探究红外疗法对高强度跑步机运动训练后骨骼的影响

摘要

长时间高强度跑台运动训练会抑制小鼠的骨形成并促进骨吸收，导致骨量下降。本文介绍了一种用于检测红外线治疗对高强度运动诱导的骨代谢改变影响的实验方案。尚需进一步的机制研究以阐明其潜在的分子通路。

摘要

骨组织是人体重要的承重器官。适度运动可通过机械负荷增加骨量，而高强度运动则可能抑制骨量。红外疗法可改善血液循环，减轻疼痛和炎症，并促进组织修复。本文介绍了一种研究红外疗法对高强度运动诱导的骨骼代谢紊乱及其分子机制调节作用的实验方案。本研究将24只6周龄小鼠随机分为对照组（CTR，N = 8）、高强度跑台运动训练组（HIT，N = 8）和高强度跑台运动后接受红外疗法组（IRT，N = 8）。后两组进行为期8周的训练。第一周为跑台适应性训练。第二周起，小鼠以24 m/min的速度运动50 min，此后每周速度增加1 m/min，运动时间增加10 min，直至达到28 m/min运动80 min，坡度为5°，每周训练6天。从第五周开始，HIT组小鼠接受全身红外干预，环境温度控制在42 °C至45 °C之间，每次治疗持续约40 min，每周3次。结果显示，与CTR组相比，HIT组的骨体积/总体积和骨小梁数量显著降低，骨小梁分离度显著升高，成骨相关基因的表达也发生显著变化。 Atf4, Runx2，以及 Ocn 呈下调，且破骨细胞相关基因的 Ctsk 和 Mmp9 呈上调。IRT组小鼠的显微CT结果显示无显著差异，但成骨相关基因 Alp、Atf4、Runx2、Ocn，以及 Osx 在股骨中表达上调。此外，与破骨细胞相关的基因 Ctsk 下调。长期高强度跑台运动可能会降低骨量。红外线疗法虽不影响骨矿物质密度，但可能改善骨代谢。

引言

骨质疏松症（OP）是最常见的全身性代谢性骨病之一，尤其在老年人群中高发，已成为一项重大的全球公共卫生问题¹。OP 主要表现为骨矿物密度（BMD）、骨质量和骨强度下降，从而增加骨折风险²。预防和治疗 OP 对提高人类生活质量至关重要，具体措施包括药物治疗、充足摄入钙和维生素 D、减少吸烟与饮酒、以及早期进行体育锻炼以增加并维持峰值骨量^3,4。

骨骼作为身体的结构框架，提供基本形态并保护内部器官。在神经系统的调控下，骨骼通过肌肉收缩实现各种运动。一生中，骨骼持续经历形成、吸收和重塑过程。破骨细胞不断吸收旧骨，而成骨细胞则形成并矿化新骨。这些过程紧密耦合且相互调节，维持骨转换的动态平衡⁵。大量研究表明，适当的体育锻炼（如有氧运动和抗阻训练）可有效预防和治疗骨质疏松症（OP）⁶。运动通过调节骨骼所受的机械应力（如地面冲击、震动以及肌肉附着点的张力）和血液循环中的生化因子（如激素和细胞因子），影响骨代谢，从而促进骨骼健康⁷。然而，长期高强度运动可能对骨骼健康产生负面影响，导致骨量丢失。例如，在肩袖损伤小鼠模型中，经过8周的跑台跑步训练（速度为15 m/min），分别进行高、中、低强度运动后，高强度组的骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均低于对照组及中、低强度组，而骨小梁分离度（Tb.Sp）则最高。该结果表明，高强度训练对肩袖修复和骨量具有不利影响⁸。

