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利用靶向富集工作流程从临床样本生成完整的细菌基因组

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DOI：

10.3791/68506

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2025年8月15日

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1Institute of Medical Microbiology, University of Zürich, 2Facultad de Farmacia y Bioquímica, Cátedra de Microbiología Clínica, Universidad de Buenos Aires

本文内容

摘要

本文介绍一种利用靶向富集技术对临床样本中细菌性性传播感染病原体进行全基因组测序的实验方案。这种基于综合征检测面板的创新方法克服了样本中人类DNA含量高而细菌载量低的技术难题，有助于对沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum）和生殖支原体（Mycoplasma genitalium）开展基因组监测。

摘要

直接从临床样本中获取细菌性性传播感染（STI）的完整基因组具有挑战性，原因在于样本中存在人类DNA、微生物群以及极低的细菌病原体载量。培养通常不可行，因为这些细菌种类营养要求苛刻，且大多数样本采集于可裂解微生物的运输培养基中，导致其无法用于培养。为解决这些问题，我们设计了一套涵盖四种物种的探针面板，用于生成细菌性STI的全基因组序列，并在基因组测序前实施靶向富集——一种耗时两至三天的杂交流程。初步结果显示，对于直接测序未能成功的样本，该方法仍可获得高质量的基因组数据。靶向富集在测序细菌性STI基因组方面表现出高度有效性，尤其在病原体载量较高时（Ct < 30）。含有Mycoplasma genitalium的测试样本常具有高于30的Ct值，导致基因组回收成功率较低；将杂交温度从65 °C优化至62.5 °C后，已观察到性能提升。除了支持基因组监测外，获得完整基因组还可提供有关抗菌药物耐药性的宝贵信息，例如识别与Neisseria gonorrhoeae相关的获得性耐药决定因子。该方法已成功鉴定出布宜诺斯艾利斯地区一种新型Chlamydia trachomatis淋巴肉芽肿静脉炎（LGV）谱系，即ompA-基因型L4，凸显了该方法在揭示新基因组多样性及提升STI监测能力方面的潜力。

引言

新一代测序（NGS）技术的出现促进了细菌全基因组测序（WGS）的发展，使得多种人类细菌病原体的临床分离株得以进行测序。该技术通过以前所未有的规模生成完整的基因组，推动了大量比较研究的开展。这对临床和公共卫生微生物学产生了重大影响，因为通过WGS从临床样本中获取基因组数据，能够实现菌株分型以及抗菌药物耐药基因的检测。此外，宏基因组学方法可直接从临床样本中检测与疾病相关的病原体。此类信息为患者个体化治疗策略的制定创造了新的机遇。同时，WGS也是一种强大的工具，可揭示特定病原体流行菌株的进化过程及其传播模式，从而帮助公共卫生机构更深入地理解并更有效地应对病原体暴发事件1,2,3。

为了获得全基因组测序（WGS）所需的足够测序质量，通常需要通过培养进行细菌分离，以获取足够的微生物DNA量4,5,6。这对于难以培养的微生物、因诊断样本处理导致失活而无法培养的微生物，或在患者治疗过程中暴露于抗生素的微生物而言，构成了一个限制因素。此类难以培养的微生物包括性传播细菌病原体，例如 Chlamydia trachomatis、Neisseria gonorrhoeae、Treponema pallidum 和 Mycoplasma genitalium7,8,9。这些物种由于多种因素而难以培养，包括其胞内寄生特性、脆弱性、苛刻的生长需求以及缓慢的复制速率。因此，开发并实施能够在DNA含量较低（如临床样本中常见情况）条件下仍可进行WGS的技术，对于在临床环境中开展基因组分析至关重要。

当微生物DNA含量稀少时，靶向富集是基因组测序最具前景的方法10。例如，在引起性传播感染（STIs）的病原体中，患者样本中仅有极小部分DNA来源于病原体。以沙眼衣原体（C. trachomatis）感染为例，病原体DNA最多仅占总DNA的0.6%，而通常情况下的比例更低11。靶向富集方法的核心是在进行高通量测序（NGS）之前，选择性地捕获目标微生物DNA。该过程通过使用特异性设计的、带有生物素标记的RNA探针实现，这些探针与目标微生物DNA序列互补。在杂交前，首先进行接头连接以构建基因组文库，随后这些探针与互补的微生物DNA结合。接着，利用链霉亲和素包被的磁珠捕获带有生物素标记的核酸复合物，利用的是生物素与链霉亲和素之间的强相互作用。最后，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增所选中的DNA片段。上述关键步骤是理解靶向富集策略的基础。然而，完整实验流程还包括洗涤和质量控制等其他操作步骤10,12。

在启动测序流程之前，评估输入DNA的量并确保整个操作流程中维持其完整性至关重要。根据制造商的建议，标准方案要求在7 µL体积中含有10–200 ng的DNA，对应的浓度范围约为1.4至28.6 ng/µL。当DNA浓度较低时，建议采用使用17 µL体积的改良方案，可在保持所需输入量的前提下，适应0.6至11.8 ng/µL的浓度范围12。鉴于临床样本中常获得较低的DNA浓度，我们常规采用17 µL的方案变体。杂交与测序表现与DNA质量相关，因此强调了适当的样本储存和运输条件对维持核酸完整性的关键作用。因此，采用稳定化采样介质、快速处理、维持冷链条件以及尽量减少冻融循环等规范操作，是优化DNA质量的重要措施。除了所需的DNA浓度外，DNA片段长度也是完整性的重要指标。我们建议在样本处理和储存过程中尽量减少DNA降解，以获得更长的片段，从而优化测序结果。这一点在临床环境中尤为重要，因为采样方法、介质和处理方式的差异较为常见。我们已成功将该方案应用于从2-SP培养基和NAAT运输介质中提取的DNA，代表性结果中显示平均片段长度可低至1 kb。最后，成功的测序定义为基因组覆盖度超过95%，且平均测序深度超过10x10。

