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基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

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DOI：

10.3791/68503

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2025年6月13日

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1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 4Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle cloning）的实验方案，该方法能够在无需对目标DNA片段进行PCR扩增的情况下，实现DNA片段在不同载体之间的转移。

摘要

利用现有的基因组文库构建全基因组范围的质粒文库，是系统性功能表征多种生物学过程中基因的关键前提。然而，目前用于质粒间DNA片段转移的高通量方法通常需要在克隆前对目标序列进行PCR扩增，使得全基因组规模质粒文库的构建在技术上具有挑战性且耗时较长。通过使用CRISPRshuttle盒，我们开发了一种新的高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle克隆），该方法能够在无需对DNA片段进行PCR扩增的情况下，将多个具有相同骨架序列的供体质粒中的DNA片段转移到CRISPRshuttle兼容载体中。本文中，我们提供了一套CRISPRshuttle的操作方案。该方案在细菌转化前包含两个连续的试管反应步骤：首先，通过Cas9介导的切割，从供体质粒中共有的载体骨架序列上切除目标DNA片段；其次，通过Gibson组装将切除的DNA片段插入线性化的CRISPRshuttle兼容载体中。实验结果表明，CRISPRshuttle的克隆效率超过94%，两名研究人员可在7天内利用该方法构建约300个质粒。CRISPRshuttle实现了载体间高效、灵活且低成本的DNA片段转移，显著简化了全基因组质粒文库的构建流程。

引言

利用现有资源构建全基因组质粒文库是采用功能基因组学解析生物学过程的基础和前提。目前的高通量克隆方法，包括Gateway、In-Fusion、Creator和Univector克隆系统，均需要对目标DNA片段进行PCR扩增1,2,3,4,5。这一前提条件涉及针对特定片段的处理流程，包含多项标准化操作，如寡核苷酸引物设计、凝胶纯化以及通过测序进行序列验证等。因此，构建全基因组质粒文库（例如cDNA/ORF过表达文库）已变得费力且耗时，阻碍了功能基因组学的发展。

此前，我们开发了CRISPRmass，这是一种高通量克隆方法，旨在将特定DNA片段（例如UAS模块）整合到多个具有相同载体骨架的质粒中6利用CRISPRmass技术，我们构建了5,500多个基于GAL4/UAS系统的UAS-cDNA/ORF质粒 果蝇 cDNA/ORF文库，该 黑腹果蝇 基因组资源中心（DGRC）黄金文库6然而，CRISPRmass 缺乏在载体之间转移 DNA 片段的能力，限制了其在高通量克隆中的应用。

为解决这些局限性，我们开发了基于CRISPR的穿梭克隆技术（CRISPRshuttle），这是一种新型高通量方法，可将多个目标DNA片段从供体质粒高效转移至目的载体7。该过程仅需两个连续的试管反应，从而避免了对各个特定DNA片段进行单独操作的需要7。

CRISPRshuttle 实验方案包含两个连续的试管内反应（图1）。首先，利用 Cas9/sgRNA 切割供体质粒中共有的载体骨架序列，从而释放目标 DNA 片段。随后，这些片段通过 Gibson 组装连接至 CRISPRshuttle 载体的 CRISPRshuttle 盒中，以生成最终的质粒。CRISPRshuttle 盒包含一段约 20–40 bp 的载体骨架序列，该序列位于来自供体质粒的 DNA 片段的 5' 和 3' 两端侧翼区域，并在这些侧翼序列之间含有一种或两种独特的限制性内切酶识别位点。CRISPRshuttle 兼容载体是通过将 CRISPRshuttle 盒插入目的载体中构建而成，随后通过消化盒内的限制性酶切位点使该载体线性化。目的载体必须携带与供体质粒中不同的抗生素抗性基因；若相同，则必须在使用前将其抗性基因替换为不同的抗性基因。

本文介绍了一种利用CRISPRshuttle构建UAS-cDNA/ORF质粒文库的详细实验方案。该过程包括将人源ORF从CCSB-Broad慢病毒表达文库转移至目标载体中 黑腹果蝇 转基因载体 pBID-UASC8,9CRISPRshuttle 简化了全基因组质粒文库的构建，从而促进了功能基因组学研究。

