基于 CRISPR 的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

Summary

我们描述了一种高通量克隆方法的方案，即基于 CRISPR 的穿梭克隆（CRISPR穿梭克隆），它允许在载体之间转移感兴趣的 DNA 片段，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。

Abstract

使用现有基因组存储库开发全基因组质粒文库是跨不同生物过程对基因进行系统功能表征的关键先决条件。然而，目前用于载体间 DNA 片段转移的高通量方法需要在克隆之前对靶序列进行 PCR 扩增，这使得基因组规模质粒集合的生成在技术上要求很高且时间密集。通过利用 CRISPRshuttle 盒，我们开发了一种新的高通量克隆方法，即基于 CRISPR 的穿梭克隆（CRISPRshuttle 克隆），该方法有助于将许多 DNA 片段从共享相同骨架序列的供体质粒转移到 CRISPRshuttle 兼容载体上，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。在这里，我们提出了 CRISPRshuttle 的协议。该方案涉及细菌转化前的两个连续试管反应。首先，通过 Cas9 介导的共享载体骨架序列的切割从供体质粒中切除靶 DNA 片段。其次，通过 Gibson 组装将切除的 DNA 片段插入线性化的 CRISPRshuttle 兼容载体中。我们的结果表明，CRISPRshuttle 的效率超过 94%，并且两名研究人员可以使用 CRISPRshuttle 在 7 天内生成约 300 个质粒。CRISPRshuttle 有助于在载体之间高效、适应性强且具有成本效益的 DNA 片段转移，显著简化全基因组质粒文库的生成。

Introduction

利用可用资源构建全基因组质粒文库是采用功能基因组学剖析生物过程的基础和先决条件。当前的高通量克隆方法，包括 Gateway、In-Fusion、Creator 和 Univector 克隆系统，需要对目标 DNA 片段 1,2,3,4,5 进行 PCR 扩增。此先决条件需要片段特异性处理工作流程，包括多个标准化作，包括但不限于寡核苷酸引物设计、凝胶纯化和通过测序进行的序列验证。因此，构建全基因组质粒文库（例如 cDNA/ORF 过表达文库）已成为劳动密集型和耗时的，阻碍了功能基因组学的发展。

之前，我们开发了 CRISPRmass，这是一种高通量克隆方法，旨在将特定 DNA 片段（例如 UAS 模块）整合到共享相同载体骨架的多个质粒中⁶。使用 CRISPRmass，我们从果 蝇 cDNA/ORF 文库、果 蝇 基因组学资源中心 （DGRC） 黄金收藏⁶ 中构建了 5,500 多个基于 GAL4/UAS 的 UAS-cDNA/ORF 质粒。然而，CRISPRmass 缺乏在载体之间转移 DNA 片段的能力，限制了其在高通量克隆中的应用。

为了解决这些限制，我们开发了基于 CRISPR 的穿梭克隆 （CRISPRshuttle），这是一种新型的高通量方法，可促进将多个靶 DNA 片段从供体质粒转移到目标载体⁷。该工艺只需要两次连续的试管反应，从而避免了对离散 DNA 靶标进行片段特异性处理的要求⁷。

CRISPRshuttle 方案涉及两个连续的试管反应（图 1）。首先，供体质粒的共享载体骨架序列被 Cas9/sgRNA 切割以释放靶 DNA 片段。然后，这些片段通过 Gibson 组装转移到 CRISPRshuttle 兼容载体的 CRISPRshuttle 盒中，以生成最终质粒。CRISPRshuttle 盒包含一个 ~20-40 bp 载体骨架序列，该序列位于来源于供体质粒的 DNA 片段的 5' 和 3' 末端的两侧，以及位于这些侧翼序列之间的一个或两个独特的限制性内切酶识别位点。通过将 CRISPRshuttle 盒插入目标载体中来构建 CRISPRshuttle 兼容载体，随后通过消化盒内的限制性位点对其进行线性化。目标载体必须携带与供体质粒中的抗生素抗性基因不同的基因;如果相同，则必须在使用前用不同的 Resistance 基因替换。