迄今为止，多种研究团队已成功将靶向富集技术应用于多种微生物和病毒，包括引起性传播感染（STIs）的病原体、诺如病毒、家畜病毒以及植物病原体10,13,14,15,16。然而，迄今为止，探针设计通常局限于单一病原体，而非针对多种临床综合征相关病原体的完整基因组组合。理想的靶标是基因组较小且保守的生物体，这确实包括 C. trachomatis、T. pallidum 和 M. genitalium。尽管 N. gonorrhoeae 的基因组多样性更高且泛基因组更大，但在包含上述三种细菌的设计中，仍可合理地纳入覆盖该菌的探针。这些细菌之间以及可能与之临床相关的其他病原体在 %G+C 含量上存在一定差异，这意味着实验条件可能需要优化。

本实验方案的目的是直接从临床样本中获取完整的基因组，以进行系统发育和流行病学分析。我们展示了一种新颖且有效的策略，采用针对目标病原体定制的探针 panel 沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，梅毒螺旋体， 和 M. genitalium 利用从泌尿生殖道和肛门直肠拭子等临床样本中提取的DNA来回收完整基因组。该方法已被证明是成功的，并已应用于布宜诺斯艾利斯淋巴肉芽肿（LGV）暴发疫情的特征分析，从而实现对一种新型谱系的描述 C. trachomatis LGV10,13.

将介绍靶向富集流程，包括使用市售的DNA捕获方法，并结合捕获后混合策略用于下一代测序（NGS），以直接从临床样本中获得C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum和/或M. genitalium感染患者的完整基因组。为确保最佳效果，建议选择Ct值低于30的样本，因为较高的Ct值反映病原体载量较低，难以获得完整的基因组。该方法所需的DNA提取物可来源于多种样本类型和采样介质的临床样本。DNA提取过程可通过手工或自动化系统完成，使用专为从人源拭子样本中分离病原体或病毒DNA而设计的试剂盒（参见材料表）。

目标富集步骤中使用的探针组（参见 材料清单旨在特异性捕获基因组多样性 沙眼衣原体、淋病奈瑟菌、梅毒螺旋体 和 M. genitalium. 针对每种物种的多个完整基因组设计了定制探针，以优化对其已知泛基因组的覆盖10设计标准包括与参考序列的最小序列同源性为90%，以及1x-2x的平铺频率，以提高靶标捕获效率。为优化成本效益，探针设计所用算法在保持基因组覆盖全面性的同时，尽量减少了探针数量。最终探针组包含242,000个探针，用于靶向多重设计 沙眼衣原体，淋病奈瑟菌，生殖支原体，以及 T. pallidum整个靶向富集实验流程可在2至3天内完成。针对两天和三天的工作流程，均提供了明确的暂停点指示。

伦理声明
本研究基于先前已发表的方案提出方法学改进10,13。所述操作仅涉及去标识化的样本，不包含患者数据；因此，方法学部分无需特定的伦理审批。代表性结果来自两组先前研究过的样本：在批准方案“感染性直肠炎患者中C. trachomatis的检测：流行率与分型”（布宜诺斯艾利斯市政府，批准号 201723）下收集的阿根廷样本，所有参与者均签署了书面知情同意书；以及匿名的芬兰样本，该样本无需特定伦理审批。在将任何测序数据提交至数据库之前，需去除人类序列读段。

方案

注意：工作区域应划分为 PCR 前区域（无扩增子工作区）和 PCR 后区域（扩增子操作工作区），以防止污染。除非另有明确说明，所有步骤必须在这两个受控工作区之一中进行。所有预混液和 PCR 反应混合液应在无扩增子工作区中配制，而所有涉及扩增 DNA 的后续步骤则应在扩增子操作工作区中进行。本方案中所有试剂用量均按处理八个样本计算。

1. DNA 片段化

  1. 使用一种灵敏、准确的基于荧光的方法（双链DNA [dsDNA] 检测试剂盒，取1 µL样品，检测范围最高达120 ng/µL；参见材料表），测定含有目标病原体DNA（DNA）的临床样本DNA提取物的浓度。在整个实验流程中，每次测定DNA浓度时均采用此定量方法。
  2. 用无核酸酶水将每个DNA样本稀释至10 - 200 ng的浓度，确保每个PCR管条中的终体积为17 µL。为获得最佳测序结果，应在推荐范围内使用尽可能高量的输入DNA。
    注意：当总DNA浓度在17 µL中低于推荐最低值10 ng时，可根据制造商建议添加背景DNA（例如人基因组DNA）以满足输入要求。这有助于稳定文库构建反应，并改善低输入量临床样本的测序性能。
  3. 将片段化缓冲液（5×）解冻，涡旋混匀后置于冰上。
  4. 按照表1设置热循环仪程序，启动程序后立即暂停。
    注意：37 °C孵育步骤的持续时间可能因初始DNA片段大小和期望的NGS读长而异。对于高质量DNA样本，建议孵育15分钟以获得适合2 × 100 bp测序读长的150–200 bp片段，或孵育10分钟以获得适合2 × 150 bp测序读长的180–250 bp片段。
  5. 从-20°C保存条件下取出片段化主混合液所需的小瓶，根据表2配制主混合液。密封管子后高速涡旋5–10秒，短暂离心去除气泡，并将主混合液置于冰上保存。
  6. 向每孔含有17 µL输入DNA的反应孔中加入3 µL片段化主混合液，用移液器吹打混匀20次，密封PCR管条，高速涡旋5–10秒，然后短暂离心。
  7. 将PCR管条放入热循环仪（参见材料表），并在步骤1开始处恢复表1 所示程序。
  8. 当程序运行至4 °C保持阶段时，从热循环仪中取出PCR管条，加入30 µL无核酸酶水，将PCR管条置于冰上。