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方案

1. 确定侧翼cDNA/ORF的最优Cas9/sgRNA切割位点

  1. cDNA/ORF 质粒的制备
    1. 从公共数据库获取 cDNA/ORF 克隆。
      注意：本实验方案使用来自人类 CCSB-Broad 慢病毒表达文库的基于 pLX304 载体的 ORF 克隆8.
    2. 使用质粒小提试剂盒提取质粒，并用分光光度计测定其浓度。
  2. sgRNA 设计
    1. 访问 CHOPCHOP 网站（https://chopchop.cbu.uib.no/）。将 pLX304 载体骨架中位于 ORF 3' 端侧翼的 20–100 bp 区域序列粘贴至目标输入框中。
    2. 选择 黑腹果蝇 作为 物种 并点击 寻找靶位点选择预测效率超过80%的sgRNA候选序列。
  3. sgRNA 制备
    1. 合成一条正向引物（5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′）其中（N）20 代表sgRNA靶向序列，以及一条反向引物sgRNA-REV（5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′）。
      注意：建议使用PAGE纯化的引物。
    2. 生成sgRNA的DNA模板 体外 通过PCR进行体外转录（IVT）。准备一个100 µL反应体系，包含5 µL模板pX330（Addgene质粒42230；0.1 ng/µL）、5 µL正向引物（10 µM）、5 µL sgRNA-REV引物（10 µM）、50 µL 2x高保真PCR预混液以及35 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水。
    3. 使用以下程序在PCR扩增仪中进行扩增：98 °C 预变性30 s；5个循环：98 °C 变性8 s，52 °C 退火15 s，72 °C 延伸5 s；30个循环：98 °C 变性8 s，72 °C 延伸20 s；最后72 °C 终延伸2 min。
    4. 在0.8%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。切下约120 bp的条带，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。
    5. 准备一个10 µL的体外转录（IVT）反应体系，包含300 ng纯化的DNA片段、3.33 µL NTP缓冲液混合物、0.67 µL T7 RNA聚合酶混合物，以及DEPC处理的超纯水。在37 °C孵育4小时。
    6. 通过分光光度法定量未纯化的sgRNA，用DEPC处理的超纯水稀释至20 ng/µL，并分装后于-80 °C保存。
      注意：无需进行DNase处理，因为残留的DNA不会干扰下游反应。
  4. sgRNA 评估
    1. 使用限制性内切酶消化含有pLX304载体骨架的cDNA/ORF质粒。通过0.8%琼脂糖凝胶分离所得DNA片段。使用凝胶回收试剂盒纯化DNA底物。
    2. 配制5 µL的Cas9切割反应混合液，其中包含0.2 µL的1.22 µM Cas9 S. pyogenes Cas9，0.5 µL 20 ng/µL sgRNA，0.015 pmol DNA底物，0.5 µL 10x Cas9缓冲液，以及DEPC处理的超纯水。37 °C孵育反应1小时。
    3. 使用0.8%琼脂糖凝胶分离切割产物。以未切割的DNA底物作为阴性对照。
    4. 使用数字成像系统观察切割模式，并选择残留未切割底物最少的sgRNA用于后续实验（图2).

2. 更换目的载体的抗生素抗性基因

注意：在本实验方案中，我们以将目的载体 pBID-UASC 中的氨苄青霉素抗性基因替换为氯霉素抗性基因为例，从而构建携带氯霉素抗性的目的载体 pBIDC-UASC。