在这里，我们提出了一个利用 CRISPRshuttle 构建 UAS-cDNA/ORF 质粒文库的详细方案。该过程包括将人 ORF 从 CCSB-广泛慢病毒表达文库转移到果蝇转基因载体 pBID-UASC^{中 8,9}。CRISPRshuttle 简化了全基因组质粒文库的构建，从而促进了功能基因组学研究。

Protocol

1. 确定 cDNA/ORF 侧翼的最佳 Cas9/sgRNA 切割位点

1. cDNA/ORF 质粒的制备
   1. 从公共存储库获取 cDNA/ORF 克隆。
      注：该方案使用来自人 CCSB 广泛慢病毒表达文库⁸ 的基于 pLX304 载体的 ORF 克隆。
   2. 使用质粒小量制备试剂盒分离质粒，并用分光光度计测量其浓度。
2. sgRNA 设计
   1. 访问 CHOPCHOP 网站 （https://chopchop.cbu.uib.no/）。将 ORF 3' 末端两侧的 pLX304 载体骨架的 20-100 bp 区域粘贴到目标字段中。
   2. 选择 Drosophila melanogaster 作为 物种 ，然后单击 Find Target Sites。选择预计效率超过 80% 的 sgRNA 候选者。
3. sgRNA 制备
   1. 合成正向引物 （5'-TAATACGACTCACTATAGG（N）₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3'），其中 （N）₂₀ 代表 sgRNA 靶序列，以及反向引物 sgRNA-REV （5'-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3'）。
      注意：建议使用 PAGE 纯化的引物。
   2. 通过 PCR 生成用于 sgRNA 体外 转录 （IVT） 的 DNA 模板。制备一个 100 μL 反应物，其中含有 5 μL 模板 pX330（Addgene 质粒 42230;0.1 ng/μL）、正向引物 （10 μM） 和 sgRNA-REV 引物 （10 μM）;50 μL 2x 高保真 PCR 预混液;以及 35 μL 焦碳酸二乙酯 （DEPC） 处理的超纯水。
   3. 使用以下程序在 PCR 热循环仪中扩增：98 °C 30 秒;98°C 8 s、52°C 15 s、72°C 5 s 的 5 个循环;98 °C 30 次循环 8 秒，72 °C 20 秒;72 °C 2 分钟。
   4. 在 0.8% 琼脂糖凝胶上分离 PCR 产物。切除 ~120 bp 条带并使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
   5. 制备一个 10 μL IVT 反应物，其中包含 300 ng 纯化的 DNA 片段、3.33 μL NTP 缓冲液混合物、0.67 μL T7 RNA 聚合酶混合物和 DEPC 处理的超纯水。在 37 °C 下孵育 4 小时。
   6. 通过分光光度法定量未纯化的 sgRNA，用 DEPC 处理的超纯水稀释至 20 ng/μL，并在 -80 °C 下以小等分试样冷冻。
      注：不需要 DNase 处理，因为残留的 DNA 不会干扰下游反应。
4. sgRNA 评估
   1. 使用限制性内切酶消化含有 pLX304 载体骨架的 cDNA/ORF 质粒。通过 0.8% 琼脂糖凝胶分离所得的 DNA 片段。使用凝胶提取试剂盒纯化 DNA 底物。
   2. 制备 5 μL Cas9 切割反应混合物，其中含有 0.2 μL 1.22 μM 化脓性链球菌 Cas9、0.5 μL 20 ng/μL sgRNA、0.015 pmol DNA 底物、0.5 μL 10x Cas9 缓冲液和 DEPC 处理的超纯水。将反应物在 37 °C 下孵育 1 小时。
   3. 使用 0.8% 琼脂糖凝胶分离切割产物。包括未切割的 DNA 底物作为阴性对照。
   4. 使用数字成像系统可视化切割模式，并选择残留未切割底物最少的 sgRNA 用于后续实验（图 2）。

