使用靶标富集工作流程从临床样本中生成全细菌基因组

摘要

在这里，我们提出了一种协议，可以使用靶标富集对临床样本中的细菌性传播感染进行全基因组测序。这种基于综合征面板的新型方法克服了丰富的人类 DNA 和低细菌载量的挑战，促进了 沙眼衣原体、 淋病奈瑟菌、 梅毒螺旋体和 生殖支原体的基因组监测。

摘要

由于存在人类 DNA、微生物群和非常低的细菌病原体载量，直接从临床样本中获取细菌性传播感染 （STI） 的完整基因组具有挑战性。培养通常不是一种选择，因为这些物种很挑剔，而且大多数样品都是在裂解微生物的运输介质中采集的，使它们无法进行培养。为了解决这些问题，我们使用跨四个物种设计的探针组合来生成细菌性传播感染的全基因组序列，并进行了靶标富集，这是基因组测序前两到三天的杂交程序。我们的初步结果使用直接测序不成功的样本产生了出色的基因组数据。事实证明，靶标富集对于细菌性传播感染基因组测序非常有效，特别是当病原体载量较高时（Ct < 30）。含有 生殖支原体 的测试样本的 Ct 值经常高于 30，导致基因组恢复成功率较低;将杂交温度从65°C优化到62.5°C后，观察到了改善。 除了实现基因组监测外，完整基因组的可用性还可以为抗菌素耐药性提供有价值的见解，例如识别与 淋病奈瑟菌相关的获得性耐药性决定因素。这种方法已经在布宜诺斯艾利斯鉴定了沙 眼衣原体 性病淋巴肉芽肿的新谱系， 即 ompA 基因型 L4，凸显了这种方法在发现新的基因组多样性和改善性传播感染监测方面的潜力。

引言

下一代测序 （NGS） 技术的出现促进了细菌全基因组测序 （WGS），允许对许多人类细菌病原体中的临床分离株进行测序。该技术通过以前所未有的规模生成完整的基因组，实现了大量比较研究。这对临床和公共卫生微生物学产生了重大影响，因为通过 WGS 访问临床样本的基因组数据可以对抗菌素耐药基因进行分型和检测。此外，宏基因组方法允许从临床样本中直接检测与疾病相关的病原体。这些信息为患者提供个性化治疗策略创造了新的机会。此外，WGS是一个强大的工具，可以深入了解特定病原体的循环毒株的演变及其传播模式，使公共卫生当局能够更好地了解和应对病原体爆发^1,2,3。

为了获得足够的WGS测序质量，通常需要通过培养分离细菌以获得所需的微生物DNA量^4,5,6。对于那些难以培养的生物体、由于诊断样本处理不可行而无法培养的生物体或在患者治疗期间接触抗生素的生物体来说，这是一个限制因素。这种难以培养的微生物的例子包括性传播细菌病原体，如沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和生殖支原体 ^7,8,9。由于多种因素，包括细胞内性质、脆弱性、挑剔的生长要求和缓慢的复制速度，这些物种的培养具有挑战性。由于这些原因，开发和实施在 DNA 含量低的情况下实现 WGS 的技术（就像患者样本中经常出现的情况一样）对于在临床环境中进行基因组分析至关重要。

当微生物 DNA 稀缺时，靶标富集是最有前途的基因组测序方法¹⁰。例如，在引起性传播感染 （STI） 的病原体中，患者样本中存在的 DNA 中只有一小部分来自病原体。在沙眼衣原体感染的情况下，已发现病原体 DNA 最多占总 DNA 的 0.6%，但值通常要低得多¹¹。靶标富集方法包括在NGS之前选择性地捕获感兴趣的微生物DNA。这是使用专门设计的生物素标记的 RNA 探针实现的，这些探针与目标微生物 DNA 互补。在杂交之前进行接头连接以生成基因组文库，在此期间这些探针与互补微生物DNA结合。随后，利用生物素-链霉亲和素的强相互作用，使用链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素标记的核酸复合物。最后，聚合酶链反应 （PCR） 扩增选定的 DNA 片段。这些关键的概念步骤对于理解目标富集策略是必要的。然而，完整的协议^10,12还涉及其他程序步骤，例如洗涤和质量控制。

在启动测序方案之前，评估输入 DNA 的数量并确保整个工作流程中的条件保持其完整性非常重要。根据制造商的建议，标准方案需要 10-200 ng 的 DNA，体积为 7 μL，对应于大约 1.4 至 28.6 ng/μL 的浓度范围。当DNA浓度较低时，建议使用17μL的方案的修改版本，允许浓度在0.6至11.8ng / μL之间，同时保持所需的输入量¹²。鉴于通常从临床标本中获得的低浓度，我们常规实施 17 μL 方案变体。杂交和测序性能与 DNA 质量相关，强调了适当的样本储存和运输条件对于保持核酸完整性的重要性。因此，适当的处理实践，如稳定收集培养基、快速处理、维持冷链条件和尽减少冻融循环是优化 DNA 质量的重要措施。除了所需的 DNA 浓度外，DNA 片段长度也是完整性的指标。我们建议尽量减少样品处理和储存过程中的 DNA 降解，以获得更长的片段并优化测序结果。这在临床环境中尤为重要，因为在临床环境中，收集方法、培养基和处理的差异很常见。我们成功地将该方案应用于从2-SP培养基和NAAT转运培养基中提取的DNA，平均片段长度低至1kb，如代表性结果中所述。最后，成功的测序被定义为实现超过 95% 的基因组覆盖率，平均读取深度超过 10x¹⁰。