  1. 从 pBID-UASC 中移除氨苄青霉素抗性基因。
    注意：通过 Cas9 酶切结合两个 sgRNA（f1Ori5-G4（靶序列：5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3'）和 Amp3-G2（靶序列：5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'））去除 pBID-UASC 的氨苄青霉素抗性基因，得到长度为 7,687 bp 的线性 pBID-UASC 载体骨架。这两个 sgRNA 分别靶向氨苄青霉素抗性基因的 5' 上游和 3' 下游区域。
    1. 配制 10 µL 切割反应体系，包含 0.03 pmol pBID-UASC、0.25 µL 1.22 µM S. pyogenes Cas9、20 ng f1Ori5-G4、20 ng Amp3-G2、1 µL 10x Cas9 缓冲液以及 DEPC 处理的超纯水。37 °C 孵育 1 小时。
      注意：Cas9 切割后的质粒无需纯化，可直接用于吉布森组装。
  2. 通过 PCR 扩增氯霉素抗性基因。
    注意：使用引物 f1Ori5-Cam-F（5'-TTACAATTCACTGGCC
    GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3'）和 Amp3-Cam-R（5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
    ​GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3'），从质粒 pMartini-Cam6 中扩增出一段 840 bp 的氯霉素抗性基因。
    1. 通过 PCR 扩增制备氯霉素抗性基因。配制 20 µL PCR 反应体系，包含 2 µL pMartini-Cam（0.1 ng/µL）、1 µL f1Ori5-Cam-F（10 µM）、1 µL Amp3-Cam-R（10 µM）、4 µL 5x 缓冲液、0.4 µL dNTPs（10 mM）、0.4 µL 高保真 DNA 聚合酶（2.5 单位/µL）以及 11.2 µL 超纯水。
    2. 使用以下热循环条件进行 PCR：95 °C 预变性 1 分钟，1 个循环；随后进行 5 个循环：95 °C 变性 15 秒，46 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 20 秒；再进行 30 个循环：95 °C 变性 15 秒，61 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 20 秒；最后 72 °C 延伸 2 分钟，1 个循环。在 PCR 仪中进行反应。
    3. 将酶切产物在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳分离，并使用胶回收试剂盒纯化 840 bp 的 DNA 片段。
  3. 将氯霉素抗性基因插入线性化的 pBID-UASC 载体骨架中，获得 pBIDC-UASC。
    1. 进行 2 µL 吉布森组装反应：加入 0.008 pmol 的 840 bp 氯霉素抗性基因、0.002 pmol 线性化 pBID-UASC（步骤 2.1.1 所得产物）以及 1.0 µL 2x 吉布森组装预混液。50 °C 反应 1 小时。
    2. 取 1 µL 连接反应产物转化 10 µL E. coli 感受态细胞。在添加 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上筛选转化子。
    3. 挑取单克隆菌落进行后续细菌培养及质粒小提。通过限制性酶切分析和 DNA 测序验证携带氯霉素抗性基因的目标载体 pBIDC-UASC。

3. 构建与CRISPRshuttle兼容的载体

注意：CRISPRshuttle 载体包含约 20-40 bp 的质粒骨架序列，位于目标 DNA 片段的 5' 和 3' 两端两侧，其之间含有一个或两个独特的限制性酶切位点。

  1. 使用热循环仪对寡核苷酸进行退火，程序如下：94 °C 预变性 2 分钟；70 个循环，每个循环在 (95-N) °C 下持续 52 秒，其中 N 代表循环编号。
    注意：退火形成的 CRISPRshuttle 窦道含有与 EcoRI 和 XbaI 互补的 5'-突出末端。
  2. 将退火后的 CRISPRshuttle 窦道连接至经 EcoRI/XbaI 消化的目的载体 pBIDC-UASC，构建出兼容 CRISPRshuttle 的目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect。
    注意：该连接反应会消除多克隆位点中的原始 EcoRI 和 XbaI 酶切位点，从而使 CRISPRshuttle 窦道中间的 EcoRI 和 XhoI 位点在最终载体中成为唯一酶切位点。CRISPRshuttle 窦道中的独特限制性酶切位点可用于线性化兼容 CRISPRshuttle 的目的载体。
    1. 配制 5 µL 连接反应体系，包含 14 ng 经 EcoRI/XbaI 消化的 8,451 bp pBIDC-UASC 载体、0.02 pmol 退火后的 CRISPRshuttle 窦道、0.5 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液和 0.3 µL T4 DNA 连接酶。于 16 °C 过夜孵育。
    2. 取 1 µL 连接反应产物转化 10 µL 的 E. coli 感受态细胞。在添加 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上筛选转化子，并于 37 °C 培养过夜。
    3. 挑取单克隆菌落进行后续细菌培养及质粒小提。通过限制性酶切分析和 DNA 测序验证 CRISPRshuttle 兼容目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect。