表 1：酶法片段化的热循环仪程序。请点击此处下载该表格。

表 2：片段化主混合液的制备 请点击此处下载该表格。

2. 文库构建

  1. 连接反应预混液的制备
    注意：此时应配制连接反应预混液，因其需要 30–45 分钟恢复至室温。
    1. 从-20°C保存处取出连接缓冲液，置于冰上解冻。从-20°C保存处取出T4 DNA连接酶，通过倒置离心管混匀，并置于冰上保存。
    2. 根据说明制备连接反应主混合液 表3密封试管，高速涡旋振荡10-20秒，短暂离心，室温放置30-45分钟后再使用。
  2. 末端修复与加dA尾片段
    1. 根据以下步骤设置热循环仪 表4.
    2. 从 -20 °C 保存条件下取出末端修复加尾缓冲液，在冰上解冻。解冻后，高速涡旋振荡，短暂离心。取出末端修复-A 加尾酶混合液，通过倒置管体混匀，并置于冰上保存。
    3. 按照说明配制末端修复/dA加尾主混合液 表5 （参见 材料表用封口膜密封试管后充分涡旋10–20秒，短暂离心，置于冰上保存。
    4. 将20 µL末端修复/dA加尾主混合液加入每个含有50 µL DNA片段（来自步骤1.1–1.8）的孔中。密封PCR管条，高速涡旋振荡5–10秒以充分混匀。短暂离心PCR管条，然后放入热循环仪中。继续运行程序 表4.
  3. MBC标记接头的连接
    1. 程序一旦启动 表4 完成最后一步后，将PCR管条置于冰上。根据以下参数设置热循环仪： 表6启动程序并立即暂停。
    2. 向2.1步骤中制备的每个样品加入25 µL室温连接反应主混合液。密封PCR管条，涡旋振荡5–10秒，短暂离心。
    3. 获取用于MBC标记文库的接头寡核苷酸混合物（参见 材料表从 -20 °C 保存条件下取出，在冰上解冻。解冻后，高速涡旋振荡 5–10 秒。短暂离心后置于冰上保存。
    4. 向每个样本中加入 5 µL 用于 MBC 标记文库的接头引物混合物。密封 PCR 管条，高速涡旋振荡 5–10 秒，短暂离心。立即将 PCR 管条放入热循环仪中，并按照指定程序继续运行 表6.
  4. 连接反应纯化
    1. 使用磁珠进行DNA纯化。将磁珠从4 °C保存条件下取出，在使用前使其达到室温。
    2. 使用无核酸酶水配制 4 mL 70% 乙醇，室温保存。
      注意：强烈建议在纯化步骤中使用新鲜配制的70%乙醇溶液，以确保最佳效果。配制70%乙醇时，应使用无核酸酶水，并在使用前立即配制。
    3. 充分涡旋振荡磁珠悬浮液，直至混合物均匀，颜色一致。
    4. 当程序在 表6 当程序到达4 °C保持步骤时，将PCR管条从热循环仪转移至室温。向每孔加入80 µL磁珠悬浮液。密封PCR管条，涡旋振荡5–10秒，短暂离心。
    5. 将珠子悬浮液在室温下孵育5分钟。将PCR管条转移至磁力架上（参见 材料表）并等待5-10分钟，直至溶液变澄清。
    6. 将PCR管条保持在磁力架上，小心移除并弃去每孔中的上清液，避免接触磁珠。
    7. 将PCR管条置于磁力架上，用70%乙醇洗涤两次，操作步骤如下：向每个样本中加入200 µL 70%乙醇，静置1分钟，然后移除70%乙醇。在移除液体时避免触碰磁珠。
    8. 第二次洗涤后，密封PCR管条，短暂离心以收集残留的乙醇。将PCR管条置于磁力架上静置30秒。
    9. 移除收集的乙醇时避免触碰磁珠。为去除残留的乙醇，将PCR管条从磁力架上取下，并在不密封的条件下（理想情况下在通风橱内）放置最多5分钟。确保磁珠完全干燥但表面无开裂；否则会降低洗脱步骤的效率。
    10. 向每个样本孔中加入35 µL无核酸酶水以洗脱DNA。用移液器上下吹打10–15次充分混匀，密封管体后涡旋振荡5–10秒。确认无可见团块。若存在团块，继续涡旋至完全溶解。
    11. 将样品在室温下孵育5分钟。将PCR管条置于磁力架上，静置约5分钟，直至溶液澄清。
    12. 小心移除每个孔中的澄清上清液（约 34 µL），并转移至新 PCR 管条中对应的孔中。将样品置于冰上，弃去磁珠。
      注意：对于为期3天的实验流程，此步骤为第1天的结束。将样品在4 °C下过夜保存。
  5. 扩增与双端索引
    注意：为每个样本选择适当的index引物对，以确保测序过程中能够正确识别。每个index序列包含一个8 bp的标签，该标签整合在用于扩增捕获前文库的引物中。
    1. 从 -20 °C 保存条件下取出高保真 DNA 聚合酶缓冲液（含 dNTPs，5×），置于冰上融化。同时从 -20 °C 保存条件下取出选定的带索引测序引物，并保持在冰上。
      注意：务必记录分配给每个样本的特定条形码，以确保在整个测序过程中能够准确识别和追溯样本。
    2. 根据以下程序设置热循环仪 表7启动程序并立即暂停。
      注意：制造商建议根据输入DNA的质量和数量进行8到14个预捕获PCR循环。本方案中依据制造商建议采用11个循环，获得了高质量的测序数据10,12.
    3. 从 -20 °C 保存条件中取出用于 PCR 扩增的高保真融合酶。用移液器轻轻吹打混匀，避免剧烈震荡；涡旋高保真 DNA 聚合酶缓冲液以确保均匀。配制捕获前 PCR 反应混合液（具体方法见 表8). 涡旋混匀最终混合物，短暂离心，置于冰上保存。
    4. 分配 11 µL 预捕获 PCR 反应混合液（按前述方法制备） 表8将纯化的DNA文库加入各样本孔中。向每个反应体系中加入5 µL选定的index引物对。密封PCR管条，涡旋振荡5秒，然后快速离心。
    5. 继续按照指定的程序运行热循环仪 表7当温度升至 98 °C 时，将 PCR 管条放入热循环仪中，并牢固关闭盖子。
  6. 文库纯化
    1. 让磁珠在使用前于室温下平衡至少30分钟。使用无核酸酶水配制4 mL 70%乙醇，室温保存。
    2. 充分涡旋振荡磁珠悬浮液，直至混合物均匀且颜色一致。
    3. 当程序在 表7 当程序到达4 °C保持步骤时，将PCR管条从热循环仪转移至室温。向每个样本中加入50 µL磁珠悬浮液。密封PCR管条，涡旋振荡5–10秒，短暂离心（勿使磁珠形成沉淀）。
    4. 将珠子悬浮液在室温下孵育5分钟。将PCR管条转移至磁力架上，静置5-10分钟，直至溶液变澄清。
    5. 将PCR管条保持在磁力架上，小心地从每个孔中移除并弃去上清液。移液时避免触碰到磁珠。
    6. 将PCR管条置于磁力架上，用70%乙醇洗涤两次，具体操作如下：向每个样品中加入200 µL 70%乙醇，静置1分钟，然后移除70%乙醇。在移除液体时避免触碰磁珠。
    7. 第二次洗涤后，密封PCR管条并短暂离心以收集残留的乙醇。将PCR管条置于磁力架上静置30秒，小心移除残留乙醇，避免接触磁珠。
    8. 为去除残留的乙醇，将PCR管条从磁力架上取下并在未密封的条件下静置最多5分钟（理想情况下在通风橱内进行）。确保磁珠完全干燥但表面无裂纹，因为裂纹会降低洗脱过程的效率。
    9. 向每个样本管中加入15 µL无核酸酶水，以洗脱文库DNA。用移液器上下吹打10–15次，充分混匀，密封PCR条板管，涡旋振荡5–10秒。确认无可见团块。若存在团块，继续涡旋至完全溶解。
    10. 将样品在室温下孵育5分钟。将PCR管条置于磁力架上，静置约5分钟，直至溶液澄清。
    11. 小心地从每个孔中移除澄清的上清液（约15 µL），并转移至新的PCR管条中对应的孔内。将样品置于冰上，弃去磁珠。
  7. 质量控制
    1. 测定纯化后文库DNA的浓度。由于荧光法灵敏度更高，应采用基于荧光的方法对1 µL样品中的DNA进行定量。

