本研究聚焦于在小鼠模型中对发光的结直肠癌细胞进行体内皮下诱导，并利用成像系统进行后续的发光检测。该实验方案旨在建立一种可重复的肿瘤生长模型，用于实时监测及治疗效果评估。
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摘要
摘要
结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，凸显了迫切需要改进的临床前模型以评估潜在疗法。动物模型对于阐明肿瘤生物学特性及评估新型治疗干预措施至关重要。相较于现有模型，小鼠模型具有多项关键优势，包括可进行遗传操作、繁殖速度快、成本效益高，以及拥有免疫健全和免疫缺陷品系，能够精确模拟人类癌症。
本实验方案重点介绍在免疫缺陷型小鼠模型中皮下接种生物发光的结直肠癌细胞系HCT-116，随后利用IVIS系统和游标卡尺进行非侵入性生物发光成像，以监测肿瘤的进展和生长情况。使用发光细胞可实现实时、可定量地追踪肿瘤发育及其对治疗干预的反应，从而减少对侵入性操作的需求。肿瘤细胞接种需要一组小鼠（n = 12），通过测量发光强度建立标准化的治疗测试模型。肿瘤体积通常仅根据长度和宽度测量值或宽度计算得出。
当前方法可在最小化的同时确保肿瘤建立的一致性° 变异性，最终提高临床前评估的可靠性。本研究的结果将有助于优化用于药物测试的肿瘤模型，并提升临床前研究在临床应用中的转化潜力。通过采用先进的成像技术和可重复的实验设计，本研究旨在提高评估的准确性和效率 体内 结直肠癌治疗药物评估
引言
结直肠癌（CRC）是全球主要的健康负担之一，在最常见且致命的恶性肿瘤中位居前列1建立可靠的临床前模型对于评估新的治疗策略至关重要，因为传统的 体外 检测方法无法充分反映活体系统中肿瘤生长和药物反应的复杂性。 在体 模型，尤其是小鼠模型，已被用于深入揭示肿瘤生物学特性，使研究人员能够在受控环境中评估潜在治疗方法的有效性。
在小鼠模型中使用发光的结直肠癌（CRC）细胞代表了临床前研究的重要进展，能够实现对肿瘤进展的实时、无创监测2。本研究旨在建立一种标准化的皮下肿瘤诱导及IVIS成像方案，以动态追踪肿瘤生长。选择皮下注射模型是因为其技术操作简便、可重复性强，并且便于进行长期的肿瘤监测。通过利用生物发光成像，研究人员可以获得关于肿瘤发育及治疗反应的精确且可量化的数据，而无需在多个时间点处死动物3。
IVIS 成像系统是一种评估肿瘤负荷的强有力工具，具有高灵敏度和特异性，可提高体内研究的可重复性和准确性。本研究将为未来的治疗评估奠定基础，为结直肠癌治疗的临床前药物测试提供一种标准化且高效的方案。通过优化肿瘤诱导方法并应用先进的成像技术，该研究有助于弥合肿瘤学领域临床前研究与临床应用之间的差距4。
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方案
动物饲养于特定病原体阴性环境中，遵循由Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria（IMIB，穆尔西亚）伦理委员会（编号 A13240502）制定的指南。合格人员按照皇家法令 1201/2005 的要求每周进行检查。
1. 动物
注意：注射前必须对所有动物进行安全且牢固的固定。若操作对象为免疫缺陷小鼠（例如裸鼠，如 Crl: NU(NCr)-Foxn1nu），务必保持无菌环境。本研究在实验开始时使用了12只5周龄的裸鼠（雌性体重20–22 g，雄性体重22–26 g），雌雄各占50%。所有麻醉和实验操作均在 科研伦理与良好实践指南 经机构伦理委员会批准（批准号：A13240502），并符合西班牙法规（R.D. 1201/2005）。
- 开始实验前，将4周龄的小鼠在动物中心适应约1周。随后进行以下操作。
2. D-荧光素储备液的制备
- 在生物安全柜内，将D-荧光素钾盐生物发光底物以15 mg/mL的浓度溶于预热的磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于锥形管内。反复倒置管子数次，充分混匀溶液。
