列M时，SLAS-U和SLAS-S均与M的相邻片段杂交，使核心片段彼此靠近，从而形成染料结合位点。AO的结合会增强其荧光，该荧光信号即为检测读数（左图）。当存在含有单核苷酸替换（SNS）的错配目标序列MM（该替换位于与SLAS-S相互作用的片段中）时，仅SLAS-U能够与MM目标序列杂交，而SLAS-S仍处于解离状态，因此无法形成染料结合位点，无信号产生（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 目标序列的扩增
- 使用SLAS检测扩增待分析基因的片段。进行PCR或RPA扩增时，采用不对称条件（例如，正向引物的用量为反向引物的10倍），以生成单链扩增子。扩增目标基因中一段126 nt的片段。 NANOGP8 使用指数后线性（LATE）PCR 扩增基因20，使用下表所列的引物序列 表2. 此处使用单链DNA模板（Template NANOGP8 或 Template G1423C， 表2）对应于该基因的126-nt片段。模板由Integrated DNA Technologies, Inc.定制合成。
- 准备一个 100 µL 通过混合进行PCR反应 10 µL 10x 标准 Taq 反应缓冲液 2 µL 10 mM dNTP混合液（使其终浓度为0.2 mM）， 10 µL 的 10 µM 上游引物和 10 µL 的 1 µM 反向引物（用于最终浓度的） 1 µM 和 0.1 µM，分别） 0.5 µL 5U/µL Taq DNA 聚合酶、DNA 模板和无核酸酶水。对于无模板对照，用水替代模板。
- 使用以下热循环条件：初始变性在 95 °C 1分钟；45个循环：(1) 变性，温度为 95 °C 15秒，(2) 引物退火于 60 °C 30 秒，（3）引物延伸在 68 °C 30 秒；以及最终延伸在 68 °C 5 分钟。
注意：基于转录 扩增技术，例如 NASBA18 能 可替代PCR或RPA使用，特别是在有RNA模板可用于扩增的情况下。NASBA可产生单链RNA扩增子，其终产物浓度可达微摩尔级，足以直接用于后续的SLAS检测，无需浓缩产物。
- 通过加入0.1倍体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）和3倍体积的乙醇，对扩增后的样品进行乙醇沉淀。于-20℃孵育。 °C 孵育1 h后，在12,000-18,000 x g条件下离心 g 5 分钟，弃去上清液。
- 用70%乙醇洗涤沉淀，再次离心，弃去上清液。将沉淀空气干燥后溶解于 10 µL 用于SLAS实验的无核酸酶水。
3. 使用SLAS进行荧光检测
- 制备AO的储备液（0.1 mM，DMSO中，10倍浓度），SLAS-S（10 µM 在无核酸酶的水中，10倍浓度），SLAS-U（10 µM 在无核酸酶水中，10 倍浓度）和 4 倍浓度检测缓冲液（80 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM MgCl2，80 mM KCl）
注意：钾离子对于稳定适配体中假定的G-四链体结构至关重要，该结构是染料结合位点的一部分。即使低至1 mM KCl（在25 mM MgCl₂存在下）2) 在1×检测缓冲液中足以使特异性靶标M存在时的荧光信号相比空白（无靶标样本）增强约14倍； 补充图2B）。镁离子可稳定核酸链之间的相互作用（包括SLAS-S、SLAS-U与靶标之间的相互作用）。Mg²⁺的浓度2+ 在1x检测缓冲液中，浓度应至少为5 mM（在20 mM KCl条件下；补充材料） 图 2C，D）。AO 的储存液（约 1 mM）用 DMSO 配制。SLAS-S 和 SLAS-U 的储存液浓度是任意的，可根据需要进行调整，只要保持链的最终浓度不变即可（有关最终 SLAS 浓度选择的原理，请参见讨论部分）。