迄今为止，靶点富集已被各个研究小组成功应用于广泛的微生物和病毒，包括引起性传播感染的病原体、诺如病毒、牲畜病毒和植物病原体 10,13,14,15,16。然而，到目前为止，探针设计通常仅限于单一病原体，而不是针对多种综合征相关病原体的完整基因组的面板。理想的靶标是具有小而保守的基因组的生物体，其中确实包括沙眼衣原体、梅毒锥虫和生殖支原体。虽然淋病奈瑟菌具有更多样化的基因组和更大的泛基因组，但覆盖它的探针仍然可以在与其他三种细菌的设计中合理化。这些细菌的 %G+C 存在一些差异，而其他细菌可能与综合征有关，这意味着条件可能需要优化。

该协议的目标是直接从临床样本中获得完整的基因组，以实现系统发育和流行病学分析。我们展示了一种新颖有效的策略，使用针对沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和生殖支原体量身定制的探针组合，使用从泌尿生殖和肛门直肠拭子等临床样本中提取的DNA来恢复完整的基因组。这种方法已被证明是成功的，并被应用于布宜诺斯艾利斯性病淋巴肉芽肿 （LGV） 爆发的表征，从而能够描述沙眼衣原体 LGV^10,13 的新谱系。

将描述目标富集程序，包括使用市售的 DNA 捕获方法和捕获后池进行下一代测序 （NGS），用于直接从诊断患有 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体 和/或 生殖支原体 的患者的临床样本中获取完整基因组感染。为了获得最佳成功，建议选择 Ct 值低于 30 的样本，因为较高的 Ct 值反映了较低的病原体载量，并且不太可能产生完整的基因组。该方法的DNA提取物可以从各种样品类型和收集介质的临床样品中获得。DNA 提取程序可以手动或使用自动化系统执行，使用设计用于从人拭子样本中分离病原体或病毒 DNA 的试剂盒（参见 材料表）。

靶标富集程序中使用的探针组（参见 材料表）专门设计用于捕获 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体 和 生殖支原体的基因组多样性。使用每个物种的多个完整基因组生成定制探针，优化其已知泛基因组的覆盖率¹⁰。设计标准包括与参考序列的最小序列同源性为90%，平铺频率为1x-2x，以提高目标捕获效率。为了优化成本效益，探针设计中使用的算法最大限度地减少了探针的数量，同时保持了全面的基因组表示。最终探针组由 242,000 个探针组成，用于针对 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、生殖支原体和 梅毒螺旋体的多重设计。整个靶标富集方案可在 2 或 3 天内完成。为两天和三天的工作流程选项提供了明确的停止点指示。

道德声明
本研究提出了基于先前发表的方案^10,13 的方法学改进。所描述的程序仅涉及去识别化的样本，不包括患者数据;因此，方法学方面不需要具体的伦理批准。代表性结果是从两组先前研究的样本中获得的：根据批准的协议收集的阿根廷样本 Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa： prevalencia y tipificación（Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires，批准号 201723），并获得所有参与者的书面知情同意书;以及匿名的芬兰样本，不需要特定的伦理批准。在数据库提交任何生成的测序数据之前，需要删除人类读数。

方案

注意：工作空间应分为PCR前区（无扩增子工作区）和PCR后区（扩增子处理工作区），以防止污染。除非另有明确说明，否则所有步骤都必须在两个受控工作区之一中执行。所有预混液和 PCR 反应混合物都应在无扩增子工作区中制备，而所有涉及扩增 DNA 的后续步骤都应在扩增子处理工作区中进行。该协议中的所有量都计算为处理八个样品。

1. DNA片段化

1. 使用灵敏、准确、基于荧光的方法（双链DNA [dsDNA]测定，使用1μL样品，检测范围高达120ng / μL;参见 材料表）测量含有靶病原体DNA（DNA）的临床样品中DNA提取物的DNA浓度。每当测量 DNA 浓度时，在整个方案中始终如一地使用这种定量方法。
2. 使用无核酸酶水将每个 DNA 样品稀释至 10 - 200 ng 的浓度，确保每个 PCR 管条的最终体积为 17 μL。为了获得最佳测序结果，请在推荐范围内使用尽可能多的输入 DNA。
   注意：如果总 DNA 浓度低于 17 μL 中推荐的最低 10 ng 的最小值，则可以按照制造商的建议使用补充背景 DNA（例如，人类基因组 DNA）来满足输入要求。这有助于稳定文库制备反应并提高低输入临床样本的测序性能。
3. 解冻碎裂缓冲液 （5x），涡旋，然后放在冰上。
4. 根据 表 1 对热循环仪进行编程。启动程序并立即暂停。
   注意：37°C孵育步骤的持续时间可能因初始DNA片段大小和所需的NGS读取长度而异。对于高质量的DNA样品，建议孵育时间为15 min，以获得适合2 100x读数的150至200 bp的片段，10 min以获得2 150x读数的180至250 bp的片段。
5. 从 -20°C 储存中取出碎裂预混液所需的小瓶。根据 表2制备预混液。高速密封管子和涡流 5-10 秒。短暂旋转以去除气泡并将预混液保持在冰上。
6. 向每个含有 17 μL 起始 DNA 的孔中加入 3 μL 片段化预混液。上下移液20次混合，密封PCR管条，高速涡旋5-10秒，短暂旋转。
7. 将PCR管条放入热循环仪中（参见 材料表），并在步骤1开始时恢复 表1所示的程序。
8. 一旦达到 4 °C 保持步骤，从热循环仪中取出 PCR 管条并加入 30 μL 无核酸酶水。将PCR试管条放在冰上。

