利用DNA荧光增强型适体作为信号报告分子的分裂杂交探针用于序列特异性核酸分析

摘要

本方案概述了利用荧光信号增强型适体 DAP-10-42 作为信号报告分子的分裂杂交探针的设计方法，并介绍了其在核酸检测中的应用，以及对存在单核苷酸替换的目标序列进行区分的能力。

摘要

基于DNA的荧光点亮适体（FLAPs）在生物分析检测中具有广阔前景，因其可在无需将核酸信号报告分子与荧光团和/或淬灭剂共价标记的情况下，提供低成本的荧光信号读出，这与用于即时核酸检测的传统杂交探针不同。相反，FLAPs通过非共价结合染料配体，这些配体在水溶液中本底荧光极低，但在与FLAP结合后会发出强烈荧光。本实验方案描述了一种利用DAP-10-42设计分裂型点亮适体传感器（SLASs）的算法，DAP-10-42是迄今为止报道效率最高的DNA FLAP。当SLAS被赋予与目标核酸序列互补的核酸序列时，便成为一种极具潜力的核酸分析工具，可实现对目标核酸的序列特异性检测，其选择性可达到单个核苷酸水平，从而能够分析单核苷酸替换（SNSs）。SLAS具有无需标记、基于荧光信号读出的优势，该信号可通过传统的比色皿式荧光分光光度计、便携式荧光仪检测，或在手持光源激发下直接肉眼观察。SLAS方法在疾病诊断、环境监测和生物分子研究等生物传感应用中具有重要价值。

引言

使用杂交探针进行核酸分析是检测和定量特定 DNA/RNA 序列的常规方法¹一种最成功的杂交探针是分子信标（Molecular Beacon, MB）探针，它是一种发夹结构的DNA
寡核苷酸 在两端分别标记有荧光基团和淬灭基团^2,3它可瞬时检测探针环状片段互补的核酸序列的存在（无需将探针-靶标复合物从过量探针中洗涤），并常用于定量PCR（qPCR）。由于需要将两种染料——荧光团和淬灭剂——共价连接至探针的寡核苷酸序列，导致成本升高，尤其当需要针对新的核酸序列设计新的分子信标（MB）探针时。或者，MB探针也可用作多组分（分裂）杂交探针体系中的信号报告探针，其中两个未标记的寡核苷酸分别与靶标及MB探针报告分子相互作用⁴多组分探针方法可增强对核酸识别的选择性，并改善探针对结构化靶标的结合能力^5,6,7，然而，这种方法并未消除对 报告分子与共价标记 荧光团⁸.

荧光增强型适体（Fluorescent L....

方案

1. 以 DAP-10-42 作为信号报告分子的分裂式荧光适体传感器（SLAS）设计

1. 设计构成SLAS的两条未经修饰的DNA寡核苷酸链序列。使用包含DAP-10-42中第4,6-39位核苷酸（nts）的片段表1， 图1A).
2. 将茎环1（第1-8位和第36-42位核苷酸）转化为茎环1'，方法是移除第5位突出的胸腺嘧啶残基，将茎部缩短为4个碱基对（第4、6-8位和第36-39位），并添加一个末端C-G碱基对图1A，步骤1）。此外，其中一条SLAS链包含DAP-10-42核心序列的第9-29位核苷酸（nts 9-29），另一条SLAS链包含该序列的第30-35位核苷酸（nts 30-35）。
3. 将包含第9-29位核苷酸的片段的3'末端序列延伸d(GGTCAT)，并将第30-35位核苷酸片段的5'末端序列延伸d(ATGACC)，以形成一个6 bp的茎环结构2（stem 2）图1A，步骤 2。
   注意：DAP-10-42 中茎环 1 的碱基对 T4-A39、A6-T38、C7-G37 和 G8-C36 对适配体的荧光激活功能至关重要。茎环 1' 的序列仅可在末端碱基对处进行修饰，可为 G-C、A-T 或 T-A 碱基对，或根....

