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体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

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DOI：

10.3791/68504

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2025年9月12日

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

本文内容

摘要

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in vivo）条件下将生物素共价标记到蛋白质上的方法。该修饰使得在蛋白质相互作用研究中，可根据需要利用链霉亲和素磁珠对目标蛋白质进行特异性富集。

摘要

四膜虫是研究减数分裂过程中程序性基因组重排和转座子消除相关分子机制的重要模式生物。由于所涉及的 分子机器 结构复杂且存在瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用，该过程的许多细节仍不明确。本文介绍一种可实现对目标蛋白邻近区域的蛋白质进行时间分辨生物素标记的方法。由于生物素化是通过注射编码目标蛋白与工程化生物素连接酶融合蛋白的DNA来实现的，该方法可轻松适配不同目标蛋白。融合构建体由内源基因启动子驱动表达，从而实现与天然蛋白相似的阶段特异性表达模式。值得注意的是，共价连接的生物素基团可利用链霉亲和素包被的磁珠实现对标记蛋白的选择性富集。此外，通过 免疫荧光染色，我们证明高效标记需要在培养基中补充生物素。此处展示的即插即用型工程表达载体结合高效的显微注射方法，可快速构建表达修饰蛋白的四膜虫品系。本文所演示的生物素化方法可进一步与质谱分析联用，以鉴定富集蛋白中包含的目标蛋白相互作用分子。邻近生物素化技术有望简化并加速四膜虫中蛋白质-蛋白质相互作用的发现，推动对其基因组编辑机制的理解进程。

引言

纤毛单细胞生物 Paramecium tetraurelia 含有两种不同类型的细胞核：一种是用于长期储存遗传信息的生殖系细胞核，另一种是负责细胞生理功能的体细胞核1。该生物的有性繁殖需要形成新的体细胞基因组。此过程包括从体细胞基因组中不可逆地切除超过45,000个DNA片段2，这些片段包含转座元件3及其他重复序列。尤为显著的是，这些切除事件的精确性可达到单个碱基对水平1。这种精确性在生物学上是必需的，因为被切除的DNA片段会打断蛋白质编码区4，任何错误的切除都可能导致移码突变、提前出现终止密码子或改变蛋白质编码序列。一种复杂的RNA比对机制使细胞能够区分新体细胞基因组中所需的序列。该机制始于整个生殖系基因组的转录5，随后被修剪至25 bp大小6，并被运输到旧的体细胞基因组7，在那里所有互补的RNA被清除8。剩余的、在旧体细胞基因组中缺乏互补序列的小RNA（sRNA）进一步被转运至正在发育的新体细胞基因组，在那里它们与仅存在于生殖系中的序列配对，并指导这些序列的切除9。这一复杂的多步骤过程需要多种细胞组分之间精确且适时的协同作用，特别是小RNA在不同细胞核之间转移时所涉及的短暂而微弱的相互作用10,11。以往为理解该过程的分子机制，曾采用基因敲低实验来判断某些候选组分是否对该过程至关重要，随后通过免疫共沉淀方法揭示关键蛋白之间的相互作用12,13,14。尽管该方法适用于检测那些在免疫沉淀非生理条件下仍能稳定存在的强而持续的结合，但对于弱且短暂的相互作用，其检测可能需要繁琐的优化。鉴于基因编辑过程中涉及的许多相互作用可能具有短暂性，in vivo 方法可能有助于提高此类相互作用的检测效率。此外，某些蛋白质在胞外条件下难以有效溶解15，这一问题可通过 in vivo 基于相互作用的蛋白质修饰技术（如生物素邻近标记）加以解决。

本文介绍一种新方法，可实现对定位于目标蛋白附近的蛋白质进行特异性的体内生物素化标记。这种共价的生物素修饰可通过链霉亲和素介导的下拉方法实现高效富集。该方法的建立基于使用生物素连接酶TurboID16 在四膜虫（Paramecium tetraurelia）中开展蛋白质相互作用研究。本方法可按照方案中所述步骤，便捷地应用于任意目标蛋白。因此，本文提供了一种高效且可扩展的邻近生物素化策略，适用于在重要的原生动物模型生物中进行高通量蛋白质组学研究。