4. 使用 CRISPRshuttle 生成 UAS-cDNA/ORF 质粒

注意：CRISPRshuttle 实验方案在细菌转化之前，需平行进行两步试管反应（图1）。

  1. 试管反应步骤 1
    1. 使用 Cas9 与两种 sgRNA（pLX304-CMV-G16（靶序列：5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3'，位于 pLX304 载体骨架中 ORF 5'端侧翼区）和 pLX304-3'-G1（靶序列：5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3'，位于 pLX304 载体骨架中 ORF 3'端侧翼区））共同作用，从 pLX304-ORF 质粒中切除 ORF。
      1. 按如下方式配制用于指定数量（N）消化反应的主混合液：(N+1) × 0.4 µL 的 1.22 µM S. pyogenes Cas9，(N+1) × 0.5 µL 的 80 ng/µL pLX304-CMV-G1，(N+1) × 0.5 µL 的 80 ng/µL pLX304-3'-G1，(N+1) × 0.4 µL 的 10× Cas9 缓冲液，以及 (N+1) × 1.45 µL 的 DEPC 处理超纯水。
      2. 充分混匀后离心收集主混合液。每管分装 3.75 µL 主混合液，再向每管加入 0.75 µL 的 0.03 µM pLX304-ORF 质粒。充分混匀后，在 37 °C 下孵育反应 1 小时。
        注：使用 DEPC 处理的超纯水将每种 pLX304-ORF 质粒稀释至 0.03 µM 浓度。若浓度低于 0.03 µM，可直接向反应体系中添加质粒 DNA。Cas9 切割后的质粒无需在切割反应后进行纯化，可直接用于后续的 Gibson 组装。
  2. 试管反应步骤 2
    1. 通过 Gibson 组装将切除的 ORF 插入与 CRISPRshuttle 兼容的目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect 中，获得 UAS-cDNA/ORF 质粒。
      1. 用 EcoRI 和 XbaI 酶切 pBIDC-UASC-pLXvect。通过琼脂糖凝胶电泳分离线性化的 pBIDC-UASC-pLXvect，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。
      2. 按如下方式配制用于指定数量（N）Gibson 组装反应的主混合液：(N+1) × 0.14 µL 的 3.36 µM 线性化 pBIDC-UASC-pLXvect，以及 (N+1) × 1.8 µL 的 Gibson 组装主混合液。
      3. 充分混匀后离心收集主混合液。每管分装 1.94 µL 主混合液，再向每管加入 1.66 µL Cas9 切割后的质粒。充分混匀后，在 50 °C 下孵育反应 1 小时。
        注：在 50 °C 孵育前，应将主混合液和反应管保持在冰上。
  3. 将 Gibson 组装产物转化至 E. coli 中。
    注：Gibson 组装产物在用于 E. coli 转化前无需纯化。
    1. 将感受态细菌细胞在冰上解冻。每支预冷的 1.5 mL 离心管中分装 10 µL 细胞。
      注：建议使用转化效率至少为 1 × 108 CFU/µg pUC19 DNA 的细菌感受态细胞。
    2. 轻柔混匀 10 µL 感受态细胞与 1 µL Gibson 组装产物，置于冰上 30 分钟。
    3. 42 °C 热激 1 分钟，随后立即置于冰上冷却 2 分钟。
    4. 向每管加入 100 µL 预热的 SOC 培养基（37 °C），在 37 °C 下以 250 rpm 振荡培养 1 小时。
    5. 将细胞涂布于含 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上，37 °C 过夜培养。
      注：大规模进行这些操作通常需要数小时。除非另有说明，应始终将试剂和反应体系保持在冰上。
  4. UAS-cDNA/ORF 质粒的验证。
    1. 挑取单克隆接种于含 15 µg/mL 氯霉素的 4.5 mL LB 培养基中，37 °C、250 rpm 振荡过夜培养。
    2. 使用质粒小提试剂盒提取质粒 DNA。
    3. 为每个质粒配制 20 µL 限制性酶切反应体系，包含 300–500 ng 质粒 DNA、0.3 µL PvuII、2 µL 10× 缓冲液及超纯水。在 37 °C 下反应 1 小时。
    4. 通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，在紫外光下成像（图 3）。

