本方案介绍了一种多模态方法，结合拉曼光谱与层析相位显微技术，用于无标记、非侵入性地对活体人乳腺癌细胞进行表型分析。该方法包含一个用户友好、无主观偏倚的分析流程，可实现快速、定量的形态-化学分析，为癌症研究和细胞生物学提供详细的分子与结构信息。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了多模态共聚焦拉曼微光谱技术（RS）与层析相位显微技术（TPM），用于快速对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）进行形态-化学表型分析。利用这些先进显微技术的非侵入性特点，我们在细胞天然生理环境中，无需标记即可从活细胞中获取详细的形态-分子数据。我们开发了去除了人为偏倚的数据处理流程，用于分析高光谱拉曼图像（覆盖600 cm-1至1800 cm-1的拉曼模式，可特异性表征多种分子键和亚细胞结构），以及三维折射率层析图提供的形态学数据（可在纳米级分辨率下测量细胞体积、表面积、贴壁面积和球形度，同时提供干质量和密度信息）。通过对RS和TPM所提供的丰富单细胞信息进行系统性解析，我们以定量方式展示了这种多模态显微方法在肿瘤性乳腺癌细胞表型分析中的优势。我们的工具还能在无需任何标记的情况下，进一步揭示亚细胞层面的信息。最后，我们研究并讨论了由RS和TPM所获得数据集中的独特特征或相关性信息。我们相信，当生物医学研究需要对培养中的活细胞进行快速且非侵入性的分析时，本研究所提供的工具和定量数据分析流程有望彻底改变表型分析任务，并具有未来向临床诊断应用转化的潜力。
引言
细胞鉴定与表型分析是生物医学研究的关键环节1。能够在形态学和分子水平上对细胞进行表征，对于理解细胞功能、分化过程及病理状态至关重要1,2,3。这一技术在肿瘤学领域尤为重要，因为准确的细胞分型对于肿瘤诊断、疾病分期判断以及最终确定治疗靶点具有重要意义2。传统的细胞鉴定方法无法提供时间动态信息，且通常依赖于染色或标记等侵入性技术，这些操作可能干扰细胞的天然状态，并在数据中引入潜在偏差4。因此，迫切需要发展非侵入性策略，以在细胞保持天然、未受干扰的状态下，实现对其准确而全面的表型分析。
在此背景下，无标记多模态成像方法通过结合互补的成像模式，同时获取细胞的形态学和分子信息，从而彻底改变了细胞生物学研究2,5。这些方法能够对细胞进行整合性且非侵入式的表征，而传统的单一技术往往难以实现这一点2,5,
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方案
1. 样品制备
- 将 MDA-MB-231 细胞接种到石英培养皿中。
- 将 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞接种至 3.5 cm 石英玻璃底培养皿中。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2 环境中孵育，直至细胞完全贴壁（接种后至少 12 小时）。
- 洗涤细胞并准备测量。
- 细胞贴壁后，移除培养皿中的培养基。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基。
- 加入新鲜的细胞培养基，并在整个测量过程中保持细胞被培养基覆盖，以确保其活性。
注意：本研究使用的培养基为不含酚红的 DMEM/F-12 培养基，添加 5% 胎牛血清（FBS）以及青霉素（100 IU/mL）-链霉素（100 µg/mL）。
2. 高通量拉曼显微镜系统
注意：本研究中用于MDA-MB-231活细胞成像的自制拉曼显微镜的技术细节此前已有描述22。简而言之，所使用的定制高通量拉曼显微镜系统采用由532 nm激光泵浦的785 nm钛宝石激光器（....