方案

1. 通用方法

  1. 按照表1列出的清单准备缓冲液、试剂及其他材料。
  2. 按照先前所述方法培养单克隆Paramecium品系17。简言之，将一个细胞转移至含有接种细菌的轻度培养基（含0.8 μg/mL β-谷固醇）的新凹玻片孔中，使细胞密度保持在500个细胞/mL以下，以防止减数分裂周期过早启动。在细胞分裂达到50代时，将细胞转移至含细菌的富营养培养基（含0.8 μg/mL β-谷固醇）中培养，直至所有细菌被消耗完毕，从而诱导有性生殖（自体受精）18。
    注意：完成有性生殖周期后，细胞将保持在非分裂的自体受精后状态，直到提供新的营养来源。
  3. 使用含有上游限制性内切酶切割位点的载体，构建目标基因与密码子优化的3x HA turboID序列的融合蛋白。
    1. 以基因组DNA为模板，设计带有编码合适限制性位点突出端的引物，通过PCR扩增目标基因及其启动子区域。
    2. 利用标准限制性酶切方法，将PCR产物插入至turboID编码区上游的同框兼容切割位点19。
  4. 在E.coli DH5α中对构建的质粒DNA进行测序验证并扩增。使用质粒中量提取试剂盒分离质粒，并通过限制性酶切线性化100 μg质粒DNA。
  5. 采用酚-氯仿抽提法纯化DNA，然后通过离心滤膜过滤12。进行乙醇沉淀后，将DNA沉淀溶解于水中，获得浓度为5 mg/mL的溶液。
    注意：可通过以下显微注射步骤将DNA导入Paramecium细胞的体核中。

2. 体细胞核（MAC）显微注射

  1. 从步骤1.2获得的自体受精后培养物中，转移一个细胞至含有0.8 μg/mL β-谷甾醇的细菌化轻培养基的新鲜凹面载玻片中。在注射前于27 °C孵育两天，使细胞恢复。
  2. 使用体视显微镜将恢复后的培养物中的细胞转移至盛有洗涤液的 freshly prepared 凹面载玻片中。
  3. 当细胞处于洗涤液中时，向一块玻璃载片上加入20 μL ddH2O，并覆盖盖玻片。
  4. 在盖玻片上方加入200 μL矿物油。
  5. 随后，将单个洗涤后的细胞以尽可能少的液体体积作为液滴转移至矿物油下方。每张载片上最多放置20个含有单个细胞的液滴，然后将准备好的载片置于显微注射仪的载物台上。
  6. 安装吸取针并将其移至适当位置，然后启动机械臂和注射装置。
  7. 使用微加载移液器吸头，将步骤1.5中制备的DNA溶液2–3 μL加入注射针中。将注射针连接至机械臂并移至工作位置，然后将其连接至注射装置的压力阀。
  8. 使用机械臂将注射针移至载片上的一个空水滴中。按下清洗按钮，以清除注射针中残留的空气，直至观察到DNA溶液流出。
  9. 移动至含有细胞的液滴，降低吸取针，轻轻吸除该液滴中的液体（水），直至细胞被固定不动。
  10. 抬起吸取针，降低注射针，然后切换至更高倍率的物镜。
  11. 确保此时可见体细胞核（MAC）为一个无食物泡的较暗区域（见图1c），注射针需插入该区域。
  12. 应使注射针完全穿透MAC，并在数秒内缓慢回撤针头。
    注意：当针头位于MAC内部时，由于注射装置持续施加的气压，DNA将流入MAC。在MAC边界内可能出现由注入DNA形成的弥散性液泡。
    注意：可对同一细胞进行多次注射，以确保注射成功。
  13. 完成细胞注射后，降低含有步骤2.9中所吸取水的吸取针，反转流体方向，将适量水回注至液滴中，直至细胞重新开始移动。
  14. 重复上述操作，直至所有含细胞的液滴均被处理完毕。
  15. 通过收集载片上的液滴，将每个注射后的细胞分别回收，并转移至含有0.8 μg/mL β-谷甾醇的细菌化轻培养基的独立孔中。
  16. 于27 °C过夜孵育，从每个孔中转移单个细胞至新的孔中，并将原始孔在18 °C保存作为备份。
  17. 将转移后的细胞在27 °C继续培养过夜1天，然后从每个单克隆孔中取出5个细胞放入PCR管中。使用针对构建体特异性的引物进行扩增，以验证细胞中是否存在注入的DNA。