红外线疗法（IRT） 是中国康复物理治疗设备中最广泛应用的原理之一。它可促进局部血液循环，加速炎性物质的吸收，并增强营养供应^9,10。作为一种非侵入性物理治疗手段，近年来红外线疗法在运动医学、康复科学及骨代谢研究领域受到广泛关注。与其他干预措施相比，IRT在临床应用中更为普遍。研究表明，骨组织愈合是一个复杂的过程，包括炎症消退和细胞再生，可分为三个阶段：炎症期、增殖期和重塑期。炎症期主要表现为血管生成；增殖期涉及成骨细胞的增殖和新骨形成；重塑期则表现为骨痂内新生小梁骨逐渐增多，跨越骨折间隙的桥接骨痂完全骨化¹¹。骨折后，从血管流入组织的血液需要被迅速吸收，这一过程可刺激成骨细胞增殖和骨形成。这些关键过程需要良好的内环境和充足的营养支持。一定程度的热疗可有效促进这些功能¹²。在临床实践中，红外线疗法可作为辅助手段用于治疗骨质疏松症，并有助于缓解相关症状，但其对骨量影响的研究仍相对有限。本文提出一项实验方案，旨在阐明红外线疗法对高强度运动诱导的骨骼代谢紊乱及其分子机制的调节作用。因此，本研究在既往研究基础上¹³，建立小鼠高强度跑台运动模型，观察骨量变化，并进一步探讨热疗是否能够缓解高强度跑台运动引起的骨丢失。旨在为基于运动的骨质疏松症预防与治疗提供参考依据。

方案

本研究获得了上海体育大学实验动物伦理委员会的伦理批准（编号：102772023DW016），并符合国家和机构关于动物研究的相关规定。24只5周龄雄性C57BL/6小鼠饲养于上海体育大学SPF级动物实验设施中，饲养环境温度为22 ± 2 °C，相对湿度为40–70%，光照/黑暗周期为12小时交替，且提供 随意摄取 食物/水。所有生物材料，包括骨骼、血液以及经RNA提取试剂处理的样本，均应收集于生物危害二级高压灭菌袋中，在丢弃前于121 °C灭菌60分钟，并在实验室废物记录中做好相应记录。

1. 动物

1. 经过1周的适应期后，根据小鼠体重进行分层，并随机分为三组：对照组（CTR组，N = 8）、高强度跑台运动训练组（HIT组，N = 8）和高强度跑台运动后红外治疗组（IRT组，N = 8）。

2. 高强度跑步机运动训练与热疗干预方案

1. 在静态条件下饲养对照组（CTR组），不进行任何干预。
2. 小鼠适应环境1周后，对高强度训练组（HIT组）和红外治疗组（IRT组）实施为期8周的高强度跑台训练。第1周为适应阶段：使跑台组小鼠分别以12、15和18 m/min的速度，在0°坡度下跑步20、30和40分钟。第2周起，使小鼠以24 m/min的速度跑步50分钟，之后每周递增速度1 m/min、时间10分钟，直至达到28 m/min、持续80分钟，坡度为5°。每周进行6天训练，周日休息（表1）。
3. 对于IRT组，在进行4周跑台训练后，从第5周开始引入红外治疗（IRT）。
   注意：红外照射期间，必须严格将小鼠体温维持在42 °C至45 °C之间。
   1. 通过腹腔注射麻醉小鼠，使其失去意识。
   2. 使用红外治疗仪对小鼠全身进行照射，确保小鼠体温保持在42 °C至45 °C之间（由温度检测器监测）。每次治疗持续约40分钟，每周3次（周一、周三、周六），连续进行4周，直至取样。

3. 组织采集

注意：解剖所得的小鼠骨样本必须立即在液氮中或 -80 °C 下保存，以维持 RNA 的完整性。

1. 血清样本的采集与保存
   1. 使用电子天平称量所有小鼠的体重。
   2. 通过腹腔注射三溴乙醇对小鼠进行麻醉。
      注意：操作三溴乙醇时，必须在化学通风橱中新鲜配制溶液，佩戴腈类手套和护目镜，将溶液储存在4 °C避光的棕色瓶中，并通过批准的化学废弃物处理渠道处置未使用部分。
   3. 采用心脏穿刺法无菌采集血液样本，以获取0.5–0.6 mL血液。首先，剃除小鼠胸部毛发并用碘伏消毒。随后，触诊心搏最明显的位置，将连接注射器的4–5号针头插入左侧胸腔第三与第四肋间隙。最后，当观察到血液自发流入注射器时，轻柔抽吸以完成采血过程。
   4. 将采集的血液样本在室温下静置10分钟使其凝固，然后在1,000 × g条件下离心15分钟。分装上清液（血清），并于-80 °C保存。
2. 骨组织样本的采集与保存
   1. 使用无菌显微剪刀和镊子分离双侧股骨和胫骨。沿纵轴方向轻柔剥离骨表面的肌肉和肌腱，避免刮擦骨膜，并特别注意保护生长板。
   2. 用1× PBS（pH 7.4）冲洗所有样本。将左侧股骨置于4%多聚甲醛（PFA）中固定24小时。在进一步分析前，使用左侧股骨进行骨密度测定。
   3. 将右侧股骨放入预先标记的1.5 mL微量离心管中，并在-80 °C保存。
   4. 使用右侧股骨及双侧胫骨进行骨代谢相关检测。