表 1：酶碎裂的热循环仪程序。 请按此下载此表。

表 2：碎裂预混液的制备请 点击此处下载此表。

2. 文库制备

1. 连接预混液的制备
   注意：此时应制备连接预混液，因为它需要 30-45 分钟才能平衡到室温。
   1. 从 -20°C 储存中取出连接缓冲液并在冰上解冻。从 -20°C 储存中取出 T4 DNA 连接酶，通过倒置小瓶进行混合，并保持在冰上。
   2. 根据 表3制备连接预混液。将管子和涡旋高速密封10-20秒，短暂旋转，并在室温下保持30-45分钟后使用。
2. 末端修复和 dA 尾碎片
   1. 根据 表 4 对热循环仪进行编程。
   2. 从-20°C储存中取出末端修复拖尾缓冲液，并在冰上解冻。解冻后，高速涡旋，短暂旋转。取回末端修复-A拖尾酶混合物，倒置小瓶混合，保持在冰上。
   3. 根据 表5 制备末端修复/dA-拖尾预混液（参见 材料表）。通过高速牢固地密封管和涡旋来混合 10-20 秒，短暂旋转，并保持在冰上。
   4. 将 20 μL 末端修复/dA 拖尾预混液移液到每个含有 50 μL DNA 片段的孔中（来自步骤 1.1-1.8）。密封PCR管条，高速涡旋5-10秒充分混合。短暂旋转 PCR 管条并将其放入热循环仪中。恢复 表4的程序。
3. MBC 标记接头的连接
   1. 表 4 中的程序完成最后一步后，将 PCR 管条放在冰上。根据 表6中的参数设置热循环仪。启动程序并立即暂停。
   2. 向步骤 2.1 中制备的每个样品中加入 25 μL 室温连接预混液。密封PCR管条，涡旋5-10秒，然后短暂旋转。
   3. 从-20°C储存中取出MBC标记文库的接头寡核苷酸混合物（参见 材料表），并在冰上解冻。解冻后，高速涡旋5-10秒。短暂旋转并保持在冰上。
   4. 向每个样品中加入 5 μL 用于 MBC 标记文库的接头寡核苷酸混合物。密封PCR管条并高速涡旋5-10秒，短暂旋转。立即将PCR管条放入热循环仪中，并继续按照 表6中的规定运行程序。
4. 结扎清理
   1. 使用磁珠进行 DNA 纯化。从4°C储存中取出珠子，并在使用前让它们达到室温。
   2. 使用无核酸酶水制备 4 mL 70% 乙醇。保持在室温下。
      注意：强烈建议新鲜制备 70% 乙醇溶液以用于清理步骤，以确保最佳性能。对于 70% 乙醇制备，请在使用前立即使用无核酸酶水。
   3. 彻底涡旋磁珠悬浮液，直到混合物均匀，颜色一致。
   4. 当 表6 中的程序达到4°C保持步骤时，将PCR管条从热循环仪转移到室温。向每个孔中加入 80 μL 珠子悬浮液。密封PCR管条并涡旋5-10秒，短暂旋转。
   5. 在室温下将珠子悬浮液孵育5分钟。将PCR管条转移到磁性支架上（参见 材料表）并等待5-10分钟，直到溶液变清。
   6. 将 PCR 管条保持在磁性支架中的同时，小心地从每个孔中取出并丢弃清除的溶液，避免与磁珠接触。
   7. 将 PCR 试管条放在磁性支架中，按以下方式用 70% 乙醇进行两次洗涤：向每个样品中加入 200 μL 70% 乙醇。等待 1 分钟并除去 70% 乙醇。取出溶液时避免接触珠子。
   8. 第二次洗涤后，密封PCR管条并短暂旋转样品以收集残留乙醇。将 PCR 试管条放入磁性支架中 30 秒。
   9. 取出收集的乙醇，同时避免接触珠子。要去除残留的乙醇，请从磁性支架上取下 PCR 管条并保持未密封（最好在罩内）长达 5 分钟。确保珠子完全干燥但外观没有开裂;这会降低洗脱过程的效率。
   10. 通过向每个样品孔中加入 35 μL 无核酸酶水来洗脱 DNA。上下移液10x-15x彻底混合，密封试管，涡旋5-10秒。确认没有可见的团块。如果有，则涡旋直至溶解。
   11. 将样品在室温下孵育5分钟。将 PCR 管条放入磁性支架中，等待约 5 分钟，直到溶液清除。
   12. 小心地从每个孔中取出清除的上清液 （~34 μL），并在新鲜的 PCR 管条中转移到相应的孔中。将样品放在冰上并丢弃珠子。
       注意：对于为期 3 天的协议，这标志着第 1 天的结束。将样品在4°C下储存过夜。
5. 放大和双指数
   注意：为每个样品选择合适的索引引物对，以确保在测序过程中正确鉴定。每个索引序列由一个 8 bp 标签组成，该标签掺入用于扩增预捕获文库的引物中。
   1. 从 -20 °C 储存中取出含有 dNTP （5x） 的高保真 DNA 聚合酶缓冲液，并在冰上解冻。从-20°C储存中取出选定的索引测序引物并保存在冰上。
      注意：确保记录分配给每个样品的特定条形码，以便在整个测序过程中准确识别和可追溯性。
   2. 根据 表 7 对热循环仪进行编程。启动程序并立即暂停。
      注意：制造商建议根据输入 DNA 的质量和数量执行 8 至 14 个预捕获 PCR 循环。在该协议中，按照制造商的建议实施了 11 个周期，从而产生了高质量的测序数据^10,12。
   3. 从-20°C储存中检索用于PCR扩增的高保真融合酶。上下移液酶进行混合，同时避免过度搅拌，并涡旋高保真 DNA 聚合酶缓冲液以确保均匀性。制备捕获前的PCR反应混合物（如 表8所述）。涡旋最终混音并短暂旋转，保持在冰上。
   4. 将 11 μL 捕获前 PCR 反应混合物（如 表 8 所述制备）分配到每个含有纯化 DNA 文库的样品孔中。向每个反应中加入 5 μL 选定的索引引物对。将PCR管条密封并涡旋5秒，然后快速旋转。
   5. 按照 表 7 的规定恢复热循环仪程序。一旦温度达到 98 °C，将 PCR 管条放入热循环仪中并牢固地盖上盖子。
6. 清理图书馆
   1. 使用前让磁珠平衡至室温至少 30 分钟。使用无核酸酶水制备 4 mL 70% 乙醇。保持在室温下。
   2. 彻底涡旋磁珠悬浮液，直到混合物均匀，颜色一致。
   3. 当 表7 中的程序达到4°C保持步骤时，将PCR管条从热循环仪转移到室温。向每个样品中加入 50 μL 珠子悬浮液。密封PCR管条并涡旋5-10秒，短暂旋转（不要沉淀磁珠）。
   4. 在室温下将珠子悬浮液孵育5分钟。将 PCR 管条转移到磁性支架上并等待 5-10 分钟，直到溶液变清。
   5. 将 PCR 管条保持在磁性支架中的同时，小心地从每个孔中取出并丢弃透明溶液。取出溶液时避免接触珠子。
   6. 将 PCR 试管条放在磁性支架中，按以下方式用 70% 乙醇进行两次洗涤。向每个样品中加入 200 μL 70% 乙醇。等待 1 分钟并除去 70% 乙醇。取出溶液时避免接触珠子。
   7. 第二次洗涤后，密封PCR管条并短暂旋转以收集残留的乙醇。将 PCR 试管条放入磁性支架中 30 秒。去除残留的乙醇，同时避免接触珠子。
   8. 要去除残留的乙醇，请从磁性支架上取下 PCR 管条并保持未密封（最好在罩内）长达 5 分钟。确保珠子完全干燥但外观上没有破裂，因为这会降低洗脱过程的效率。
   9. 通过向每个样品管中加入 15 μL 无核酸酶水来洗脱文库 DNA。上下移液10x-15x彻底混合，密封PCR管条，涡旋5-10秒。确认没有可见的团块。如果有，则涡旋直至溶解。
   10. 将样品在室温下孵育5分钟。将 PCR 管条放入磁性支架中，等待约 5 分钟，直到溶液清除。
   11. 小心地从每个孔中取出清除的上清液 （~15 μL），并在新鲜的 PCR 管条中转移到相应的孔中。将样品放在冰上并丢弃珠子。
7. 质量管理
   1. 测量纯化文库DNA的DNA浓度。由于灵敏度更高，请使用基于荧光的方法定量 1 μL 中的 DNA。