3. 免疫荧光染色验证蛋白质正确定位及生物素连接酶功能

  1. 将筛选出的PCR阳性克隆接种于20 mL含有0.8 μg/mL β-谷甾醇的细菌化培养基中进行培养。
  2. 当培养基浊度降低后，从培养物中取50 μL样品，加入1 μL DAPI溶液（0.1 mg/mL）和1 μL EDTA（0.5 mM）进行DNA染色，以检测自体接合（autogamy）是否启动。
    注意：自体接合通常在细胞密度达到2,000 个细胞/mL时开始。
  3. 若需进行生物素标记，则在收获细胞前至少1小时，在培养基中添加生物素至终浓度为500 μM。
  4. 在适当的发育阶段，使用配备梨形管的油量测定离心机以280 x g 离心2分钟收集细胞。弃去培养基后向管中加入PBS，再次离心并移除PBS。
  5. 将细胞沉淀用PBS重悬，并转移至透明的1.5 mL微量离心管中。
  6. 用PBS将37%的原液稀释配制3.7%的PFA溶液。
  7. 将细胞沉淀重悬于0.5 mL 3.7% PFA中，在室温下置于管式旋转仪上孵育30分钟。
  8. 以600 x g 离心1分钟至可见沉淀形成，弃去PFA溶液至指定的专用废液容器中。
  9. 将沉淀用含50 mM甘氨酸的PBS溶液1 mL重悬，置于管式旋转仪上孵育5–10分钟。
  10. 以600 x g 离心1分钟，移去上清液后加入0.8 mL 1× PBS。可选：再用PBS洗涤一次。
    注意：如有需要，此时可将细胞置于4 °C保存。
  11. 以600 x g 离心1分钟，弃去PBS，加入500 μL含0.5% Triton X-100的PBS溶液，置于管式旋转仪上孵育20分钟。
  12. 离心至沉淀可见（1,000 x g，2分钟），弃去Triton X-100溶液，用PBS重悬细胞。
  13. 根据所需抗体体积，用PBS配制5% BSA溶液。
  14. 移除细胞的PBS洗涤液，加入100 µL用5% BSA/PBS稀释的一抗溶液，根据所用抗体调整孵育时间。
    注意：大多数抗体在室温下孵育2小时已足够。
  15. 以600 x g 离心，弃去一抗稀释液，用500 μL PBS洗涤细胞。
  16. 加入100 μL用5% BSA/PBS稀释的二抗溶液，调整孵育时间；通常在室温下孵育1小时即可。用铝箔包裹管子以避免荧光染料暴露于光照下。
  17. 在二抗孵育的最后10分钟加入1 μL DAPI溶液（0.1 mg/mL）。
  18. 以600 x g 离心1分钟，弃去染色液，用PBS洗涤两次。第二次洗涤后保留20 μL液体于管中，重悬细胞。
  19. 取10 μL样品滴加于载玻片上，用于显微镜观察。