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结果

我们利用CRISPRshuttle构建了一个覆盖1,397个在Drosophila中保守的人类基因的UAS-cDNA/ORF质粒文库7。限制性酶切分析显示，CRISPRshuttle在使用含有两个重复序列的CRISPRshuttle兼容性目的载体时效率达到94.5%，在使用不含重复序列的目的载体时效率为96.1%7。我们的数据表明，通常情况下，两名研究人员可在7天内通过CRISPRshuttle构建约300个质粒7。通过诊断性限制性酶切验证了CRISPRshuttle介导的cDNA/ORF片段转移的成功率。酶切反应产生CRISPRshuttle兼容性目的载体（pBIDC-UASC-pLXvect）骨架特异性片段（PvuII酶切产生1,072 bp和1,820 bp片段）的结果被视为阳性（图3）。这些经验证的UAS-cDNA/ORF构建体随后进行了全面的限制性酶切图谱分析，以确认质粒的完整性。限制性酶切分析的代表性结果如...

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讨论

CRISPRshuttle 实验方案中的一个关键步骤是制备线性化的、与 CRISPRshuttle 兼容的载体。为确保完全酶切，应使用过量的限制性内切酶对载体进行消化，并强烈建议对消化后的载体进行凝胶纯化。另一个关键步骤是使用 Cas9 对 cDNA/ORF 质粒进行消化。如果质粒构建失败，可利用琼脂糖凝胶电泳检测是否已有部分 cDNA/ORF 从供体质粒中释放出来。或者，在进行 Gibson 组装前，可通过电泳检测所有质粒的消化情况。只要部分 cDNA/ORF 能够被释放，CRISPRshuttle 通常即可有效发挥作用。如果 cDNA/ORF 几乎无法从供体质粒中释放，则需重新提取质粒。

我们比较了CRISPRshuttle与广泛使用的高通量克隆系统Gateway在构建UAS-cDNA/ORF质粒文库方面的性能，该文库来源于人类CCSB-Broad慢病毒表达文库中已克隆于pLX304载体的ORF。Gateway系统包含两个连续步骤1。首先，通过BP反应构建入门载体，此过程需要针对每个ORF进行定制化操作，包括引物设计与合成、PCR...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（32071135）和南华大学衡阳医学院附属南华医院启动资金的资助。我们感谢张锋教授惠赠pX330质粒，感谢蔡晓辉博士提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂粉ChembaseKBS-001H
琼脂糖SangonA600014-0100
全自动数字凝胶图像分析系统TanonTanon-2500B
氯霉素SangonA100230-0010
E.Z.N.A. 凝胶回收试剂盒OmegaD2500-02
E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 IOmegaD6942-02
EcoRI-HFNEBR3101S
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
HiScribe T7 快速高效RNA合成试剂盒NEBE2050
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621X
PCR扩增仪LongGeneT20
Platinum SuperFi II DNA聚合酶Thermo Scientific12361010
PvuII-HFNEBR3151L
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master MixNEBM0494
S. pyogenes Cas9GenScriptZ03386
摇床培养箱ZhichuZQLY-180V
分光光度计ShimadzuBioSpec-nano
T4 DNA连接酶PromegaM1801
Trans 10 化学感受态细胞TransGenCD101-02
胰蛋白胨OxoidLP0042
XbaINEBR0145S
酵母提取物OxoidLP0021

参考文献

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