表 3：连接预混液的制备。 请按此下载此表。

表 4：用于末端修复/dA 拖尾的热循环仪程序。 请按此下载此表。

表 5：末端修复/dA尾矿预混液的制备。 请按此下载此表。

表 6 用于连接的热循环仪程序。 请按此下载此表。

表 7：捕获前PCR热循环仪程序。 请按此下载此表。

表 8：捕获前PCR反应混合物的制备。 请按此下载此表。

3. 样品杂交/捕获

1. 要探测的杂交文库
   1. 根据 表 9 对热循环仪进行编程。启动程序并立即暂停。
      注意：制造商建议杂交温度为 65°C。 该温度降低至 62.5 °C，从而改善了结果。
   2. 从-20°C储存中取出杂交缓冲液，在冰上解冻，并在室温下保存直至使用。从 -20 °C 储存中取出 RNase 阻滞剂和寡核苷酸阻滞剂混合物，并在冰上解冻。将这些小瓶放在冰上直至使用。
   3. 根据步骤2.7中测量的DNA浓度，计算每个样品包含500-1000 ngDNA文库所需的体积。将计算出的体积转移到新的PCR管条中，并用无核酸酶水将总体积调整为12μL。
   4. 涡旋并快速旋转寡核苷酸阻滞剂混合物。向每个样品管中加入 5 μL。密封 PCR 管条并转移到热循环仪。恢复 表 9 中描述的热循环程序并运行到步骤 3，其中需要将额外的试剂直接添加到热循环仪中的样品孔中。
   5. 根据 表10制备25%RNase块溶液。高速密封管子和涡流 10-20 秒，短暂旋转，并在冰上直至使用。
      注意：避免将含有探针的溶液长时间暴露在室温下。仅在制备步骤中保持在室温下。
   6. 从 -80 °C 储存中取出探针样品瓶，并在不使用时将样品瓶保存在冷却架中。转移到冰中解冻。建议按提供的方式使用探头，但如果经过测试，可以稀释^10,13。
   7. 一旦 表 11 中列出的所有试剂都达到室温，结合以制备探针杂交混合物。通过高速涡旋5秒混合溶液，短暂旋转，然后立即进行下一步。
   8. 当热循环仪达到 表9中描述的程序的步骤3时，向每个样品孔中加入13μL室温探针杂交混合物，在整个过程中将试管保持在热循环仪中。通过缓慢上下移液 8x-10x 彻底混合。
   9. 牢固地密封 PCR 试管条，短暂涡旋，然后旋转试管。确保不存在气泡，然后立即将带材管放回热循环仪。仔细检查管子是否正确密封。
   10. 恢复热循环程序，以便将制备的文库DNA样品与探针进行杂交。杂交一夜之间进行
       注意：对于为期 2 天的协议，这标志着第 1 天的结束。对于为期 3 天的协议，这标志着第 2 天的结束。
2. 链霉亲和素珠的制备
   1. 从4°C储存中取出链霉亲和素包被的磁珠（链霉亲和素珠）。彻底涡旋小瓶，以确保珠子完全重悬。悬浮液必须是均匀的。
   2. 对于每个杂交样品，将 50 μL 完全重悬的珠子转移到新 PCR 管条的各个管中。
   3. 按以下方式洗涤链霉亲和素珠：向每个试管中加入 200 μL 结合缓冲液，通过上下移液混合。密封管子，高速涡旋5-10秒，然后短暂旋转。将 PCR 试管条放入磁性支架中。让溶液澄清 5 分钟，然后小心地取出并丢弃上清液。重复步骤 2 次，总共完成 3 次洗涤。
   4. 将磁珠重悬于 200 μL 结合缓冲液中。
3. 捕获杂交文库
   1. 一旦 表9 中指示的杂交热循环程序完成其最后一步，将PCR管条转移到室温。
   2. 将整个体积（~30 μL）从每个试管转移到含有 200 μL 预洗链霉亲和素珠的相应试管中。上下移液 5x-8x 彻底混合，然后牢固密封条管。
   3. 将条带管放在 96 孔平板混合器上，并在室温下以 1800 rpm 剧烈混合 30 分钟。确保液体在孔内正确混合。
      注意：如果 96 孔板混合器不可用或样品未有效混合，请考虑替代方法，例如将条管水平固定在混合器的上表面或使用温控摇床（关闭加热选项）以确保样品彻底搅拌。
   4. 在此孵育期间，为每个样品制备六个等分试样的 200 μL 高温洗涤缓冲液（即，在这种情况下，6 x 8 个条管，每个管 200 μL）。密封试管并在保持在 70 °C 的热循环仪中孵育直至需要。
   5. 30 分钟捕获孵育完成后，短暂旋转 PCR 管条以收集液体。将 PCR 管条放入磁性支架中以收集珠子。等到溶液变清（约2分钟），然后小心地取出并丢弃上清液，同时避免接触珠子。
   6. 从磁性支架上取下 PCR 管条后，加入 200 μL 室温洗涤缓冲液。上下移液，直到链霉亲和素珠完全重悬（15x-20x）。
   7. 将 PCR 管条放入磁性支架中，等待悬浮液清除（约 1 分钟）。然后，取出并丢弃上清液。