4. 生物素化蛋白的选择性富集

  1. 按照 3.4 节所述，收集处于正确发育阶段的 1 × 106 个细胞。
  2. 将细胞沉淀重悬于 3 mL 裂解缓冲液中。
  3. 转移至 Dounce 匀浆器中，使用研杵进行 100 次研磨以裂解细胞。
  4. 将裂解液转移至两个微量离心管中，在 4 °C 条件下以 21,000 x g 离心 10 分钟。
  5. 通过将 20 µL（每样本）经脉冲涡旋重悬的链霉亲和素包被磁珠悬液与 1 mL 裂解缓冲液在微量离心管中混合，并孵育 2 分钟，对磁珠进行平衡。
  6. 使用磁力架去除磁珠中的裂解缓冲液，并用裂解缓冲液重新悬浮磁珠。
  7. 重复步骤 4.6。
  8. 去除裂解缓冲液，将已平衡的磁珠与步骤 4.4 所得上清液（澄清裂解液）混合。
    注意：磁珠结合所需的最适盐浓度和去垢剂百分比可能有所不同，需通过实验验证。此外，可将步骤 4.4 中的沉淀物在 50 μL 的 2% SDS 溶液中于 60 °C 孵育 10 分钟，以提取不溶性组分中的蛋白质，随后在 21,000 x g 离心 10 分钟。将此提取液加入澄清裂解液和磁珠中。
  9. 在室温下于旋转仪上孵育 1–2 小时。
  10. 短暂离心（<1 秒）以使所有液体沉降至管底，将磁珠置于磁力架上收集，然后用洗涤缓冲液 1 替换上清液（穿流液）。
  11. 在旋转仪上孵育 5 分钟，然后重复步骤 4.10 进行第二次洗涤。
  12. 用洗涤缓冲液 2 替换洗涤缓冲液 1，再进行两次额外洗涤（洗涤 3 和 4）。
  13. 用洗涤缓冲液 3 替换洗涤缓冲液 2，进行最后两次洗涤（洗涤 5 和 6）。
  14. 去除最后一次洗涤液后，将磁珠在 -20 °C 保存，以备后续处理。
    注意：磁珠可用 Laemmli 缓冲液洗脱，用于 Western 印迹分析，或直接用于质谱服务中的磁珠上肽段制备，以进行蛋白质鉴定。

结果

本方案描述了一种简化的方法，用于在Paramecium中对目标蛋白邻近的蛋白质引入共价生物素修饰（图1A）。这些生物素标记的蛋白质随后可通过链霉亲和素下拉法进行富集，并利用质谱技术进行鉴定20。为展示该方法的实际应用，我们将本方案应用于Nowa1蛋白。该蛋白在基因组重排过程中至关重要，且其定位具有动态变化特征12。在发育早期，Nowa1蛋白保留在旧的体细胞核中并发生片段化，随后则定位于新形成的发育核中。