2. 交换目的载体的抗生素抗性基因

注意：在本方案中，我们使用将目标载体 pBID-UASC 的氨苄青霉素抗性基因与氯霉素抗性基因交换的示例，从而生成携带氯霉素的目标载体 pBIDC-UASC。

1. 从 pBID-UASC 中去除氨苄青霉素抗性基因。
   注：pBID-UASC 的氨苄青霉素抗性基因通过 Cas9 与两个 sgRNA f1Ori5-G4 （靶序列：5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3'） 和 Amp3-G2 （靶序列：5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'）一起消化去除，产生 7,687 bp 线性 pBID-UASC 载体骨架。这两个 sgRNA 分别靶向氨苄青霉素抗性基因的上游 5' 和下游 3'。
   1. 制备一个 10 μL 切割反应物，其中包含 0.03 pmol 的 pBID-UASC、0.25 μL 的 1.22 μM 化脓性链球菌 Cas9、20 ng f1Ori5-G4、20 ng Amp3-G2、1 μL 10x Cas9 缓冲液和 DEPC 处理的超纯水。在 37 °C 孵育 1 小时。
      注：Cas9 裂解的质粒，未经纯化，直接进行 Gibson 组装。
2. PCR 扩增氯霉素耐药基因。
   注：使用 f1Ori5-Cam-F （5'-TTACAATTCACTGGCC） 通过 PCR 从质粒 pMartini-Cam⁶ 中扩增出 840 bp 氯霉素抗性基因
   GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3'） 和 Amp3-cam-R （5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
   GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3'） 引物。
   1. 通过 PCR 扩增 840 bp 氯霉素抗性基因来制备氯霉素抗性基因。构建一个 20 μL PCR 反应，其中包含 2 μL pMartini-Cam （0.1 ng/μL）、1 μL f1Ori5-Cam-F （10 μM）、1 μL Amp3-Cam-R （10 μM）、4 μL 5x 缓冲液、0.4 μL dNTP （10 mM）、0.4 μL 高保真 DNA 聚合酶 （2.5 单位/μL）、11.2 μL 超纯水。
   2. 使用以下热循环条件进行 PCR：1 个 95 °C 循环，1 分钟;95 °C 15 s、46 °C 15 s、72 °C 20 s 的 5 个循环;95 °C 持续 15 秒、61 °C 持续 15 秒、72 °C 持续 20 秒的 30 个循环;72 °C 1 个循环，持续 2 分钟。在热循环仪中进行反应。
   3. 用 0.8% 琼脂糖凝胶分离切割产物，并使用凝胶提取试剂盒纯化 840 bp DNA 片段。
3. 将氯霉素抗性基因插入线性化的 pBID-UASC 载体骨架中，产生 pBIDC-UASC。
   1. 进行 2 μL Gibson 组装反应：0.008 pmol 的 840 bp 氯霉素抗性基因，0.002 pmol 的线性化 pBID-UASC（步骤 2.1.1），1.0 μL 的 2x Gibson 组装预混液。在 50 °C 下反应 1 小时。
   2. 用 1 μL 连接反应产物转化 10 μL 大肠 杆菌感受态细胞。在补充有 15 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上选择转化体。
   3. 挑选一个菌落，并对其进行后续的细菌培养和质粒小量制备。通过限制性分析和 DNA 测序验证含氯霉素的目标载体 pBIDC-UASC。

3. 构建 CRISPRshuttle 兼容的目标载体

注：CRISPRshuttle 盒包含约 20-40 bp 的载体骨架序列，这些序列位于靶 DNA 片段的 5' 和 3' 末端两侧，它们之间有一个或两个独特的限制性位点。

1. 使用热循环仪进行寡核苷酸退火，程序如下：94 °C 2 分钟;在 （95-N） °C 下进行 70 次循环，每次 52 秒，其中 N 表示循环数。
   注意：退火的 CRISPRshuttle 盒包含与 EcoRI 和 XbaI 互补的 5'-突出端。
2. 将退火的 CRISPRshuttle 盒连接到 EcoRI/XbaI 消化的目标载体 pBIDC-UASC 中，以生成 CRISPRshuttle 兼容的目标载体 pBIDC-UASC-pLXvect。
   注：这种连接消除了多个克隆位点中的原始 EcoRI 和 XbaI 位点，使 CRISPRshuttle 盒中间的 EcoRI 和 XhoI 位点在最终载体中是唯一的。CRISPRshuttle 盒中独特的限制性位点可实现 CRISPRshuttle 兼容目标载体的线性化。
   1. 准备一个 5 μL 连接反应物，其中包含 14 ng 8,451 bp EcoRI/XbaI 消化的 pBIDC-UASC、0.02 pmol 退火的 CRISPRshuttle 盒、0.5 μL 的 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、0.3 μL 的 T4 DNA 连接酶。将反应物在 16 °C 下孵育过夜。
   2. 用 1 μL 连接反应产物转化 10 μL 大肠杆菌 感受态细胞。在补充有 15 μg/mL 氯霉素的 LB 板上选择转化体，并在 37 °C 下孵育过夜。
   3. 挑选一个菌落，并对其进行后续的细菌培养和质粒小量制备。通过限制性分析和 DNA 测序验证 CRISPRshuttle 兼容的目标载体 pBIDC-UASC-pLXvect。