表 3：连接反应主混合液的制备。请点击此处下载该表格。

表 4：末端修复/dA加尾的PCR仪程序。请点击此处下载该表格。

表 5：末端修复/dA加尾主混合液的配制。请点击此处下载该表格。

表 6 连接反应的热循环程序。请点击此处下载该表格。

表 7：捕获前 PCR 的 PCR 仪程序。请点击此处下载该表格。

表 8：捕获前 PCR 反应体系的配制。请点击此处下载该表格。

3. 样品杂交/捕获

  1. 用于探针杂交的文库
    1. 根据表9设置热循环仪程序，启动程序后立即暂停。
      注：制造商推荐的杂交温度为65°C。本实验将温度降低至62.5°C，结果更优。
    2. 从-20°C冰箱中取出杂交缓冲液，在冰上解冻，随后置于室温备用。同时从-20°C冰箱中取出RNase抑制剂和寡核苷酸阻断剂混合液，在冰上解冻。使用前始终保持这些试剂管置于冰上。
    3. 根据步骤2.7测得的DNA浓度，计算每个样本所需体积，使每个样本含有500–1000 ng DNA文库。将计算好的体积转移至新的PCR管条中，并用无核酸酶水调整总体积至12 µL。
    4. 涡旋并短暂离心寡核苷酸阻断剂混合液。向每个样本管中加入5 µL。密封PCR管条后转移至热循环仪中。恢复表9所述的热循环程序，运行至第3步，此时需直接向热循环仪中的样本孔中添加额外试剂。
    5. 根据表10配制25% RNase阻断溶液。密封后高速涡旋10–20秒，短暂离心，之后置于冰上备用。
      注：避免含探针的溶液长时间暴露于室温。仅在操作准备过程中短暂置于室温。
    6. 从-80°C冰箱中取出探针管，不使用时应置于冷却架中保存。解冻时转移至冰上。建议直接使用原液探针，但经验证后也可稀释使用10,13。
    7. 当表11所列所有试剂均恢复至室温后，混合配制探针杂交混合液。高速涡旋5秒混匀，短暂离心后立即进行下一步操作。
    8. 当热循环仪运行至表9所述程序的第3步时，向每个样本孔中加入13 µL室温探针杂交混合液，整个过程保持PCR管条在热循环仪内。缓慢吹打8–10次以充分混匀。
    9. 牢固密封PCR管条，短暂涡旋后离心。确保无气泡产生，随后立即将管条放回热循环仪。仔细检查各管是否密封良好。
    10. 恢复热循环程序，使制备好的文库DNA样本与探针进行杂交。杂交过程过夜进行。
      注：对于两日流程，此为第一天结束；对于三日流程，此为第二天结束。
  2. 链霉亲和素磁珠的准备
    1. 从4°C冰箱中取出链霉亲和素包被的磁珠（链霉亲和素磁珠），充分涡旋混匀，确保磁珠完全重悬。悬液应均匀一致。
    2. 对每个杂交样本，将50 µL充分重悬的磁珠转移至新PCR管条中的独立管中。
    3. 按以下方式洗涤链霉亲和素磁珠：向每管中加入200 µL结合缓冲液，通过吹打混匀。密封后高速涡旋5–10秒，短暂离心。将PCR管条放入磁力架中，静置5分钟使溶液澄清，小心吸除并弃去上清液。重复该步骤两次，共完成三次洗涤。
    4. 用200 µL结合缓冲液重悬磁珠。
  3. 捕获杂交文库
    1. 当表9所示的杂交热循环程序完成最后一步后，将PCR管条转移至室温。
    2. 将每管中的全部体积（约30 µL）转移至对应含有200 µL预洗链霉亲和素磁珠的管中。吹打5–8次充分混匀，然后牢固密封管条。
    3. 将管条置于96孔板振荡器上，于室温下以1800 rpm剧烈振荡30分钟。确保各孔内液体充分混合。
      注：若无96孔板振荡器，或样本混合不充分，可考虑替代方法，例如将管条水平固定于振荡器上表面，或使用温控摇床（关闭加热功能），以确保样本充分振荡。
    4. 在孵育期间，为每个样本准备六份200 µL高温洗涤缓冲液（即本例中准备6 × 8个管，每管200 µL）。密封后置于热循环仪中，保持在70°C直至使用。
    5. 30分钟捕获孵育完成后，短暂离心PCR管条以收集液体。将管条放入磁力架中收集磁珠。静置至溶液澄清（约2分钟），小心吸除并弃去上清液，避免触碰磁珠。
    6. 将PCR管条从磁力架中取出后，向每管加入200 µL室温洗涤缓冲液。吹打15–20次，直至链霉亲和素磁珠完全重悬。
    7. 将PCR管条放回磁力架，等待悬液澄清（约1分钟），然后吸除并弃去上清液。