值得注意的是，我们此前尝试通过标签介导的方法富集Nowa1相互作用蛋白未能成功（未发表结果），这可能是由于Nowa1蛋白含有与朊病毒蛋白PrP27相似的复杂重复序列，在下拉过程中非最优条件下易发生自聚集所致21。我们通过PCR扩增了Nowa1的编码区及其上游包含启动子的非编码区，并将产物与密码子优化的turboID编码序列进行同框连接（图1B）。为避免将环状DNA注入Paramecium时引发转基因沉默，我们在注射前将载体线性化。将纯化的线性化DNA按本方案所述显微注射至体细胞核（MAC）中。在部分成功注射的细胞中，可在体细胞核较暗区域内的局限性液滴中观察到明显信号（图1C）。随后通过PCR验证了DNA的成功注射以及细胞分裂过程中对该DNA的扩增。如预期所示，40–50%的细胞对Nowa1构建体的注射DNA呈阳性（预期产物大小为685 bp）（图2）。下一步是验证注射DNA所编码蛋白的存在。由于受体载体中turboID序列两侧带有三重HA标签，我们采用免疫荧光染色检测该标签，从而确认注射细胞是否表达融合蛋白及其定位是否正确。我们选取了发育晚期的细胞，观察到融合蛋白定位于两个新形成的发育核中，这与野生型Nowa1蛋白此前的定位一致12。各个独立的注射细胞系中融合蛋白表达水平有所不同（图3）。较低的表达水平在需要降低背景信号的应用中可能具有优势，但本实验中我们选择信号最强的克隆2继续后续实验。随后，我们在不同发育阶段收集样品，以追踪融合蛋白的定位变化。在自体受精早期，该蛋白最初定位于由旧体细胞核形成的丝状结构及分离的核片段中；随着核原基的出现，融合蛋白逐渐转移至这些新发育的细胞核中（图4）。为促进不同发育阶段邻近蛋白质组的生物素标记，我们在收获细胞进行免疫荧光（IF）检测前，向培养物中添加500 μM生物素并孵育2小时。我们使用荧光标记的链霉亲和素通过IF染色可视化生物素标记的蛋白质。所观察到的信号与HA标签融合蛋白的定位一致。重要的是，即使短时间孵育生物素即可实现显著的生物素化，从而获得特异性对应于不同核发育阶段的生物素化定位模式（图4）。此外，在未添加外源生物素的情况下，注射细胞中仅能检测到可忽略水平的生物素化；而在野生型细胞中，添加外源生物素后亦未检测到明显的生物素化信号（图5A）。值得注意的是，生物素并非单纯在发育核中积累，即使在变性条件下，其仍共价结合于蛋白质上（图5B）。利用链霉亲和素包被的磁珠，可选择性富集生物素化的蛋白质（图6）。富集后的蛋白质可通过质谱进行鉴定。在后续的蛋白质鉴定实验中，未添加生物素的培养物以及表达非融合型turboID蛋白的细胞可作为背景对照组。