警告：若吞食，AO 有害；与皮肤接触有毒；并可能致癌。配制 AO 溶液时务必佩戴手套。AO 的称量及其储备液的配制应在化学通风橱内进行。 - 配制包含所有检测组分但不含靶标的预混液。计算预混液的体积（V混合) 乘以样品体积（60 µL样本数加一 (n+1)
样本数量 n 应包含必要的阴性对照和阳性对照。 - 将 0.25x V 混合混合 µL 4x 测定缓冲液 0.1x V混合 µL 0.1 mM AO 0.1x V混合 µL 的 10 µM SLAS-S 和 0.1× V混合 µL 的 10 µM SLAS-S。加入无核酸酶水至终体积
使其能够容纳3.4步骤中加入的目标体积。涡旋混匀并短暂离心混合液。分装 50 µL 将主混合液分装至 n 个样品管中。
注意：样本体积可根据用于检测荧光信号的仪器特性进行调整。分装至样本管中的主混合液体积可根据步骤 3.4 中添加的目标体积进行相应调整。为配制主混合液所添加的无核酸酶水的体积也应相应调整。例如，若含目标物的样本添加量为最终样本体积的 10%（V/V），则应将无核酸酶水加入主混合液中至 0.9x V混合. - 使用一个样本作为空白对照（无靶标对照），另一个样本作为阳性对照。添加 10 µL 含目标物的样本加入到混合液中50 µL) 以使最终样品体积达到 60 µL 含有10-1000 nM目标物。空白对照使用无核酸酶水（10 µL）而不是靶标。作为阳性对照，使用含有靶序列的合成DNA寡核苷酸（例如，靶标M， 表1）。加入 10 µL 0.6-3 µM 对照以制备 0.1-0.5 µM 终浓度
注意：此阳性对照中出现的高荧光信号可确保检测按预期发挥作用，即使待测未知样本显示阴性信号。 - 混合样品，使用微量离心机离心沉淀。将样品在指定条件下孵育 22 °C 10-60 分钟。信号仅略微增强 <40分钟至60分钟之间为15%图3).
- 使用荧光分光光度计，在激发波长475 nm、发射波长540 nm条件下测定样品的荧光强度。
注意：可以使用能够测量薄壁PCR管中荧光的便携式荧光计。该荧光计需要配备适用于检测AO荧光的激发和发射滤光片。合适的激发滤光片示例为495 nm短通滤光片，合适的发射滤光片示例为510–580 nm。或者，也可在使用紫外光或蓝光光源激发样品中的AO荧光后，通过肉眼观察信号。
警告：若使用紫外灯，请佩戴防紫外护目镜。
图3：SLAS-29U/30S信号生成的时间依赖性。使用荧光分光光度计的动力学模式（激发波长475 nm，发射波长540 nm，激发/发射狭缝5 nm）对含有AO、SLAS-29U和SLAS-30S的样品进行60分钟的检测。在5分钟时（以箭头指示），向样品中加入目标物M。数据来自两次独立实验的平均值。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
采用DAP-10-42核心作为信号报告分子的SLAS性能，通过设计用于检测胶质母细胞瘤多形性（GBM）——一种侵袭性脑癌——相关NANOGP8基因片段的探针得以验证21。据报道，该片段在来源于癌细胞外泌体的DNA货物中包含单核苷酸变异（SNSs）22。因此，SLAS被特异性设计以靶向该基因的SNS位点。本实验方案中使用了模拟NANOGP8基因序列的合成DNA靶标M或MM，二者分别在第1423位核苷酸（GenBank NM_001355281.2）处含有G或C。靶标M与SLAS-S链完全互补，而靶标MM在与SLAS-S配对时存在G>C错配（表1）。SLAS-U的靶标结合片段序列则与M和MM两种靶标均完全互补（表1）。
仅当存在与探针的靶标结合臂互补的靶标时，SLAS才会以时...