结果

采用DAP-10-42核心作为信号报告分子的SLAS性能，通过设计用于检测胶质母细胞瘤多形性（GBM）——一种侵袭性脑癌——相关NANOGP8基因片段的探针得以验证²¹。据报道，该片段在来源于癌细胞外泌体的DNA货物中包含单核苷酸变异（SNSs）²²。因此，SLAS被特异性设计以靶向该基因的SNS位点。本实验方案中使用了模拟NANOGP8基因序列的合成DNA靶标M或MM，二者分别在第1423位核苷酸（GenBank NM_001355281.2）处含有G或C。靶标M与SLAS-S链完全互补，而靶标MM在与SLAS-S配对时存在G>C错配（表1）。SLAS-U的靶标结合片段序列则与M和MM两种靶标均完全互补（表1）。

仅当存在与探针的靶标结合臂互补的靶标时，SLAS才会以时.......

讨论

在本报告所述的实验方案中，关键步骤包括：(i) SLAS 的设计；(ii) 检测温度；(iii) 一价和二价金属阳离子（K⁺ 和 Mg²⁺）的存在；(iv) SLAS 链的浓度。

SLAS 设计
在设计 SLAS 链时，需考虑在无靶标存在的情况下，SLAS-S 与 SLAS-U 链所形成复合物的热力学稳定性，以及在存在特异性或非特异性靶标时（若需进行 SNS 区分）的稳定性。SLAS-S/U 复合物的稳定性可通过改变茎环结构 1' 和 2 的序列进行调控（图 1）。茎环区域的核苷酸序列应设计为：在目标核酸序列不存在时，防止 SLAS-S 与 SLAS-U 链之间的结合，从而确保在无分析靶标时具有较低的背景信号。然而，若通过缩短或改变序列导致茎环 1' 和/或 2 过度去稳定化，则可能影响靶标诱导的信号，因为该信号依赖于 SLAS-靶标复合物中荧光素结合位点的有效形成。

SLAS .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金胺O	MP Biomedicals	195064	用于信号报告的荧光染料
Cary Eclipse 荧光分光光度计	Agilent Technologies	G9800A	用于测量样品的荧光信号
二甲基亚砜	MP Biomedicals	196055	用于配制金胺O储备液的溶剂
DNA寡核苷酸（引物、SLAS链、PCR合成模板）	IDT	N/A	由供应商定制合成并脱盐，无需进一步纯化即可使用
dNTP混合物，10 mM	ThermoFisher Scientific	R0191	用于LATE PCR反应
氯化镁	invitrogen	AM9530G	缓冲液组分；确保探针链与目标分析物正确结合所必需
微量离心管（1.5 mL）	Fisherbrand	02-681-320	用于样品制备的塑料耗材
微量移液器（0.1–2.5 µL）	Eppendorf	K56877G	用于样品制备
微量移液器（100–1000 µL）	Eppendorf	K13160F	用于样品制备
微量移液器（20–200 µL）	Eppendorf	J05253M	用于样品制备
微量移液器（2–20 µL）	Eppendorf	G24675G	用于样品制备
小型离心机	Corning	6770	用于离心收集样品
无核酸酶水（非DEPC处理）	ThermoFisher Scientific	AM9932	用于PCR和SLAS检测中的样品
PCR管（0.5 mL）	invitrogen	AM9932	用于使用Quantus荧光计测量荧光
移液器吸头（20–200 µL）	VWR	76322-150	用于样品制备的塑料耗材
移液器吸头（1–10 µL）	VWR	76322-528	用于样品制备的塑料耗材
氯化钾	Invitrogen	AM9640G	缓冲液组分；确保荧光增强型适配体探针结构正确折叠所必需
Quantus荧光计	Promega	E6150	便携式低成本荧光计，可用于荧光检测
石英比色皿	Starna	16.50F-Q-10/Z15	用于Cary Eclipse荧光分光光度计上的荧光测量
Taq DNA聚合酶（含标准Taq缓冲液）	New England BioLabs	M0273S	用于扩增待通过SLAS检测分析的基因片段
Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）	Boston Bioproducts	R-314	缓冲液组分
紫外灯	UVP	95-0016-14	用于激发金胺O以观察可视信号
涡旋混合器	VWR	10153-838	用于混合样品