TurboID 融合蛋白过程；载体构建示意图；显微镜下注射胚胎图像。
图 1：P. tetraurelia 中邻近生物素标记实验流程概览。(A) 实验方案的总体流程图。(B) 即插即用型 TurboID 受体载体的克隆原理及 Nowa1 融合蛋白的最终构建体。本质粒中使用的 3'UTR 区域来源于 CenH3a。(C) 成功注射 DNA 后，在对应于体核（MAC）的较暗区域内部可见弥散状液滴。请点击此处查看该图的放大版本。

PCR 琼脂糖凝胶电泳结果；DNA 分离，克隆验证分析，分子量标记。
图 2：注射成功与否的 PCR 检测。 使用特异性针对氨苄青霉素抗性基因上游区域（amp 起始位点）的正向引物和与 Nowa1 互补的反向引物进行 PCR 反应的琼脂糖凝胶分析。箭头指示预期的扩增产物大小。 请点击此处查看该图的放大版本。

HA标签表达的DNA成像；荧光显微镜结果；克隆比较研究。
图3：免疫荧光染色验证turboID融合蛋白的正确定位。 对单克隆四膜虫品系进行免疫荧光染色，这些品系经PCR检测证实含有编码Nowa1-HA-turboID融合蛋白的DNA。使用兔抗HA一抗（1:100）和山羊抗兔Alexa Fluor 568标记的二抗（1:1000）。比例尺为20 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分裂阶段示意图：DNA、HA标签、生物素可视化；荧光显微镜观察。
图 4：Nowa1在不同发育阶段的特异性生物素标记。 在新体细胞核形成过程中各进展阶段，对单克隆细胞系2进行免疫荧光染色。培养基中添加500 μM生物素以确保turboID的最佳活性。HA标签的检测方法同图 3，生物素则使用Streptavidin-FITC（1:200）进行检测。比例尺：20 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞中生物素标记的印迹；显微镜观察与蛋白质分析；DNA、HA标签、生物素信号。
图 5：turboID介导的高效邻近标记依赖于培养体系中补充生物素。 （A）发育晚期野生型及显微注射细胞的免疫荧光染色，显示Nowa1-HA-turboID的表达以及在补充500 μM生物素条件下的生物素化信号。HA标签与生物素的检测方法同图 4。比例尺：20 μm。（B）利用HRP-链霉亲和素对培养于含500 μM生物素的培养基中的野生型细胞，以及注射turboID后有或无补充生物素的细胞进行生物素的Western blot分析。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质纯化结果；电泳图显示在不同洗涤阶段出现的条带（kDa 标记物）
图 6：利用链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白质。 使用包被链霉亲和素的磁珠进行下拉实验后，对各组分进行生物素的 Western 印迹分析。样品包括：Nowa1-HA-turboID 细胞裂解液（上样输入）、未结合组分（流穿组）、洗涤步骤（洗涤 1–6）、以及结合到磁珠上的蛋白质（输出组）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案介绍了一种将生物素基团标记至目标蛋白邻近蛋白质的技术。基于链霉亲和素对生物素的强亲和力，可实现对修饰蛋白的快速高效富集。结合该方法对不同目标蛋白的快速适应性，本技术可简化多蛋白相互作用的研究 草履虫该模式生物已广泛用于减数分裂过程中转座子与宿主相互作用的研究。3此外，由于其在程序性基因组重排过程中能够切除超过45,000个序列，因此可为精确基因组编辑提供新型分子工具。该过程由一种复杂的多组分机制调控，能够通过RNA引导，精确地在每一代中以可重复的切割位点切除这些DNA片段。本文所述方法在研究该过程时具有两大优势：它简化了瞬时蛋白质-蛋白质相互作用的发现；此外，即插即用型受体载体可实现多种功能性融合蛋白的快速构建。. 由于多个因素可能在不同阶段参与该过程，这种适应性使得能够揭示许多可能属于切除机制组成部分的蛋白质相互作用组。重要的是，融合构建体由内源基因的启动子驱动表达，因此其表达时间进程与天然状态高度一致。此外，已证明通过显微注射将外源遗传物质递送至该模式生物的方法，可获得均一的单克隆群体。此类群体能够实现自体受精过程更为同步的启动，在此过程中将形成新的体细胞核。

尽管引入turboID融合构建体的演示实验流程具有较高的稳健性，但由于生物素化机制的特点，下游的蛋白质富集步骤可能需要进行特定优化。由于融合的turboID酶会产生可扩散的活性生物素-AMP中间体，这些中间体可能与邻近区域内的任何亲核基团发生反应。因此，该方法中的一个关键步骤是从背景信号以及来自turboID融合蛋白周围局部区域但并非真实互作伙伴的蛋白质中，准确鉴定出真正的相互作用蛋白。为实现这一目标，可调整多种实验参数，例如与生物素孵育的时间长度16。此外，设置不添加外源生物素的对照组有助于评估背景结合水平。如前所述，此类对照组在遗传背景上与实验组完全相同，但由于培养基中生物素含量极低，turboID介导的生物素化反应被显著抑制。其他重要的对照组还可包括表达非融合形式turboID蛋白的细胞，以及野生型细胞组，二者均在添加了生物素的培养基中培养。另外，尽管链霉亲和素对生物素的高亲和力相较于抗体介导的pull-down具有显著优势，但不同的盐浓度和去垢剂浓度仍可能影响富集过程的纯度和效率。