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结果
我们描述了一种基于共聚焦拉曼光谱（RS）和双光子显微技术（TPM）的无标记活细胞形态-化学表征工作流程。我们测试了该工作流程获取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231分子组成和形态参数的能力（图1）。
将 MDA-MB-231 细胞接种于石英玻璃底培养皿中。使用自行搭建的共聚焦拉曼显微镜（图 1A），在 785 nm 连续激光激发下，采集单个细胞在拉曼位移（Ω）600 cm-1 至 1800 cm-1 范围内的拉曼光谱，即生物物质拉曼振动图谱的指纹区27。每次单细胞拉曼信号采集耗时约 40 分钟。实验过程中采用载物台培养箱以维持细胞的生理状态。此外，为验证本方法的非侵入性，测量后我们持续将细胞传代培养至少两代，并在此期间密切监测细胞增殖情况，未观察到生长异常或非正常脱落现象。所得拉曼光谱以三维 XY-Ω 超立方体形式表示，其中 XY 平面上的每个像素点对应指纹区的一个光谱。
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讨论
我们提出了一种多模态方法及简明的分析流程，整合了两种先进的无标记成像技术：拉曼光谱（RS）和双光子显微（TPM）。所述工作流程实现了对活体人乳腺癌单细胞（MDA-MB-231）快速、无创的形态-化学表型分析，无需外源性标记。
拉曼光谱（RS）是一种非破坏性技术，可通过检测分子的振动模式来表征生物样品的生化组成9,27,34,35。由于水的拉曼散射信号可忽略不计，RS适用于水相环境。这一优势使得在无需复杂样品前处理的情况下，即可对活细胞在其培养条件下进行精确的分子检测2,36。RS还具备提供多种生物分子（如脂质、蛋白质和核酸）分子指纹的独特能力，这对于确定细胞表型至关重要37
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由麻省理工学院-意大利基金会的Progetto Rocca项目、美国国立卫生研究院资助（项目编号：P41EB015871、UH3CA275687、R01DC021326）、韩国首尔Apollon公司以及韩国国家癌症中心（NCC-24H1170）资助。Leonardo Bianchi 感谢获得Progetto Rocca博士后奖学金，以支持其在麻省理工学院与米兰理工大学开展合作研究。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CCD相机 | Princeton Instruments | PIXIS 100BR eXcelon | 用于检测拉曼散射信号。 |
| CCD相机控制软件 | Princeton Instruments | LightField | |
| 连续波钛宝石激光器（波长：785 nm） | Spectra-Physics | 3900 S | 用于拉曼显微成像的激发光源。 |
| 二向色镜 | ThorLabs | DMSP750B | 749 nm二向色镜，将785 nm拉曼激发光导向样品，并滤除荧光和明场信号。 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | |
| 荧光显微镜主体 | Olympus | IX83 | |
| 激光器（波长：532 nm） | Spectra-Physics | Millennia eV | 作为785 nm钛宝石激光系统的泵浦激光器。 |
| MATLAB软件 | MathWorks | 2023a | |
| MDA-MB-231细胞系 | ATCC | HTB-26 | |
| 近红外光谱仪 | Andror | Holospec HS-HSG-785-LF | 用于分析背向散射光的光谱。 |
| 物镜（60× 1.2 NA，水浸） | Olympus | UPLSAPO60× | |
| 载物台培养室 | Tokai Hit | stxg-welsx-set | |
| 开源显微镜控制软件 | µManager | Micro-Manager-2.0 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 无酚DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21041025 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10-010-023 | |
| 石英玻璃底培养皿 | Waken B Tech | SF-S-D12 | |
| 拉曼数据分析软件 | RamApp | 基于网络的拉曼高光谱数据处理工具。 | |
| sCMOS相机 | Hamamatsu Photonics | Orca Flash 4.0 v2 | |
| 注射泵 | Chemyx | Fusion 720 | |
| 断层相位显微镜 | Tomocube, Inc. | HT-2H | 用于获取定量相位图像的商用系统。 |
| TPM数据分析软件 | Tomocube, Inc. | TomoStudio | 用于分析断层相位显微镜（TPM）数据的软件。 |
参考文献
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).
- Bresci, A., et al.
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重印与许可