      注：为确保捕获特异性，洗涤过程中必须始终保持磁珠悬液温度为70°C。因此，使用前需确认高温洗涤缓冲液已预热至70°C。
    8. 使用已分装并预热至70°C的高温洗涤缓冲液，按以下步骤对链霉亲和素磁珠进行6次洗涤。
      1. 将含磁珠的PCR管条从磁力架中取出。向每管加入200 µL预热至70°C的高温洗涤缓冲液。吹打15–20次，直至磁珠完全重悬。小心密封PCR管条，高速涡旋8秒，快速离心但不使磁珠沉淀。
      2. 将含重悬磁珠的样本管条放入热循环仪的加热块中，于70°C孵育5分钟。随后将管条从热循环仪转移至室温下的磁力架中。
      3. 静置1分钟待溶液澄清，然后吸除并弃去上清液。重复5次，共完成六次洗涤。
    9. 确保完全去除所有洗涤缓冲液后，向每管样本中加入25 µL无核酸酶水。缓慢吹打8次以重悬磁珠，尽量避免产生气泡。
    10. 将含样本的PCR管条置于冰上，直至用于后续PCR反应。
  4. 扩增富集文库
    1. 根据表12设置热循环仪程序，启动程序后立即暂停。
      注：制造商建议根据探针设计大小进行10至16个捕获后PCR循环。本实验采用22个循环，成功实现了病原体基因组的回收10,12。
    2. 从-20°C冰箱中取出含dNTPs的高保真DNA聚合酶缓冲液（5x）和捕获后引物混合液（见材料表），解冻后置于冰上。使用前高速涡旋并短暂离心。
    3. 从-20°C冰箱中取出用于PCR扩增的高保真融合酶（见材料表）。为充分混匀酶溶液，应通过吹打混合液体，避免剧烈震荡。随后根据表13配制捕获后PCR反应混合液。最终混合液涡旋混匀后短暂离心，并置于冰上保存。
    4. 向每管样本（每管含25 µL磁珠结合的靶标富集DNA）中加入25 µL捕获后PCR反应混合液。吹打混匀，直至磁珠悬液均匀。牢固密封PCR管条。此阶段切勿离心。
    5. 将PCR管条放入热循环仪，恢复表12所述程序。程序运行至最后一步后，短暂离心PCR管条。将管条放入磁力架中，静置约2分钟待溶液澄清。
    6. 将每管上清液约50 µL转移至新PCR管条的对应孔中。含链霉亲和素磁珠的管条可丢弃。
  5. 最终文库的纯化
    1. 使用前至少将磁珠在室温平衡30分钟。用无核酸酶水配制4 mL 70%乙醇，室温保存。
    2. 充分涡旋磁珠悬液，直至混合均匀且颜色一致。
    3. 向每管样本中加入50 µL磁珠悬液。密封后涡旋5–10秒，短暂离心（不使磁珠沉淀）。
    4. 室温孵育磁珠悬液5分钟。将PCR管条转移至磁力架，静置5–10分钟至溶液澄清。
    5. 保持PCR管条在磁力架中，小心吸除并弃去每孔中的澄清液体。移液时避免触碰磁珠。
      1. 保持PCR管条在磁力架中，用70%乙醇进行两次洗涤：向每样本孔中加入200 µL 70%乙醇。静置1分钟，待扰动的磁珠重新沉降后，吸除70%乙醇。移液时避免触碰磁珠。
    6. 第二次洗涤后，密封管条并短暂离心以收集残留乙醇。将PCR管条置于磁力架中30秒。
    7. 为去除残留乙醇，将PCR管条从磁力架中取出，保持未密封状态（理想情况下在通风橱内）最多5分钟。确保磁珠完全干燥但无开裂，否则会影响洗脱效率。
    8. 通过向每管样本中加入25 µL无核酸酶水来洗脱文库DNA。吹打10–15次充分混匀，密封PCR管条后涡旋5–10秒。确认无可见团块。
    9. 室温孵育样本5分钟。将PCR管条放入磁力架，静置约5分钟至溶液澄清。
    10. 小心吸取每孔澄清上清液（约25 µL），转移至新的PCR管条对应孔中。样本置于冰上保存，磁珠丢弃。
  6. 质量控制
    1. 测定纯化后文库DNA的浓度。为获得更高灵敏度，建议使用基于荧光的方法，用1 µL样本进行定量。
  7. 下一代测序
    注：根据所用平台的通量及每个样本所需的测序数据量，可将多个批次的加索引文库在单次测序运行中多重混合。
    1. 在合并样本前，将每个样本的DNA浓度调整至5 ng/µL。等摩尔量混合文库，以保持各文库的均衡代表。
    2. 使用高通量短读长测序系统对制备好的文库进行测序，例如采用150 bp双端读长配置（见材料表）。