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讨论
在本报告所述的实验方案中，关键步骤包括：(i) SLAS 的设计；(ii) 检测温度；(iii) 一价和二价金属阳离子（K+ 和 Mg2+）的存在；(iv) SLAS 链的浓度。
SLAS 设计
在设计 SLAS 链时，需考虑在无靶标存在的情况下，SLAS-S 与 SLAS-U 链所形成复合物的热力学稳定性，以及在存在特异性或非特异性靶标时（若需进行 SNS 区分）的稳定性。SLAS-S/U 复合物的稳定性可通过改变茎环结构 1' 和 2 的序列进行调控（图 1）。茎环区域的核苷酸序列应设计为：在目标核酸序列不存在时，防止 SLAS-S 与 SLAS-U 链之间的结合，从而确保在无分析靶标时具有较低的背景信号。然而，若通过缩短或改变序列导致茎环 1' 和/或 2 过度去稳定化，则可能影响靶标诱导的信号，因为该信号依赖于 SLAS-靶标复合物中荧光素结合位点的有效形成。
SLAS ...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
衷心感谢中佛罗里达大学本科生研究办公室（OUR）为AK提供的资金支持。针对 NANOGP8 基因优化LATE-PCR条件的研究工作由佛罗里达癌症创新基金（资助号 MOABC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 金胺O | MP Biomedicals | 195064 | 用于信号报告的荧光染料 |
| Cary Eclipse 荧光分光光度计 | Agilent Technologies | G9800A | 用于测量样品的荧光信号 |
| 二甲基亚砜 | MP Biomedicals | 196055 | 用于配制金胺O储备液的溶剂 |
| DNA寡核苷酸（引物、SLAS链、PCR合成模板） | IDT | N/A | 由供应商定制合成并脱盐，无需进一步纯化即可使用 |
| dNTP混合物，10 mM | ThermoFisher Scientific | R0191 | 用于LATE PCR反应 |
| 氯化镁 | invitrogen | AM9530G | 缓冲液组分；确保探针链与目标分析物正确结合所必需 |
| 微量离心管（1.5 mL） | Fisherbrand | 02-681-320 | 用于样品制备的塑料耗材 |
| 微量移液器（0.1–2.5 µL） | Eppendorf | K56877G | 用于样品制备 |
| 微量移液器（100–1000 µL） | Eppendorf | K13160F | 用于样品制备 |
| 微量移液器（20–200 µL） | Eppendorf | J05253M | 用于样品制备 |
| 微量移液器（2–20 µL） | Eppendorf | G24675G | 用于样品制备 |
| 小型离心机 | Corning | 6770 | 用于离心收集样品 |
| 无核酸酶水（非DEPC处理） | ThermoFisher Scientific | AM9932 | 用于PCR和SLAS检测中的样品 |
| PCR管（0.5 mL） | invitrogen | AM9932 | 用于使用Quantus荧光计测量荧光 |
| 移液器吸头（20–200 µL） | VWR | 76322-150 | 用于样品制备的塑料耗材 |
| 移液器吸头（1–10 µL） | VWR | 76322-528 | 用于样品制备的塑料耗材 |
| 氯化钾 | Invitrogen | AM9640G | 缓冲液组分；确保荧光增强型适配体探针结构正确折叠所必需 |
| Quantus荧光计 | Promega | E6150 | 便携式低成本荧光计，可用于荧光检测 |
| 石英比色皿 | Starna | 16.50F-Q-10/Z15 | 用于Cary Eclipse荧光分光光度计上的荧光测量 |
| Taq DNA聚合酶（含标准Taq缓冲液） | New England BioLabs | M0273S | 用于扩增待通过SLAS检测分析的基因片段 |
| Tris-HCl缓冲液（pH 7.4） | Boston Bioproducts | R-314 | 缓冲液组分 |
| 紫外灯 | UVP | 95-0016-14 | 用于激发金胺O以观察可视信号 |
| 涡旋混合器 | VWR | 10153-838 | 用于混合样品 |
参考文献
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