我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle cloning）的实验方案，该方法能够在无需对目标DNA片段进行PCR扩增的情况下，实现DNA片段在不同载体之间的转移。
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本文内容
摘要
摘要
利用现有的基因组文库构建全基因组范围的质粒文库，是系统性功能表征多种生物学过程中基因的关键前提。然而，目前用于质粒间DNA片段转移的高通量方法通常需要在克隆前对目标序列进行PCR扩增，使得全基因组规模质粒文库的构建在技术上具有挑战性且耗时较长。通过使用CRISPRshuttle盒，我们开发了一种新的高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle克隆），该方法能够在无需对DNA片段进行PCR扩增的情况下，将多个具有相同骨架序列的供体质粒中的DNA片段转移到CRISPRshuttle兼容载体中。本文中，我们提供了一套CRISPRshuttle的操作方案。该方案在细菌转化前包含两个连续的试管反应步骤：首先，通过Cas9介导的切割，从供体质粒中共有的载体骨架序列上切除目标DNA片段；其次，通过Gibson组装将切除的DNA片段插入线性化的CRISPRshuttle兼容载体中。实验结果表明，CRISPRshuttle的克隆效率超过94%，两名研究人员可在7天内利用该方法构建约300个质粒。CRISPRshuttle实现了载体间高效、灵活且低成本的DNA片段转移，显著简化了全基因组质粒文库的构建流程。
引言
利用现有资源构建全基因组质粒文库是采用功能基因组学解析生物学过程的基础和前提。目前的高通量克隆方法，包括Gateway、In-Fusion、Creator和Univector克隆系统，均需要对目标DNA片段进行PCR扩增1,2,3,4,5。这一前提条件涉及针对特定片段的处理流程，包含多项标准化操作，如寡核苷酸引物设计、凝胶纯化以及通过测序进行序列验证等。因此，构建全基因组质粒文库（例如cDNA/ORF过表达文库）已变得费力且耗时，阻碍了功能基因组学的发展。
此前，我们开发了CRISPRmass，这是一种高通量克隆方法，旨在将特定DNA片段（例如UAS模块）整合到多个具有相同载体骨架的质粒中6利用CRISPRmass技术，我们构建了5,500多个基于GAL4/UAS系统的UAS-cDNA/ORF质粒 果蝇 cDNA/ORF文库，该 黑腹果蝇 基因组资源中心（DGRC）黄金文库6然而，CRISPRmass 缺乏在载体之间转移 D....
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方案
1. 确定侧翼cDNA/ORF的最优Cas9/sgRNA切割位点
- cDNA/ORF 质粒的制备
- 从公共数据库获取 cDNA/ORF 克隆。
注意：本实验方案使用来自人类 CCSB-Broad 慢病毒表达文库的基于 pLX304 载体的 ORF 克隆8. - 使用质粒小提试剂盒提取质粒，并用分光光度计测定其浓度。
- 从公共数据库获取 cDNA/ORF 克隆。
- sgRNA 设计
- 访问 CHOPCHOP 网站（https://chopchop.cbu.uib.no/）。将 pLX304 载体骨架中位于 ORF 3' 端侧翼的 20–100 bp 区域序列粘贴至目标输入框中。
- 选择 黑腹果蝇 作为 物种 并点击 寻找靶位点选择预测效率超过80%的sgRNA候选序列。
- sgRNA 制备
- 合成一条正向引物（5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′）其中（N）20 代表sgRNA靶向序列，以及一条反向引物sgRNA-REV（5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-....
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结果
我们利用CRISPRshuttle构建了一个覆盖1,397个在Drosophila中保守的人类基因的UAS-cDNA/ORF质粒文库7。限制性酶切分析显示，CRISPRshuttle在使用含有两个重复序列的CRISPRshuttle兼容性目的载体时效率达到94.5%，在使用不含重复序列的目的载体时效率为96.1%7。我们的数据表明，通常情况下，两名研究人员可在7天内通过CRISPRshuttle构建约300个质粒7。通过诊断性限制性酶切验证了CRISPRshuttle介导的cDNA/ORF片段转移的成功率。酶切反应产生CRISPRshuttle兼容性目的载体（pBIDC-UASC-pLXvect）骨架特异性片段（PvuII酶切产生1,072 bp和1,820 bp片段）的结果被视为阳性（图3）。这些经验证的UAS-cDNA/ORF构建体随后进行了全面的限制性酶切图谱分析，以确认质粒的完整性。限制性酶切分析的代表性结果如.......
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讨论
CRISPRshuttle 实验方案中的一个关键步骤是制备线性化的、与 CRISPRshuttle 兼容的载体。为确保完全酶切，应使用过量的限制性内切酶对载体进行消化，并强烈建议对消化后的载体进行凝胶纯化。另一个关键步骤是使用 Cas9 对 cDNA/ORF 质粒进行消化。如果质粒构建失败，可利用琼脂糖凝胶电泳检测是否已有部分 cDNA/ORF 从供体质粒中释放出来。或者，在进行 Gibson 组装前，可通过电泳检测所有质粒的消化情况。只要部分 cDNA/ORF 能够被释放，CRISPRshuttle 通常即可有效发挥作用。如果 cDNA/ORF 几乎无法从供体质粒中释放，则需重新提取质粒。
我们比较了CRISPRshuttle与广泛使用的高通量克隆系统Gateway在构建UAS-cDNA/ORF质粒文库方面的性能，该文库来源于人类CCSB-Broad慢病毒表达文库中已克隆于pLX304载体的ORF。Gateway系统包含两个连续步骤1。首先，通过BP反应构建入门载体，此过程需要针对每个ORF进行定制化操作，包括引物设计与合成、PCR.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（32071135）和南华大学衡阳医学院附属南华医院启动资金的资助。我们感谢张锋教授惠赠pX330质粒，感谢蔡晓辉博士提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂粉 | Chembase | KBS-001H | |
| 琼脂糖 | Sangon | A600014-0100 | |
| 全自动数字凝胶图像分析系统 | Tanon | Tanon-2500B | |
| 氯霉素 | Sangon | A100230-0010 | |
| E.Z.N.A. 凝胶回收试剂盒 | Omega | D2500-02 | |
| E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I | Omega | D6942-02 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| HiScribe T7 快速高效RNA合成试剂盒 | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621X | |
| PCR扩增仪 | LongGene | T20 | |
| Platinum SuperFi II DNA聚合酶 | Thermo Scientific | 12361010 | |
| PvuII-HF | NEB | R3151L | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| 摇床培养箱 | Zhichu | ZQLY-180V | |
| 分光光度计 | Shimadzu | BioSpec-nano | |
| T4 DNA连接酶 | Promega | M1801 | |
| Trans 10 化学感受态细胞 | TransGen | CD101-02 | |
| 胰蛋白胨 | Oxoid | LP0042 | |
| XbaI | NEB | R0145S | |
| 酵母提取物 | Oxoid | LP0021 |
参考文献
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).
- Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from th....
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重印与许可