更先进的蛋白质组学方法有望加深我们对Paramecium（草履虫）以及其他纤毛虫独特分子机制的理解。具有新颖功能的分子组分有望被重新开发为合成生物学中的工具，从而推动生物技术的发展22,23。经过工程化设计的合成蛋白质通常由具备新特性的功能结构域组合而成，可实现以往难以达成的治疗应用。工程化蛋白质也可用于药物生产过程24。其中，来自Paramecium的RNA导向基因组切除系统在这些发展中尤为引人关注。该系统能够以单核苷酸精度实现数千个DNA片段的RNA依赖性切除25。 此类特性使其在提高人类细胞基因组编辑准确性方面具有重要应用潜力。本文所介绍的邻近生物素标记方法可用于加速发现多蛋白分子机器中的新蛋白质组分及其相互作用。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由伯尔尼大学DigiK资助项目以及授予B.-A.S.的瑞士国家科学基金会资助项目229074和授予M.N.的瑞士国家科学基金会资助项目214853资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜 Axiovert 40 CFL（10x，40x 镜头）Zeissna
β-谷甾醇Sigma Aldrich567152
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA9647
CellTram OilEpendorfna
密码子优化的 3xHA-turboID DNA 序列Twist biosciencenaGCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC
TTGGTGAAACTTTAGGTATGTCA
AGAGCTGCTATTAATAAACACATT
CAAACTTTAAGAGATTGGGGTGT
TGATGTTTTTACTGTCCCTGGTAA
AGGATATTCACTTCCTGAACCCAT
TCCTTTATTAAATGCTAAACAAAT
TTTAGGTCAATTAGATGGAGGTT
CTGTTGCTGTTTTACCTGTTGTT
GACTCAACTAATCAATATTTATTAG
ATAGAATTGGTGAATTAAAGTCAG
GTGATGCTTGTATTGCTGAATACC
AACAAGCTGGTAGAGGTTCAAGA
GGTAGAAAATGGTTTTCTCCTTTT
GGTGCTAATTTATACCTTTCCATGT
TCTGGAGACTTAAAAGAGGTCCCG
CAGCTATTGGATTAGGTCCTGTCAT
TGGTATTGTTATGGCTGAAGCTCT
TAGAAAATTAGGTGCTGATAAGGT
TAGAGTTAAATGGCCTAATGATTTA
TATCTTCAAGATAGAAAACTTGCT
GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
ATTACTGGTGATGCCGCTCAAATT
GTTATCGGTGCTGGTATTAATGTTG
CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
TTGTTAATCAAGGTTGGATTACTCT
TCAAGAAGCTGGTATAAATCTTGAT
AGAAACACTTTAGCTGCTACTCTCA
TTAGAGAACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTATCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPISigma AldrichD9542
EDTAFischer ScientificAAA151610B
epT.I.P.S. 微量移液器吸头Ependorf5242956003
乙醇Grogg Chemie1009832500
FemtoJet 4iEpendorfna
Femtotip IICalibre Scientific5242957000
甲醛溶液Sigma AldrichF8775
甘氨酸AppliChem10021259
山羊抗兔 IgG 抗体，Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
HA 标签（C29F4）兔单克隆抗体cell systems3724
InjectMan NI 2Ependorfna
轻培养基nana2.5 mM Na2HPO4 中的 0.2x 小麦草粉溶液
矿物油Sigma AldrichM8691
Na2HPO4Sigma Aldrich71643
苯酚-氯仿-异戊醇Sigma Aldrich77617
磷酸盐缓冲液 Fischer Scientific10722497
质粒大提中量试剂盒Qiagene12945
富培养基nana2.5 mM Na2HPO4 中的 1x 小麦草粉溶液
链霉亲和素-FITCThermo Fisher Scientific11-4317-87
Ultrafree-MC GV 离心滤器 EMD MiliporeUFC30GV00
洗涤液nana含 0.1% BSA 的 Volvic 水 
小麦草粉溶液Pines internationalna按先前所述方法配制 20x 储存液（0.5 g/10 mL）
链霉亲和素-HRPabcamab7403
链霉亲和素包被磁珠Sigma AldrichLSKMAGT02
下拉实验用裂解缓冲液nana50 mM Tris pH 8；150 mM NaCl；0.5% 脱氧胆酸钠；1% Triton X-100；5 mM MgCl2；2x cOmplete 蛋白酶抑制剂（Roche）； 
下拉实验用洗涤缓冲液 1nana50 mM Tris pH 8；150 mM NaCl；0.5% 脱氧胆酸钠；1% Triton X-100；5 mM MgCl2；
下拉实验用洗涤缓冲液 2nana10 mM Tris pH 7.4；150 mM NaCl；0.01% NP40；1 mM MgCl2
下拉实验用洗涤缓冲液 3nana10 mM Tris pH 7.4；150 mM NaCl；

参考文献

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体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究
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