4. 使用 CRISPRshuttle 生成 UAS-cDNA/ORF 质粒

注意：CRISPRshuttle 方案涉及在细菌转化之前平行进行的两步试管反应（图 1）。

1. 试管反应步骤 1
   1. 通过使用 Cas9 结合两种 sgRNA，pLX304-CMV-G1⁶ （靶序列：5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3'，位于 ORF 5' 末端侧翼的 pLX304 载体骨架）和 pLX304-3'-G1（靶序列：5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3'，位于 ORF 3' 末端侧翼的 pLX304 载体骨架），从 pLX304-ORF 质粒中切除 ORF）。
      1. 为给定数量 （N） 的消化反应制备预混液，如下所示：（N+1） x 0.4 μL 1.22 μM 化脓性链球菌 Cas9，（N+1） x 0.5 μL 80 ng/μL pLX304-CMV-G1，（N+1） x 0.5 μL 80 ng/μL pLX304-3'-G1，（N+1） x 0.4 μL 10x Cas9 缓冲液，以及 （N+1） x 1.45 μL DEPC 处理的超纯水。
      2. 充分混合并旋转预混液。将 3.75 μL 预混液分装到每个试管中。向每个试管中加入 0.75 μL 0.03 μM pLX304-ORF 质粒。充分混合并在 37 °C 下孵育反应 1 小时。
         注：用 DEPC 处理的超纯水将每个 pLX304-ORF 质粒稀释至 0.03 μM 的浓度。如果浓度小于 0.03 μM，则直接向反应中加入质粒 DNA。Cas9 裂解的质粒在切割反应后无需纯化，可直接用于后续的 Gibson 组装。
2. 试管反应步骤 2
   1. 通过 Gibson 组装将切除的 ORF 插入 CRISPRshuttle 兼容的目标载体 pBIDC-UASC-pLXvect 中，得到 UAS-cDNA/ORF 质粒。
      1. 使用 EcoRI 和 XbaI 消化 pBIDC-UASC-pLXvect。通过琼脂糖凝胶电泳分离线性化的 pBIDC-UASC-pLXvect，并使用凝胶提取试剂盒纯化。
      2. 为给定数量 （N） 的 Gibson 组装反应制备预混液，如下所示：（N+1） x 0.14 μL 3.36 μM 线性化 pBIDC-UASC-pLXvect，以及 （N+1） x 1.8 μL Gibson 组装预混液。
      3. 充分混合并旋转预混液。将 1.94 μL 预混液分装到每个试管中。向每个试管中加入 1.66 μL Cas9 裂解的质粒。充分混合并在 50 °C 下孵育反应 1 小时。
         注意：在 50 °C 下孵育之前，将预混液和试管保持冰镇。
3. 使用 Gibson 组装产品转化 大肠 杆菌。
   注：Gibson 组装的产物在大 肠杆菌 转化之前不需要纯化。
   1. 在冰上解冻细菌感受态细胞。将 10 μL 细胞分装到每个预冷的 1.5 mL 试管中。
      注：建议使用转化效率至少为 1 × 10⁸ CFU/μg pUC19 DNA 的感受态细菌细胞。
   2. 将 10 μL 感受态细胞与 1 μL Gibson 组装产品轻轻混合。置于冰上 30 分钟。
   3. 在 42 °C 下热休克 1 分钟，然后在冰上冷却 2 分钟。
   4. 向每个试管中加入 100 μL 预热的 SOC 培养基 （37 °C）。在 37 °C 下以 250 rpm 摇动 1 小时。
   5. 将细胞放在含有 15 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上。在 37 °C 下孵育过夜。
      注意：大规模执行这些程序通常需要几个小时。除非另有说明，否则请将试剂和反应设置都放在冰上。
4. UAS-cDNA/ORF 质粒的验证。
   1. 在 4.5 mL 含 15 μg/mL 氯霉素的 LB 培养基中接种单个菌落。在 37 °C 下以 250 rpm 振荡过夜。
   2. 使用质粒小量制备试剂盒分离质粒 DNA。
   3. 为每个质粒制备 20 μL 限制性消化反应，其中包含 300-500 ng 质粒 DNA、0.3 μL PvuII、2 μL 10x 缓冲液和超纯水。在 37 °C 下进行反应 1 小时。
   4. 用 0.8% 琼脂糖凝胶分离 DNA 片段。紫外光下的图像（图 3）。