- 将溶液通过0.2 µm针头滤器过滤，以实现无菌处理。
- 将无菌溶液分装至1 mL不透光微量离心管中，于-20 °C保存。
注意：荧光素对光敏感。
3. 细胞外基质制备
- 在2 °C至8 °C的冰箱中，将无酚红商品化细胞外基质（ECM）水凝胶置于冰上过夜解冻5。
- 注射当天，将ECM保持在冰上，使用预冷的P1000移液器将200 µL ECM分装至无菌离心管中。
注意：建议使用宽口微量离心管。尽量减少温度变化，避免反复冻融。 - 在配制注射液前，将注射器和针头置于冰上预冷，以防止ECM发生突然的温度变化。
4. 细胞脱离与计数
- 在肿瘤诱导前数天，将HCT-116生物发光细胞（ATCC细胞系CCL-247-LUC2）接种于T75培养瓶中，以确保获得足够数量的细胞。细胞培养维持在37 °C、5% CO2条件下，必要时更换培养基6。
- 实验当天，小心吸除培养基，避免扰动贴壁细胞。
- 用8 mL预热至30 °C的无菌PBS洗涤细胞，以去除残留血清。
- 每瓶加入2 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育4–5分钟。在倒置显微镜下观察细胞脱落情况。若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶侧壁以促进脱落。
- 加入含胎牛血清（FBS）的10 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
- 用10 mL移液管将细胞转移至15 mL锥形离心管中。用额外2 mL新鲜培养基冲洗培养瓶，收集残留细胞，并将冲洗液一并加入15 mL离心管中。
- 室温下以200 × g离心5分钟。小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 用3 mL接种培养基轻柔重悬细胞沉淀，制成均匀的细胞悬液。
- 使用血球计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，通过倒置显微镜计数活细胞。
注意：为实验准备足够数量的细胞：每只小鼠至少需要3 × 106个活细胞。 - 将细胞重悬于预热至30 °C的无菌PBS中，并用PBS调节活细胞浓度至2 × 107个/mL，分装为每份200 µL。
5. 准备实验设备并麻醉动物。
- 在成像前至少4小时开启成像系统。
注意：请遵循系统说明，完成初始化步骤，包括根据信噪比手动调整光照强度和相机曝光时间。该设置必须根据实验条件手动设定。 - 称量动物体重，并计算所需注射的D-荧光素钠溶液体积（每20 g动物注射15 mg/mL溶液200 µL）。
- 清洁并消毒成像室和成像柜。
- 识别每只小鼠，并在麻醉前安全固定。
注意：进行皮下注射时，佩戴两副手套以防止针头意外刺伤手部。 - 使用2%异氟烷与氧气混合气体（氧气流速为1.8–2.0 L/min）对小鼠进行麻醉。同时开启麻醉泵和抽吸泵。
6. 注射用细胞的制备
- 在生物安全柜内，将 200 µL 浓度为 2 × 107 个生物发光结直肠癌细胞/mL 的细胞悬液与 200 µL 细胞外基质（ECM）混合。使用 P1000 移液器轻轻吹打，避免产生气泡和细胞解离。
- 将 400 µL 混合液转移至 1 mL 注射器中，去除气泡，并立即进行注射。
- 在固定动物的同时，安全地取下针头保护帽，操作过程中始终确保针头无菌。
注意：建议每只动物使用单独的针头，以最大限度减少污染。每只小鼠均使用新针头，防止小鼠间交叉感染。 - 安装 25 G 针头，调整注射器内液体体积至 200 µL，并排除所有气泡。
注意：通常注射体积为 200 µL，每次注射含 2 × 106 个细胞。 - 在固定动物的同时，将针头松散地滑回保护帽中，操作过程中避免接触针头或保护帽。
7. 皮下肿瘤诱导
