Method Article

基于 CRISPR 的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

DOI:

10.3791/68503

⸱

June 13th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In This Article

Summary

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我们描述了一种高通量克隆方法的方案，即基于 CRISPR 的穿梭克隆（CRISPR穿梭克隆），它允许在载体之间转移感兴趣的 DNA 片段，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。

Abstract

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使用现有基因组存储库开发全基因组质粒文库是跨不同生物过程对基因进行系统功能表征的关键先决条件。然而，目前用于载体间 DNA 片段转移的高通量方法需要在克隆之前对靶序列进行 PCR 扩增，这使得基因组规模质粒集合的生成在技术上要求很高且时间密集。通过利用 CRISPRshuttle 盒，我们开发了一种新的高通量克隆方法，即基于 CRISPR 的穿梭克隆（CRISPRshuttle 克隆），该方法有助于将许多 DNA 片段从共享相同骨架序列的供体质粒转移到 CRISPRshuttle 兼容载体上，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。在这里，我们提出了 CRISPRshuttle 的协议。该方案涉及细菌转化前的两个连续试管反应。首先，通过 Cas9 介导的共享载体骨架序列的切割从供体质粒中切除靶 DNA 片段。其次，通过 Gibson 组装将切除的 DNA 片段插入线性化的 CRISPRshuttle 兼容载体中。我们的结果表明，CRISPRshuttle 的效率超过 94%，并且两名研究人员可以使用 CRISPRshuttle 在 7 天内生成约 300 个质粒。CRISPRshuttle 有助于在载体之间高效、适应性强且具有成本效益的 DNA 片段转移，显著简化全基因组质粒文库的生成。

Introduction

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利用可用资源构建全基因组质粒文库是采用功能基因组学剖析生物过程的基础和先决条件。当前的高通量克隆方法，包括 Gateway、In-Fusion、Creator 和 Univector 克隆系统，需要对目标 DNA 片段 1,2,3,4,5 进行 PCR 扩增。此先决条件需要片段特异性处理工作流程，包括多个标准化作，包括但不限于寡核苷酸引物设计、凝胶纯化和通过测序进行的序列验证。因此，构建全基因组质粒文库（例如 cDNA/ORF 过表达文库）已成为劳动密集型和耗时的，阻碍了功能基因组学的发展。

之前，我们开发了 CRISPRmass，这是一种高通量克隆方法，旨在将特定 DNA 片段（例如 UAS 模块）整合到共享相同载体骨架的多个质粒中6。使用 CRISPRmass，我们从果 蝇 cDNA/ORF 文库、果 蝇 基因组学资源中心 （DGRC） 黄金收藏6 中构....

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Protocol

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1. 确定 cDNA/ORF 侧翼的最佳 Cas9/sgRNA 切割位点

  1. cDNA/ORF 质粒的制备
    1. 从公共存储库获取 cDNA/ORF 克隆。
      注：该方案使用来自人 CCSB 广泛慢病毒表达文库8 的基于 pLX304 载体的 ORF 克隆。
    2. 使用质粒小量制备试剂盒分离质粒，并用分光光度计测量其浓度。
  2. sgRNA 设计
    1. 访问 CHOPCHOP 网站 （https://chopchop.cbu.uib.no/）。将 ORF 3' 末端两侧的 pLX304 载体骨架的 20-100 bp 区域粘贴到目标字段中。
    2. 选择 Drosophila melanogaster 作为 物种 ，然后单击 Find Target Sites。选择预计效率超过 80% 的 sgRNA 候选者。
  3. sgRNA 制备
    1. 合成正向引物 （5'-TAATACGACTCACTATAGG（N）20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3'），其中 （N）20 代表....

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Results

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我们利用 CRISPRshuttle 构建了一个 UAS-cDNA/ORF 质粒集合，该质粒集合涵盖了 1,397 个在 果蝇7 中保守的人类基因。限制性分析显示，CRISPRshuttle 使用包含两个重复序列的 CRISPRshuttle 兼容目标载体的效率达到 94.5%，使用不含重复序列的目标载体的效率达到 96.1%7。我们的数据表明，通常两名研究人员可以在 7 天内通过 CRISPRshuttle 创建 ~300 个质粒7。通过诊断限制性消化验证了 CRISPRshuttle 介导的 cDNA/ORF 片段转移成功。产生 CRISPRshuttle 兼容目标载体 （pBIDC-UASC-pLXvect） 骨架特异性片段（用 PvuII 消化的 1,072 bp 和 1,820 bp）的反应被认为是阳性的（图 3）。这些经过验证的 UAS-cDNA/ORF 构建体随后进行了全面的限制性作图分析，以确认质粒的完.......

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Discussion

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CRISPRshuttle 方案中的一个关键步骤是制备线性化的 CRISPRshuttle 兼容目标载体。为确保完全消化，请使用过量的限制性内切酶来消化载体，强烈建议对消化的载体进行凝胶纯化。另一个关键步骤是用 Cas9 消化 cDNA/ORF 质粒。如果质粒构建失败，请使用琼脂糖凝胶电泳检查是否至少部分 cDNA/ORF 已从供体质粒中释放。或者，在进行 Gibson 组装之前，通过电泳检查所有质粒的消化情况。只要释放部分 cDNA/ORF，CRISPRshuttle 通常就可以有效发挥作用。如果 cDNA/ORF 几乎无法从供体质粒中释放出来，则重新提取质粒。

我们将 CRISPRshuttle 与广泛使用的高通量克隆系统 Gateway 在从人 CCSB-Broad 慢病毒表达文库的 pLX304 载体中克隆的 ORF 构建 UAS-cDNA/ORF 质粒文库进行了比较。Gateway 系统涉及两个连续的步骤1.最初，入门构建体是通过 BP 反应创建的。这需要为.......

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Disclosures

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作者没有需要披露的利益冲突。

Acknowledgements

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这项研究得到了中国国家自然科学基金 （32071135） 的资助和南华大学衡阳医学院附属南华医院的启动基金的支持。我们感谢 Feng Zhang 教授的慷慨提供 pX330 质粒，并感谢 Xiaohui Cai 博士的技术帮助。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
琼脂粉化学碱基KBS-001H
琼脂 糖桑贡A600014-0100
自动数字凝胶图像分析系统塔农塔农-2500B
氯霉素桑贡A100230-0010
E.Z.N.A. 凝胶提取试剂盒欧米茄型号D2500-02
E.Z.N.A. 质粒 DNA 迷你试剂盒 I欧米茄型号D6942-02
EcoRI-HF型NEBR3101S型
Gibson 组装预混液NEBE2611S型
HiScribe T7 快速高产量 RNA 合成试剂盒NEBE2050型
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液NEBE2621X型
PCR热循环仪隆基因T20
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶Thermo Scientific12361010
PvuII-HF型NEBR3151L
Q5 热启动高保真 2x 预混液NEB型号M0494
化脓性Cas9金斯瑞Z03386
摇动培养箱智初ZQLY-180V型
分光光度计岛津生物规格-纳米
T4 DNA 连接酶普罗梅加M1801型
Trans 10 化学感受态细胞转基因CD101-02型
胰蛋白胨氧化物LP0042
XbaI的NEBR0145S
酵母提取物氧化物LP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  2. Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from th....

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Tags

CRISPR Shuttle CloningHigh Throughput CloningGenome Wide Plasmid LibrariesDNA Fragment TransferCas9 Mediated CleavageGibson AssemblyPlasmid Library GenerationDonor PlasmidsVector BackboneFunctional Genomics

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