Results

我们利用 CRISPRshuttle 构建了一个 UAS-cDNA/ORF 质粒集合，该质粒集合涵盖了 1,397 个在 果蝇⁷ 中保守的人类基因。限制性分析显示，CRISPRshuttle 使用包含两个重复序列的 CRISPRshuttle 兼容目标载体的效率达到 94.5%，使用不含重复序列的目标载体的效率达到 96.1%⁷。我们的数据表明，通常两名研究人员可以在 7 天内通过 CRISPRshuttle 创建 ~300 个质粒⁷。通过诊断限制性消化验证了 CRISPRshuttle 介导的 cDNA/ORF 片段转移成功。产生 CRISPRshuttle 兼容目标载体 （pBIDC-UASC-pLXvect） 骨架特异性片段（用 PvuII 消化的 1,072 bp 和 1,820 bp）的反应被认为是阳性的（图 3）。这些经过验证的 UAS-cDNA/ORF 构建体随后进行了全面的限制性作图分析，以确认质粒的完...

Discussion

CRISPRshuttle 方案中的一个关键步骤是制备线性化的 CRISPRshuttle 兼容目标载体。为确保完全消化，请使用过量的限制性内切酶来消化载体，强烈建议对消化的载体进行凝胶纯化。另一个关键步骤是用 Cas9 消化 cDNA/ORF 质粒。如果质粒构建失败，请使用琼脂糖凝胶电泳检查是否至少部分 cDNA/ORF 已从供体质粒中释放。或者，在进行 Gibson 组装之前，通过电泳检查所有质粒的消化情况。只要释放部分 cDNA/ORF，CRISPRshuttle 通常就可以有效发挥作用。如果 cDNA/ORF 几乎无法从供体质粒中释放出来，则重新提取质粒。

我们将 CRISPRshuttle 与广泛使用的高通量克隆系统 Gateway 在从人 CCSB-Broad 慢病毒表达文库的 pLX304 载体中克隆的 ORF 构建 UAS-cDNA/ORF 质粒文库进行了比较。Gateway 系统涉及两个连续的步骤¹.最初，入门构建体是通过 BP 反应创建的。这需要为...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂粉	化学碱基	KBS-001H
琼脂 糖	桑贡	A600014-0100
自动数字凝胶图像分析系统	塔农	塔农-2500B
氯霉素	桑贡	A100230-0010
E.Z.N.A. 凝胶提取试剂盒	欧米茄	型号D2500-02
E.Z.N.A. 质粒 DNA 迷你试剂盒 I	欧米茄	型号D6942-02
EcoRI-HF型	NEB	R3101S型
Gibson 组装预混液	NEB	E2611S型
HiScribe T7 快速高产量 RNA 合成试剂盒	NEB	E2050型
NEBuilder HiFi DNA 组装预混液	NEB	E2621X型
PCR热循环仪	隆基因	T20
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶	Thermo Scientific	12361010
PvuII-HF型	NEB	R3151L
Q5 热启动高保真 2x 预混液	NEB	型号M0494
化脓性Cas9	金斯瑞	Z03386
摇动培养箱	智初	ZQLY-180V型
分光光度计	岛津	生物规格-纳米
T4 DNA 连接酶	普罗梅加	M1801型
Trans 10 化学感受态细胞	转基因	CD101-02型
胰蛋白胨	氧化物	LP0042
XbaI的	NEB	R0145S
酵母提取物	氧化物	LP0021