      注意：为确保捕获特异性，在整个洗涤过程中将珠子悬浮液保持在 70°C 至关重要。因此，在使用前验证高温洗涤缓冲液是否预热至 70 °C。
   8. 用等分试样洗涤链霉亲和素珠6次，并预热至70°C高温洗涤缓冲液，如下所述。
      1. 从磁性支架上取下装有珠子的 PCR 条管。向每个含有珠子的试管中加入 200 μL 70 °C 预热的高温洗涤缓冲液。上下移液，直到珠子完全重悬（15x-20x）。小心密封PCR管条，高速涡旋8秒，快速旋转，不沉淀珠子。
      2. 将含有重悬珠子的样品条管放入 70°C 的热循环仪块中 5 分钟。在室温下将带材管从热循环仪转移到磁性支架上。
      3. 等待 1 分钟，让溶液清除。然后，取出并丢弃上清液。重复 5 次，总共洗涤六次。
   9. 确保所有洗涤缓冲液均已完全去除，然后向每个样品管中加入 25 μL 无核酸酶水。通过上下移液8次缓慢重悬珠子，尽量避免气泡形成。
   10. 将含有样品的 PCR 条放在冰上，直到它们准备好用于下述 PCR 反应。
4. 扩增富集文库
   1. 根据 表 12 对热循环仪进行编程。启动程序并立即暂停。
      注意：制造商建议根据探针设计的大小执行 10 到 16 个捕获后 PCR 循环。在该协议中，实施了 22 个周期，成功恢复了病原体基因组^10,12。
   2. 从 -20°C 储存、解冻并保存冰上，取回含有 dNTP 的高保真 DNA 聚合酶缓冲液 （5x） 和捕获后引物混合物（参见 材料表）。高速涡旋，使用前快速旋转。
   3. 从-20°C储存中取出用于PCR扩增的高保真融合酶（参见 材料表）。要正确混合酶溶液，请上下移液以避免过度搅拌。然后，根据 表13将所有试剂组合在一起，制备捕获后PCR反应混合物。涡旋最终混音并短暂旋转，保持在冰上。
   4. 向每个样品管中加入 25 μL 捕获后 PCR 反应混合物（每个样品管含有 25 μL 磁珠结合的富含靶标的 DNA）。上下移液以混合反应，直到珠悬浮液均匀。牢固地密封 PCR 管条。在此阶段不要旋转 PCR 试管条。
   5. 将 PCR 管条放入热循环仪中，并按照 表 12 中的规定恢复热循环仪程序。程序到达最后一步后，短暂旋转 PCR 管条。将 PCR 管条放入磁性支架中，等待约 2 分钟，使溶液清除。
   6. 将大约 50 μL 上清液从每个 PCR 管条转移到新 PCR 管条的相应孔中。含有链霉亲和素珠的条状管可以丢弃。
5. 清理最终文库
   1. 使用前让磁珠平衡至室温至少 30 分钟。使用无核酸酶水制备 4 mL 70% 乙醇。保持在室温下。
   2. 彻底涡旋磁珠悬浮液，直到混合物均匀，颜色一致。
   3. 向每个样品管中加入 50 μL 珠子悬浮液。密封管子并涡旋 5-10 秒，短暂旋转（不要沉淀磁珠）。
   4. 在室温下将珠子悬浮液孵育5分钟。将 PCR 管条转移到磁性支架上并等待 5-10 分钟，直到溶液变清。
   5. 将 PCR 管条保持在磁性支架中的同时，小心地从每个孔中取出并丢弃透明溶液。取出溶液时避免接触珠子。
      1. 将 PCR 试管条放在磁性支架中，按以下方式用 70% 乙醇进行两次洗涤：向每个样品中加入 200 μL 70% 乙醇。等待 1 分钟，让受干扰的珠子沉降并去除 70% 乙醇。取出溶液时避免接触珠子。
   6. 第二次洗涤后，密封试管并短暂旋转PCR试管条以收集残留乙醇。将PCR试管条放在磁性支架上30秒。
   7. 要去除残留的乙醇，请从磁性支架上取下 PCR 管条并保持未密封（最好在罩内）最多 5 分钟。确保珠子完全干燥但外观上没有破裂，这会降低洗脱过程的效率。
   8. 通过向每个样品管中加入 25 μL 无核酸酶水来洗脱文库 DNA。上下移液10x-15x彻底混合，密封PCR管条，涡旋5-10秒。确认没有可见的团块。
   9. 将样品在室温下孵育5分钟。将 PCR 管条放入磁性支架中，等待约 5 分钟，直到溶液清除。
   10. 小心地从每个孔中取出清除的上清液（约 25 μL），并转移到新鲜 PCR 管条中的相应孔中。将样品放在冰上并丢弃珠子。
6. 质量管理
   1. 测量纯化文库DNA的DNA浓度。为了获得更好的灵敏度，请使用基于荧光的方法定量 1 μL 中的 DNA。
7. 下一代测序
   注意：根据所用平台的容量和每个样品所需的测序数据量，来自多个批次的索引文库可以在一次测序运行中进行多重分析。
   1. 在合并样品之前，将每个样品的 DNA 浓度调整为 5 ng/μL。以等摩尔量合并文库以保持平衡的表示。
   2. 使用高通量短读长测序系统对制备的文库进行测序，例如，具有 150 bp 双端读长配置（参见 材料表）。