4. 参数的测量

1. 血糖水平测定
   1. 在组织采集前，从小鼠尾静脉采集血样。使用便携式葡萄糖分析仪测定血糖水平。
2. 血乳酸水平测定
   1. 在最后一次跑台运动结束后立即从小鼠尾静脉采集血样。使用便携式乳酸分析仪测定血乳酸水平。
3. 转棒实验
   注意：在所有干预措施完成后，我们对各组小鼠进行转棒实验。进行转棒测试时，我们选择不同组的小鼠同时测试，以确保休息时间一致，避免先测试一组小鼠再测试另一组所导致的因休息时间差异而产生的偏差。
   1. 将小鼠放置于转棒仪上，头部朝向与旋转方向相反，允许进行一次适应性试验。
   2. 将转棒速度设定为 30 rpm；启动后，仪器匀加速至设定速度。
   3. 记录小鼠首次跌落前的时间。使用该指标评估小鼠的运动协调能力。
4. 股骨小梁骨质量测定
   1. 使用无菌显微剪刀和镊子去除附着在骨骼上的肌肉和结缔组织，并用 PBS 清洗。
   2. 进行显微CT扫描，以评估左侧股骨小梁骨的参数，扫描参数如下：在连续旋转模式下以55 kVp/145 µA (8 W)进行显微CT扫描，体素尺寸为9 µm 各向同性，视场为31.0 mm FOV，曝光时间为 250 ms，原生分辨率（388 层/段），并采用1,200 mgHA/cc BH 校准。
   3. 测量小梁骨和皮质骨微结构的以下指标。
      1. 将重建后的图像导入 CT-vox 软件进行三维（3D）渲染与可视化。
      2. 利用多平面视图（冠状面、矢状面和横断面），将皮质骨与小梁骨分离并提取为不同的组织区域，以便独立分析其形态计量学特征。
      3. 定量分析关键微结构参数，包括骨体积/总体积（BV/TV）、小梁数量（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁分离度（Tb.Sp），以评估骨发育及矿化状态。
5. 石蜡切片与组织学染色
   1. 用 PBS 清洗每组三根左侧股骨，并在 10% EDTA（pH 7.15）中脱钙，直至完全脱钙。
   2. 通过梯度乙醇（70%、90%、95% 和 100%）脱水，二甲苯透明，浸蜡并包埋（见表 2）。
   3. 连续切片，厚度为 5.0 µm。
   4. 苏木精-伊红（HE）染色
      1. 切片先经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，然后浸入苏木精染液中 5 分钟。
      2. 水洗去除多余染料，1% 盐酸酒精分化 3 秒，伊红染色 3 分钟，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片（见表 3）。
      3. 拍摄显微图像，观察骨组织结构及骨髓腔内细胞形态与分布。
   5. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色
      1. 用二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水。
      2. 将切片置于 37 °C 恒温箱中，用 TRAP 染色试剂孵育 1 小时，随后脱水并透明化处理（见表 4）。
      3. 在载玻片上滴加一滴中性树脂，然后以 45° 角从一侧缓慢放下盖玻片，以尽量减少气泡产生。将封片后的玻片置于通风橱中彻底干燥后，再进行显微观察与成像。
6. 胫骨组织中基因表达分析
   1. 骨髓分离
      1. 解剖小鼠胫骨，使用无菌器械去除多余肌肉/筋膜。
      2. 将清理后的胫骨放入 1.5 mL 微量离心管中。
      3. 用无菌剪刀剪开骨的两端。
      4. 使用 1x PBS 将骨髓冲洗至含有无菌研磨珠的研磨管中。
         注意：用 PBS 冲洗骨髓腔，直至骨腔呈淡色且所有可见骨髓组织均被清除。
   2. RNA 提取
      注意：氯仿/异丙醇废液必须单独收集于指定的卤代溶剂容器中，严禁与漂白剂混合，以免产生有毒气体。
      1. 每管加入 1 mL RNA 提取试剂。使用台式匀浆器在 4 °C 条件下匀浆（每次脉冲 30 秒）。裂解物室温孵育 5 分钟。
      2. 加入 200 µL 氯仿，涡旋 15 秒，4 °C 孵育 30 分钟。
      3. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 30 分钟。
      4. 将上层水相转移至新的微量离心管中。加入 500 µL 异丙醇，颠倒混匀 10 次，4 °C 孵育 20 分钟。
      5. 在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 30 分钟。小心弃去上清液，勿扰动 RNA 沉淀。
      6. 用 1 mL 75% 乙醇（用 DEPC 处理水配制）洗涤沉淀。短暂涡旋后，在 4 °C 条件下以 7,500 × g 离心 5 分钟。
      7. 在通风橱中空气干燥沉淀 5–10 分钟（避免过度干燥）。
      8. 用 20–50 µL DEPC 处理水溶解 RNA。
      9. 使用分光光度计测定浓度和纯度（A260/A280 比值 ≥ 1.8）。
   3. cDNA 合成
      1. 使用 1 µg 总 RNA 和逆转录试剂盒合成 cDNA。
      2. 将 cDNA 储存于 −20 °C 用于 qPCR 分析。
   4. qPCR 分析
      1. 分析成骨相关标志物基因表达：Alp、Atf4、Runx2、Ocn、Osx；破骨相关标志物： Nfatc1, Mmp9, Ctsk；细胞因子： Tnf-α, Il-1β, Il-10 （见表 5）。
      2. 使用表 6中列出的引物序列（包含退火温度）。