- 小鼠麻醉后将其从麻醉舱中取出，并将其鼻部置于提供相同麻醉气体的出口中。
注：在本实验中，出口是用一只手套制成的。 - 将动物右侧卧于平坦表面上。用非优势手的指尖轻轻捏起并提起其左下腹区域的皮肤。
- 注射前应先回抽，以确认针头位置正确。用优势手持针，针尖斜面向上，将针头三分之二插入提起的皮肤内，与动物身体平行，操作时需格外小心，避免刺伤手指或穿透双层手套。
注：正确进针应产生负压，且针座内无回吸液体。 - 将注射器内的液体（200 µL）注入提起的皮肤内，位于两指之间。拔针前稍作停留，然后缓慢退出针头。皮下注射完成后取出针头，并安全弃置于锐器盒中。
注：注射前应使用70%酒精或等效皮肤消毒剂对注射部位进行消毒。
8. D-荧光素的腹腔注射
- 在将动物放回麻醉室之前，使用15 mg/mL的储存液，通过30 G胰岛素注射器以150 mg/kg体重的剂量腹腔内（IP）注射D-荧光素酶底物（每20 g动物注射200 µL）。
注意：最多0.5 mL的注射量均可良好耐受。 - 手动固定动物，使其呈背侧卧位（腹部朝上），并将动物头部一端朝下倾斜，以便肠道内容物向下移动。
- 保持针头斜面朝上，并以15–20°轻微倾斜角度将针头推入腹腔，使针尖刚好穿透动物左下腹象限的腹壁。
注意：注射前应使用70%酒精或等效皮肤消毒剂对注射部位进行消毒。 - 缓慢将D-荧光素酶底物注入腹腔内，拔出针头后安全丢弃。
- 将小鼠放入麻醉室，使其稳定约5分钟。15分钟后，开始进行in vivo成像。
注意：针对每种新的动物模型应构建D-荧光素酶动力学曲线以确定信号峰值时间。在本实验中，in vivo成像的光信号在约15分钟时达到峰值。
9. 在体 成像分析
- 将完全麻醉的动物置于成像系统的腔室内，侧卧于右侧。确保动物与相机和光源对齐，以准确捕获肿瘤区域。
- 打开连接的软件，选择可视或摄影成像模式以确认动物的位置。保存数据并更改文件夹名称。
- 选择生物发光成像模式，并将其设置为自动模式。采集生物发光图像，并在计算机屏幕上监测肿瘤发出的光信号。
- 成像完成后，将动物放回笼中，并观察是否存在任何并发症。
- 进行后期处理，首先调整生物发光信号的标度，使所有小鼠的肿瘤显示相同的标度，通常介于1e6至1e8之间。
- 在肿瘤周围设置感兴趣区域（ROI）用于分析，并复制该区域以供后续分析使用。测量ROI内的光信号强度，并导出结果用于进一步分析。对于后续的肿瘤，粘贴先前创建并复制的相同大小的ROI。
- 根据制造商的说明关闭系统，并清洁成像室。关闭抽气装置、麻醉泵以及氧气气流。
10. 肿瘤体积测量
- 使用异氟烷对动物进行麻醉以测量肿瘤。将动物置于稳定位置并遮盖其头部，迅速固定动物。
- 使用校准的数字卡尺测量肿瘤的长度、宽度和深度。
注意：操作应迅速完成，因为动物在离开麻醉舱约1分钟后即开始苏醒。 - 重复测量并计算平均值。
- 根据球形或椭球形肿瘤的公式计算体积：
对于球形肿瘤 7
(1)
对于椭球形肿瘤 8
(2)
注意：为尽量减少测量偏差，研究中的所有肿瘤测量应由同一操作者完成。此外需注意，在肿瘤诱导当天，由于肿瘤组织尚未完全固化，准确测量通常较为困难。
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结果
该方案允许将人源细胞引入免疫缺陷小鼠模型，从而促进这些肿瘤细胞的生长 体内，这总是比生理学上更相关 体外必须确保实验条件尽可能具有可重复性，肿瘤中所含的活细胞数量相近，且移植位置具有可比性并能持续稳定地进行观察。
检测生物发光HCT-116细胞系的敏感性 体内, 2 × 106 将细胞皮下注射至裸鼠（n = 12）。优化后的方案有助于均匀注射具有活性的细胞数量，无论是在发光强度还是肿瘤体积方面（P > 0.05) (图1 和 图2生物发光成像能够实现对微小肿瘤病灶的高灵敏度实时成像（图1A）具有均一信号（图1B). 生物发光检测结果也显示信号强度与肿瘤体积之间存在线性相关性（R = 0.81，P = 0.0013）（图1C<...