表 9：用于杂交的热循环仪程序。 请按此下载此表。

表10：RNase阻滞液的制备。 请按此下载此表。

表 11：探针杂交混合物的制备。 请按此下载此表。

表 12：捕获后PCR热循环仪程序。 请按此下载此表。

表13：捕获后PCR反应混合物的制备。请点击此处下载此表。

结果

一项针对阿根廷布宜诺斯艾利斯沙眼衣原体LGV疫情的研究显示，样本中存在一些新特征，即与ompA基因型L1相比，ompA基因有10个核苷酸取代，以及不寻常的多位点序列分型（MLST）序列2型17,18,19。我们的目标是从这些临床样本中研究基因组，将它们置于全球数据的背景下。为了实现这一目标，我们将靶标富集方法与临床样本中细菌性传播感染 WGS 的直接宏基因组测序的性能进行了比较，以克服低细菌载量和丰富的人类和微生物 DNA 带来的挑战。

使用的DNA来自2017年至2023年间在阿根廷布宜诺斯艾利斯采集的直肠拭子样本，置于补充有2%胎牛血清（FCS）和抗生素（庆大霉素25μg/mL、万古霉素0.5mg/mL和两性霉素B 2.5μg/mL）的2-SP培养基（蔗糖-磷酸培养基）中，或混合尿道、肛门直肠、 以及在苏黎世大学医院 （USZ） 在 NAAT（核酸扩增测试）缓冲液中收集的咽拭子。使用基于二氧化硅的手动提取试剂盒从布宜诺斯艾利斯样品中提取 DNA，而使用 基于磁珠的自动系统从 USZ 样品中提取 DNA。

本研究中包含的所有临床样本均通过内部开发的多重实时荧光定量PCR检测（见 材料表）确认阳性，qPCR循环阈值（Ct）值范围如下： 沙眼衣原体：17-34， 淋病奈瑟菌： 24-31， 梅毒螺旋体：27-36，生殖 支原体： 30-37。在测序之前使用高灵敏度荧光测定法对DNA浓度进行定量，以表征临床样品的输入材料（参见 材料表）。

为了比较直接宏基因组测序与靶标富集，我们使用了 32 个样本，其中 29 个沙 眼衣原体阳性，9 个淋 病奈瑟菌阳性，5 个 梅毒螺旋体阳性，3 个生殖 支原体阳性。直接宏基因组测序没有产生任何完整的基因组，并且确实几乎没有达到高于阴性样本中观察到的基线的目标数据。在 65 °C 下杂交进行靶标富集可为每种病原体带来更好的结果，并且在许多情况下通过这种方法获得了成功的基因组 （图 1）。

为了评估靶标富集的最佳样本选择，我们评估了诊断性 qPCR Ct 值与基因组恢复效率之间的关系，通过靶向读数百分比 （%OTR） 来衡量。该指标反映了映射到目标生物体基因组的测序读数的比例，通常用于评估富集性能。沙 眼衣原体的病原体载量与测序成功之间存在显着相关性，成功的 Ct 临界值约为 Ct30。尽管其他目标病原体的数据有限，但观察到了类似的趋势，基因组测序成功主要发生在病原体载量低于 Ct30 的样本中 （图 2）。

该杂交温度为 65 °C 的实验根据 Ct 值低于 30 的样本，对 沙眼衣原体、 淋病奈瑟菌和 梅毒螺旋体的基因组测序成功率为 75%-80%。3个 生殖支原体 阳性样本的Ct值为30-37，基因组覆盖率和平均读取深度较低。为了改善这些结果，我们尝试降低杂交温度，由于 生殖支原体 基因组中的 %G+C 含量较低，从而改善了杂交。使用较低的杂交温度，例如现在推荐的 62.5 °C 温度，我们可以在不影响其他基因组恢复的情况下提高 生殖支原体 基因组的恢复率 （图 3）。 这些结果表明，靶标富集是从临床样本中获取有价值基因组信息的有效方法，并且可以适应广泛的基因组，也可以通过基于面板的设计进行调整。