表 9：杂交反应的热循环程序。请点击此处下载该表格。

表10：RNase阻断溶液的配制。请点击此处下载该表格。

表 11：探针杂交混合液的配制。请点击此处下载该表格。

表 12：捕获后 PCR 的 PCR 扩增仪程序。请点击此处下载该表格。

表13：捕获后PCR反应体系的制备。 请点击此处下载该表格。

结果

一项关于阿根廷布宜诺斯艾利斯C. trachomatis LGV暴发的研究显示，这些样本具有一些新特征，即在ompA基因中存在10个核苷酸替换，与ompA-基因型L1相比不同，以及一种不常见的多位点序列分型（MLST）序列型217,18,19。我们的目标是分析这些临床样本的基因组，并将其置于全球数据背景下进行研究。为实现这一目标，我们比较了靶向富集方法与直接宏基因组测序在临床样本中进行细菌性性传播感染（STI）全基因组测序（WGS）的性能，以期克服因细菌载量低以及存在大量人类和微生物DNA所带来的挑战。

DNA 来源于2017年至2023年在阿根廷布宜诺斯艾利斯采集的直肠拭子样本，这些样本置于添加了2%胎牛血清（FCS）及抗生素（庆大霉素25 µg/mL、万古霉素0.5 mg/mL和两性霉素B 2.5 µg/mL）的2-SP培养基（蔗糖-磷酸盐培养基）中，并于−80 °C保存；或来源于苏黎世大学医院（USZ）采集的尿道、肛肠和咽部拭子混合样本，保存于核酸扩增检测（NAATs）缓冲液中。布宜诺斯艾利斯样本的DNA采用基于硅胶的手工提取试剂盒提取，而USZ样本的DNA则采用基于自动化磁珠的系统提取。

本研究中包含的所有临床样本均通过实验室自建的多重实时荧光定量PCR检测方法（见材料表）确认为阳性，qPCR循环阈值（Ct值）范围如下：C. trachomatis：17–34，N. gonorrhoeae： 24–31，T. pallidum：27–36，以及M. genitalium： 30–37。在测序前，使用高灵敏度荧光定量法对DNA浓度进行测定，以表征临床样本的起始材料（见材料表）。

为了比较直接宏基因组测序与靶向富集的效果，我们使用了32个样本，其中29个样本为沙眼衣原体（C. trachomatis）阳性，9个为淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）阳性，5个为梅毒螺旋体（T. pallidum）阳性，3个为生殖支原体（M. genitalium）阳性。直接宏基因组测序未能获得任何完整的基因组，实际上其靶标数据几乎未超过阴性样本中的基线水平。而采用65 °C杂交进行靶向富集后，每种病原体的结果均显著改善，通过该方法在多数情况下成功获得了完整的基因组(图1)。

为评估靶向富集的最佳样本选择，我们分析了诊断性qPCR的Ct值与基因组回收效率之间的关系，后者以靶向序列读长占比（%OTR）来衡量。该指标反映了比对到目标生物基因组的测序读长比例，常用于评估富集效果。C. trachomatis的病原体载量与测序成功率之间存在显著相关性，成功测序的Ct值阈值约为Ct30。尽管其他靶向病原体的数据有限，但仍观察到类似趋势，即基因组测序成功主要出现在病原体载量低于Ct30的样本中(图2)。

在65 °C杂交温度下进行的本实验，针对Ct值低于30的样本，对C. trachomatis、N. gonorrhoeae和T. pallidum的基因组测序成功率实现了75%–80%的目标富集率。三个M. genitalium阳性样本的Ct值为30–37，其基因组覆盖度和平均测序深度较低。为改善这些结果，我们尝试降低杂交温度，这有助于提高杂交效率，因为M. genitalium基因组的G+C含量较低。通过使用较低的杂交温度，例如目前推荐的62.5 °C，我们能够在不损害其他病原体基因组回收效果的前提下，提高M. genitalium基因组的回收率(图3)。这些结果表明，靶向富集是一种从临床样本中获取有价值基因组信息的有效方法，并可适用于多种基因组，包括基于面板设计的广泛应用。

对成功富集的 C. trachomatis 基因组进行系统发育分析表明，布宜诺斯艾利斯的大多数样本聚集在 ompA-基因型 L2b 支系内，提示该谱系具有全球传播能力且传播成功。分析还揭示了在阿根廷存在一个引起淋巴肉芽肿（LGV）的新型独立谱系。该支系的样本与其他 LGV 谱系之间大约存在 600 个 SNP 的差异，因此提议将其命名为 ompA-基因型 L4 (图 4)。用于 图 1、图 2 和 图 4 的样本详细信息见补充表 1。