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讨论
在无胸腺裸鼠模型中通过皮下接种发光结直肠癌细胞的实验方案，提供了一种标准化且可重复的肿瘤形成及实时监测方法。首先需要明确的是，此类研究通常持续28天，发光信号检测在肿瘤接种当天进行，之后每周检测一次。相反，由于细胞悬液尚未形成包块，因此在第一天不进行游标卡尺测量肿瘤体积；肿瘤体积测量从第一周开始，之后每周进行一次。从皮下注射当天起，通过游标卡尺测量监测肿瘤生长，直至肿瘤体积达到约300 mm³，该数值依据既往研究中描述的公式计算得出9。
该方法中最关键的步骤之一是将肿瘤细胞悬浮液制备在细胞外基质（ECM）中，这可通过提供类似ECM的环境来支持细胞存活和增殖，从而提高肿瘤成瘤率。此外，在注射前确保发光细胞经过适当培养和传代，对于维持细胞活力以及在各实验组间获得一致的肿瘤形成至关重要。故障排查措施包括确保细胞处于最佳传代次数，以维持其活力和致瘤性。
由于使用了免疫缺陷小鼠，我们建议进行病原体检测 Corynebacterium bovis, 棒状杆菌属菌种<...
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本研究工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
ACS 和 CNN 隶属于西班牙穆尔西亚圣哲罗姆校区 135 号（邮编 30107）穆尔西亚天主教大学（UCAM）健康科学博士项目"，并获得 UCAM 提供的博士奖学金。作者感谢 IMIB（Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria，穆尔西亚）动物实验平台的支持，本研究的临床前实验在该平台完成"。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 不透明白色微量离心管 | Eppendorf | 30125215 | D-荧光素储存 |
| 15 mL 锥形离心管 | Falcon, Thermo Fisher Scientific | 11507411 | 细胞培养材料 |
| 高级改良杜尔贝科必需氨基酸培养基（Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM） | Thermo Fisher Scientific | 1152046 | 细胞培养试剂 |
| 裸鼠（Athymic Nude Mouse） | Charles River | Crl:NU(NCr)-Foxn1nu | 免疫缺陷型裸鼠 |
| 生物发光人结肠癌细胞 HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2 适用于活体生物发光实验 |
| D-荧光素 Pierce | Thermo Fisher Scientific | 15215733 | 用于生物发光检测 |
| 细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM） | Corning | 356231 | Matrigel 基质用于细胞侵袭实验 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | 细胞培养试剂 |
| 滤芯吸头 | Finntip, Thermo Fisher Scientific | 94056710 | 避免产生气泡 |
| 胰岛素注射器 25 G 1 mL | Iberomed | JERINRAYS29 | 用于 HCT-116 细胞系的移植 |
| 胰岛素注射器 30 G 0.5 mL | DH Material medico | 9.41652E+15 | 用于 D-荧光素给药 |
| IVIS 活体成像系统（含 Living Image 软件） | PerkinElmer/Revvity | 128201 | 生物发光与荧光成像扫描仪 |
| Sterican 肝素化针头 | VWR | 612-0153 10 | 用于 D-荧光素给药及 HCT-116 移植 |
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline, PBS） | VWR | 392-0042P | 用于 HCT-116 细胞的悬浮、解离与移植 |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 | Thermo Fisher Scientific | 11590626 | 细胞培养试剂 |
| T-75 培养瓶，组织培养处理型 | STARLAB | CC7682-41 | 细胞培养材料 |
参考文献
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