对成功富集的沙眼衣原体基因组的系统发育分析表明，来自布宜诺斯艾利斯的大多数样本聚集在 ompA 基因型 L2b 进化枝内，表明具有成功的全球环流谱系。分析还揭示了阿根廷存在一种新的、独特的谱系，导致 LGV。来自该进化枝的样本与其他LGV谱系相差约600个SNP，该谱系被提议为ompA基因型L4（图4）。补充表 1 提供了图 1、图 2 和图 4 中使用的样品的详细说明。

这些发现强调了靶点富集在研究病原体多样性方面的价值，并证明了临床样本的基因组测序高度成功。

图 1：与直接宏基因组测序相比，使用靶标富集富 集基因组。靶向读数百分比 （%OTR），定义为映射到靶生物体基因组的测序读数百分比，显示通过靶标富集实现的富集程度。该线表示所有数据点的中位数，该框表示 50% 四分位距 （IQR）。数据点颜色与示例源相对应：阿根廷为淡蓝色，瑞士为红色。基因组测序成功，定义为覆盖率 >95% 和平均读取深度 >10），用大点表示，而失败用小点表示。请注意 y 轴上的不同刻度。缩写：CT = 沙眼衣原体，NG = 淋病奈瑟菌，TP = 梅毒螺旋体， MG = 生殖支原体。这个数字是从¹⁰ 修改的。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：靶标富集的 %OTR 与诊断性 qPCR Ct 值的相关性。 数据点颜色表示示例源：阿根廷为淡蓝色，瑞士为红色。基因组测序成功，定义为覆盖率 >95% 和平均读取深度 >10），用大点表示，而失败用小点表示。请注意 y 轴上的不同刻度。缩写：CT = 沙眼衣原体，NG = 淋病奈瑟菌，TP = 梅毒螺旋体， MG = 生殖支原体。这个数字是从¹⁰ 修改的。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：杂交温度对 10 个样本中所有 STI 细菌病原体完整基因组回收率的影响。 在临床样本中范围内的人类 DNA 分别（单个）和全部（单个）加标已知浓度的目标细菌 DNA，以代表具有多种感染的样本（合并）。进行了两个实验，每个实验都有五种病原体/组合：0.01% 和 0.03%，以表示每种微生物的 DNA 相对于样品中总 DNA 的大致百分比（剩余的 DNA 对应于人类 DNA）。 生殖支原体 的回收率在较低温度下得到改善。 沙眼衣原体 DNA以低浓度加标;进一步的实验表明，温度不影响 沙眼衣原体 基因组的恢复（数据未显示）。缩写：CT = 沙眼衣原体，MG = 生殖支原体，NG = 淋病奈瑟菌，TP = 梅毒螺旋体。 请点击此处查看此图的大图。

图 4：来自阿根廷的 LGV 毒株的重组调整系统发育。 该分析包括所有可用的 LGV 基因组和已发表的数据。系统发育右侧显示的元数据包括重复的患者样本、种群结构的贝叶斯分析（BAPS;簇 = 进化枝，多系 BAPS 簇 6 代表种群的遗传多样性）、基因组测序方法（来自本研究的数据）、 ompA 基因型、国家和年份，如左上角的键所示。缺失数据以白色显示。本研究的基因组名称以浅蓝色突出显示阿根廷，深蓝色突出显示芬兰（不是通过靶标富集获得的）。这些颜色仅用于区分本研究中生成的基因组。来自 1000 个超快引导的引导值在主要分支上显示为百分比。这个数字是从¹³ 修改的。 请点击此处查看此图的大图。

补充表 1：研究中使用的材料、试剂、仪器和设备的描述。 该表包括有关用于 DNA 提取、文库制备、靶标富集和测序的组分的商业名称、制造商和目录号的详细信息。它还包括用于内部 qPCR 检测和一般分子生物学程序的项目。标有星号 （*） 的物品可以使用等效的替代品。请按此下载此表。

讨论

从临床样本中生成完整的细菌基因组数据尤其具有挑战性。然而，我们需要这些数据来获得有关循环克隆的信息并研究抗菌素耐药性概况，特别是在挑剔和难以培养的细菌中。使用深度测序或牛津纳米孔技术的自适应测序等替代方法，无法获得足够的数据进行全基因组序列分析。在性传播感染样本等情况下，靶标富集是访问全基因组的最佳技术，该方法可用于一组细菌性传播感染病原体。虽然这不是一个便宜的程序，但它可以提供的结果无法通过任何其他方式获得¹⁰.

应仔细选择适当的样品，最好是回答诊断和研究中的相关和重要问题。用于收集的培养基不一定起关键作用，从 2-SP 和 NAAT 培养基中获得成功的序列。样品储存很重要，目的是保持 DNA 的完整性。发现最重要的因素是诊断负荷，目标是在 Ct30 下获得近似的 Ct 值。对于 Ct 值超过 30 的样本，全基因组测序成功的可能性较小，但在某些情况下，部分数据可能会提供相关信息。

该过程并非易事，涉及许多步骤，包括 PCR 循环、杂交和许多珠子清洗。需要仔细注意该程序以获得最佳效果。该方案的关键步骤——DNA 片段化、与捕获探针的杂交以及基于磁珠的捕获与洗涤——需要仔细执行和正确处理。研究人员和技术人员可以在几次尝试后学习该协议。在第一轮中，在学习的同时，3 天协议可能是一个优势;对于更有经验的用户，2 天协议可以加快结果。由于试剂价格昂贵，因此值得在没有昂贵组件（例如探针）的情况下运行测试运行。对于替代诱饵组，可以调节杂交温度，这可能会提高富集的灵敏度或特异性。如果生成了足够的数据，并且观察到相当大比例的PCR重复，则还可以调整捕获前和捕获后PCR循环的数量。