这些发现强调了靶向富集在研究病原体多样性中的价值，并展示了从临床样本中实现高程度基因组测序成功的潜力。

基因组测序结果图表，显示通过直接测序与SureSelect方法获得的%OTR。
图1：使用靶向富集与直接宏基因组测序相比的基因组富集效果。 目标序列读段占比（%OTR），定义为比对至目标生物基因组的测序读段所占百分比，用于反映靶向富集所达到的富集程度。图中直线表示所有数据点的中位数，方框表示50%四分位距（IQR）。数据点颜色对应样本来源：浅蓝色代表阿根廷，红色代表瑞士。基因组测序成功（定义为覆盖度 >95% 且平均读深 >10）以较大的点表示，失败则以较小的点表示。请注意y轴的不同尺度。缩写：CT = C. trachomatis，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum，MG = M. genitalium。本图经修改自10。 请点击此处查看此图的放大版本。

基因组测序散点图；%OTR 与 Ct 的关系；成功/失败分析；数据可视化。
图 2：目标富集获得的 %OTR 与诊断性 qPCR Ct 值的相关性。 数据点颜色表示样本来源：浅蓝色代表阿根廷，红色代表瑞士。基因组测序成功（定义为覆盖度 >95% 且平均测序深度 >10）以较大的点表示，失败则以较小的点表示。请注意 y 轴的不同刻度。缩写：CT = C. trachomatis，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum，MG = M. genitalium。本图经修改自10。 请点击此处查看此图的放大版本。

杂交温度与覆盖度关系图；微生物区分；分析的数据点。
图 3：杂交温度对十个样本中所有性传播感染细菌病原体完整基因组回收率的影响。在人类DNA中添加已知浓度的目标细菌DNA，分别单独添加（单重）以及混合添加（多重），以模拟单一致病菌或多种病原菌共感染的样本。共进行了两组实验，每组包含五种病原体/组合，添加比例分别为0.01%和0.03%，以近似代表每种微生物DNA在总DNA中所占的百分比（其余DNA为人类DNA）。在较低温度下，M. genitalium的回收率有所提高。C. trachomatis的DNA添加浓度较低；进一步实验表明，温度变化对C. trachomatis基因组的回收无显著影响（数据未显示）。缩写：CT = C. trachomatis，MG = M. genitalium，NG = N. gonorrhoeae，TP = T. pallidum。请点击此处查看该图的放大版本。

基于SNP数据的细菌基因型系统发育分析图，展示各国间的多样性。
图 4：阿根廷LGV菌株经重组校正后的系统发育树。 本分析纳入了所有已发表数据的可用LGV基因组。系统发育树右侧显示的元数据包括重复的患者样本、群体结构贝叶斯分析（BAPS；聚类=分支，其中多系群的BAPS聚类6代表群体的遗传多样性）、基因组测序方法（本研究数据）、ompA 基因型、国家和年份，具体说明见左上角图例。缺失数据以白色表示。本研究中的基因组名称以浅蓝色标出（阿根廷）和深蓝色标出（芬兰）（非靶向富集获得）。这些颜色仅用于区分本研究中生成的基因组。1000次超快速Bootstrap分析的Bootstrap值以百分比形式标注在主要分支上。本图改编自13。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表 1：本研究中使用材料、试剂、仪器和设备的说明。 该表格列出了用于DNA提取、文库构建、靶向富集和测序的组分的详细信息，包括商品名称、生产厂家和目录编号。此外，还包含用于实验室内部qPCR检测和常规分子生物学实验的相关物品。标有星号（*）的项目可使用等效替代品。请点击此处下载该表格。

讨论

从临床样本中获取完整的细菌基因组数据具有较大挑战性。然而，我们需要这些数据来了解流行克隆株并研究抗菌药物耐药性特征，尤其是在难以培养的苛养菌中。使用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）进行深度测序或自适应测序等替代方法，均无法获得用于全基因组序列分析的足够数据。对于性传播感染（STI）样本等情况，靶向富集是获取完整基因组的最佳技术，且该方法可应用于一系列细菌性STI病原体。尽管该方法成本较高，但其所能提供的结果是其他任何方法都无法实现的10。

应仔细选择合适的样本，最好能够回答诊断和研究中的相关且重要的问题。收集样本所用的保存液并非起决定性作用，使用2-SP和NAAT保存液均能成功获得测序结果。样本储存至关重要，目的是保持DNA的完整性。其中最重要的因素是诊断载量，理想情况下Ct值应低于Ct30。对于Ct值超过30的样本，全基因组测序成功的可能性较低，但在某些情况下，仍可能获得具有参考价值的部分序列数据。

该流程并非易事，涉及多个步骤，包括PCR循环、杂交以及多次磁珠洗涤。为获得最佳结果，必须严格遵循操作规程。本方案的关键步骤——DNA片段化、与捕获探针的杂交，以及基于磁珠的捕获与洗涤——需要谨慎操作并妥善处理。研究人员和技术人员经过数次尝试后即可掌握该方案。在初期学习阶段，耗时3天的方案具有一定优势；而对于经验更丰富的操作者，可采用2天方案以加快实验进程。由于试剂成本较高，建议在不使用昂贵组分（例如探针）的情况下先进行一次测试运行，以节约成本。 对于不同的捕获探针组合，可调整杂交温度，以提高富集的灵敏度或特异性。若产生的数据量充足且观察到较高比例的PCR重复序列，则也可调整捕获前和捕获后的PCR循环次数。