5. 统计学分析

1. 所有数据均以均值 ± 均值标准误（mean ± SEM）表示。
2. 采用 Bonferroni 和 Tamhane 法进行事后检验。
3. 采用单因素方差分析评估各组之间的差异。
4. 认为 P < 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

长时间高强度跑步机运动训练导致的疲劳
我们建立了一种长期高强度平台跑步运动模型，用于研究运动条件下骨骼的变化以及红外治疗对骨骼的影响（图1A）。在干预结束时，观察小鼠体重的变化。与CTR组小鼠的体重相比，HIT组未出现显著变化，而IRT组则表现出显著降低（图1B）。三组之间血糖水平无显著差异（图1C）。转棒实验数据显示，HIT组小鼠的跌落时间显著低于CTR组，而IRT组小鼠的跌落时间显著高于HIT组（图1D）。

血液乳酸水平升高与疲劳之间存在密切关系¹⁴。高强度体力活动期间产生的高浓度血液乳酸可降低肌肉和血液的pH值，损害某些器官，并导致疲劳¹⁵。高强度运动后血液乳酸水平升高可能与糖酵解增强及能量代谢障碍有...

讨论

在所有代谢性骨病中，骨质疏松症（OP）最为常见，是全球主要的公共卫生问题之一¹¹。当成骨细胞和破骨细胞功能失调时，便会导致OP，其发病率较高¹⁸。由于运动具有成本低、不良反应少等优势，并在OP未来的防治中展现出巨大潜力，因此越来越多地被临床医生和研究人员强调为一种潜在的预防和治疗策略。运动调节骨代谢的机制已被广泛研究，包括直接作用和间接作用¹⁹。运动过程中产生的机械负荷是促进成骨细胞分化和矿化的主要刺激因素，可增加骨量²⁰。此外，运动还可通过调节参与骨代谢的雌激素、甲状旁腺激素（PTH）和糖皮质激素水平来调控骨量；其中雌激素能够调节破骨细胞生成相关细胞因子的产生，从而促进成骨细胞增殖并减少破骨细胞凋亡²¹。综上所述，长期适当的运动有助于提高骨密度（BMD），但增加运动强度对提高BMD的潜在益处仍不明确。

近年来，红外线治疗技术已广泛应用于医学领域...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
远红外治疗仪	Cofoe Medical Technology		随后应用红外辐射作为热源，加热皮下毛细血管网中的血液。治疗温度控制在42 °C至45 °C之间，每次治疗持续约40分钟，每周3次
显微CT	SCANCO Medical AG	VIVACT80	通过显微CT扫描评估左侧股骨小梁骨的参数，包括骨体积分数（BV/TV）、小梁数量（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁分离度（Tb.Sp）以及皮质骨厚度（Ct.Th）。
小鼠跑台	安徽正华生物器械设备有限公司		小鼠高强度跑台运动
石蜡包埋机	Leica		石蜡包埋机可用于组织包埋
石蜡切片机	Leica		石蜡切片机可用于组织切片
PrimeScript RT 试剂盒
SPSS
三溴乙醇		Avertin
TRIzol	Accurate Biology	AG21101/AG21102