从这些实验中获得的数据可用于分型，提取 MLST 和其他相关目标。它可以在全球或本地的流行病学背景下进一步分析，与相关基因组进行比较，以获得当代见解。整个基因组的重组和移动元件分析还可以推断出随时间和选择压力的变化，以及可能的合并感染。有了足够的数据和相关的元数据，就可以进行时间计算，并推断出特定特征和谱系的祖先，以及可能的传播途径和机制。我们对一组重要病原体的了解的所有这些进步都可以为公共卫生战略提供信息。我们的方案和代表性结果显示了综合征面板靶探针组的使用，该探针组对细菌性传播感染样本有效，并且可以扩展到其他样本类型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8通道移液器0.5-10µL	埃彭多夫	3125000010	Eppendorf 研究 Plus，8 通道，0.5-10 和微型;L，中灰色，可变体积。
8通道移液器10-100 & micro;L	埃彭多夫	3125000036	Eppendorf 研究 Plus，8 通道，10-100 和微型;L，黄色，可变体积。
用于 MBC 标记文库的接头寡核苷酸混合物	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
使用病毒/病原体 DNA 提取试剂盒的自动核酸提取系统	洽根	937036（套件）/9001297（仪器）	QIAsymphony SP/AS 仪器与 QIAamp DSP 病毒/病原体试剂盒一起使用，用于自动提取 DNA。
结合缓冲液	安捷伦科技	5190-9687	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后）的一部分。
DNA 提取试剂盒和自动化仪器	Zymo研究公司	D3024/D3025	Quick-DNA Miniprep 试剂盒，用于从临床标本中提取总 DNA。兼容手动或自动工作流程。
末端修复 - 拖尾酶混合物	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
末端修复尾矿缓冲液	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
乙醇	VWR 化学品 BDH	20816.298	乙醇无水 ≥99.5% Ph. Eur.，USP
荧光计，采用高灵敏度 dsDNA 检测/基于荧光的方法定量 DNA	赛默飞世尔科技 （Invitrogen）	Q33238、Q33231	Qubit 4 荧光计，带 1X dsDNA 高灵敏度 （HS） 检测试剂盒。
碎片缓冲液	安捷伦科技	5191-4080	SureSelect 酶碎裂试剂盒的一部分，名称为“5X Fragmentation Buffer”。
碎裂酶	安捷伦科技	5191-4080	SureSelect 酶碎裂试剂盒的一部分。
高保真 DNA 聚合酶缓冲液	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（预 PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分，名称为“Herculase II 缓冲液”。
含 dNTP 的高保真 DNA 聚合酶缓冲液 （5X）	安捷伦科技	5190-9687	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后）的一部分，名称为“Herculase II Buffer”。
用于 PCR 扩增的高保真融合酶	安捷伦科技	5191-5688	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后）的一部分，名称为“Herculase II”。
高温洗涤缓冲液	安捷伦科技	5190-9687	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后）的一部分，名称为“洗涤缓冲液 2”。
杂交缓冲液	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
索引测序引物	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（PCR 前）的 SureSelect XT HS2 索引引物对 1-96 的一部分。
内部多重实时荧光定量 PCR 检测	提布莫比奥尔	不适用	基于 Lightmix 试剂盒的内部开发和认可的检测方法，用于 STI 检测
连接缓冲液	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
用于清理的磁珠	安捷伦科技	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XP 磁珠。
磁性支架	Permagen 实验室器皿	MSRLV08	0.2mL PCR 8 条带磁选机 5 & micro;L ~0.2mL 体积。
二代测序（NGS）：高通量短读长测序系统	Illumina, Inc.	不适用	在 Illumina NextSeq1000 和 MiSeq 平台上进行的配对端 150 bp 测序 （PE150）。
无核酸酶水	生物概念	3-07F04-H	分子生物学用水，不含 DNA/DNAse/RNase，无菌，不含 PCR 抑制剂。
寡核苷酸阻滞剂混合物	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
PCR试管条	avantor，由 VWR  交付;	732-3608	带有平盖的 PCR 管条。
捕获后引物混合物	安捷伦科技	5190-9687	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后）的一部分。
RNA探针	安捷伦科技	5191-6916	SureSelect 自定义 Tier4 6Mb-11.9Mb 探头，例如 Design ID S3465164）。
RNase 阻滞剂	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
室温洗涤缓冲液	安捷伦科技	5190-9687	SureSelect 靶标富集试剂盒 ILM Hyb 模块盒 1（PCR 后），名称为“洗涤缓冲液 1”。
链霉亲和素珠	安捷伦科技	5191-5742	Sure选择链霉亲和素珠。
T4 DNA 连接酶	安捷伦科技	5500-0147	用于 ILM（Pre PCR）的 SureSelect XT HS2 文库制备试剂盒的一部分。
靶标富集法/DNA捕获法	安捷伦科技	G9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA 试剂盒，具有文库制备、快速 Hyb 靶标富集和捕获后池化工作流程。协议版本 F0,2023 年 5 月。用于Illumina平台NGS
针对 C. trachomatis、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体和 M. genitalium	安捷伦科技/富集微生物学实验室（IMM、UZH）	设计 ID S3465164	定制设计的探针组（~242,000 个探针），用于多重捕获四种性传播感染病原体。基于多个参考基因组的设计。
热循环仪	热飞歇	4375305	Veriti 96 孔热循环仪。