这些实验获得的数据可用于分型，从中可提取MLST及其他相关靶标。还可在全球或局部范围内进行流行病学分析，与相关基因组进行比较，以获得当前的深入认识。全基因组的重组和移动元件分析还能推断随时间推移及在选择压力下的变化，以及可能的共感染情况。在具备充足数据及相关元数据的情况下，可进行时间推算，推断特定特征和谱系的祖先，以及可能的传播途径和机制。这些对重要病原菌类群认知的进展，可为公共卫生策略提供依据。我们的实验方案及代表性结果展示了综合征检测面板靶向探针组的应用，该方法在细菌性性传播感染样本中有效，且可扩展至其他类型的样本。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们诚挚感谢所有为本项目做出贡献的人员。来自苏黎世大学的Fanny Wegner博士、Srinithi Purushothaman、Frank Imkamp博士、Tim Roloff博士、Dominique Braun博士以及Adrian Egli教授，他们在该技术的开发与优化过程中提供了重要支持。我们特别感谢Daniel Gander、Valéria Pires、Arianita Asani和Stefan Antener在测序工作中提供的出色技术支持。来自布宜诺斯艾利斯大学的Andrea Carolina Entrocassi博士、María Lucía Gallo Vaulet博士、Deysi López Aquino博士、Laura Svidler López博士以及Luciana La Rosa博士也作出了宝贵贡献，谨此致谢。最后，我们感谢来自安捷伦（Agilent）的Ibrahim Kisakesen博士和Andreas Schreiber博士提供的支持。本研究得到了Gottfried und Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung基金会STIDirect项目的资助，以及苏黎世大学科学基金会（Stiftung für wissenschaftliche Forschung an der Universität Zürich）STISeq项目（编号STWF-24-009）的资助。此外，研究还获得了苏黎世大学提供的非限制性资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8通道移液器 0.5-10 µLEppendorf3125000010Eppendorf Research plus，8通道，0.5-10 µL，中灰色，可调体积。
8通道移液器 10-100 µLEppendorf3125000036Eppendorf Research plus，8通道，10-100 µL，黄色，可调体积。
MBC标记文库用接头寡核苷酸混合物Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
使用病毒/病原体DNA提取试剂盒的自动化核酸提取系统Qiagen937036 (试剂盒) / 9001297 (仪器)QIAsymphony SP/AS仪器配合QIAamp DSP Virus/Pathogen试剂盒用于自动化DNA提取。
结合缓冲液Agilent Technologies5190-9687SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分。
DNA提取试剂盒及自动化仪器Zymo Research CorporationD3024/D3025Quick-DNA Miniprep试剂盒，用于从临床样本中提取总DNA。支持手动或自动化操作流程。
末端修复-A尾化酶混合物Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
末端修复尾化缓冲液Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
乙醇VWR Chemicals BDH20816.298无水乙醇 ≥99.5%，符合欧洲药典和美国药典标准
配备高灵敏度dsDNA检测试剂的荧光计 / 基于荧光法的DNA定量方法Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)Q33238, Q33231Qubit 4荧光计配合1X dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒。
片段化缓冲液Agilent Technologies5191-4080SureSelect酶法片段化试剂盒的组成部分，名称为“5X片段化缓冲液”。
片段化酶Agilent Technologies5191-4080SureSelect酶法片段化试剂盒的组成部分。
高保真DNA聚合酶缓冲液Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分，名称为“Herculase II缓冲液”。
含dNTPs的高保真DNA聚合酶缓冲液（5X）Agilent Technologies5190-9687SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“Herculase II缓冲液”。
用于PCR扩增的高保真融合酶Agilent Technologies5191-5688SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“Herculase II”。
高温洗涤缓冲液Agilent Technologies5190-9687SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“洗涤缓冲液2”。
杂交缓冲液 Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
带索引的测序引物Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2索引引物对1-96（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
实验室自建多重实时荧光定量PCR检测方法Tib MolbiolN/A基于Lightmix性传播感染检测试剂盒开发并经认证的实验室自建检测方法
连接缓冲液Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
用于纯化的磁珠Agilent Technologies5191-5740SureSelect DNA AMPure XP磁珠。
磁力架Permagen LabwareMSRLV080.2 mL PCR 8联管磁力分离器，适用体积5 µL ~0.2 mL。
新一代测序（NGS）：高通量短读长测序系统 Illumina, Inc.N/A在Illumina NextSeq1000和MiSeq平台上进行的双端150 bp测序（PE150）。
无核酸酶水BioConcept3-07F04-H分子生物学用水，无DNA、DNA酶、RNA酶，无菌，无PCR抑制剂。
寡核苷酸阻断剂混合物 Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
PCR管条avantor，由VWR提供  732-3608带平盖的PCR管条。
捕获后引物混合物Agilent Technologies5190-9687SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分。
RNA探针Agilent Technologies5191-6916 SureSelect定制Tier4 6Mb-11.9Mb探针，例如设计编号S3465164。
RNase阻断剂Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
室温洗涤缓冲液Agilent Technologies5190-9687SureSelect靶向富集试剂盒Illumina杂交模块Box 1（PCR后）的组成部分，名称为“洗涤缓冲液1”。
链霉亲和素磁珠Agilent Technologies5191-5742SureSelect链霉亲和素磁珠。
T4 DNA连接酶Agilent Technologies5500-0147SureSelect XT HS2文库制备试剂盒（用于Illumina平台，PCR前）的组成部分。
靶向富集方法 / DNA捕获方法Agilent TechnologiesG9983-90000SureSelect XT HS2 DNA试剂盒，包含文库制备、快速杂交靶向富集和捕获后合并工作流程。版本F0，2023年5月。适用于Illumina平台NGS。
针对 C. trachomatis、N. gonorrhoeae、T. pallidum 和 M. genitalium 的靶向富集探针组Agilent Technologies / 微生物学富集实验室（IMM, UZH）设计编号 S3465164专为四种性传播感染病原体多重捕获设计的定制探针组（约242,000条探针），基于多个参考基因组设计。
热循环仪Thermofischer4375305Veriti 96孔热循环仪。

参考文献

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