我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。
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本文内容
摘要
摘要
对肠道类器官进行准确、无标记成像，对于研究其形态、生长动态以及对环境刺激的响应至关重要。全息层析成像技术（HT）能够在无需荧光标记的情况下，对活体类器官实现高分辨率的三维（3D）可视化，从而最大限度地减少光毒性并保持样本完整性。基于相位的实时成像可实现对结构和功能变化的连续、无标记追踪。该方法利用折射率作为内在成像对比机制，可量化体积、蛋白质密度和蛋白质含量等生物物理特性。 成像数据进一步通过机器学习驱动的分割和特征提取进行处理，以支持一致且高通量的分析。本实验方案详细描述了在类器官研究中应用低相干HT的完整实验流程，涵盖类器官制备、成像采集以及基于机器学习的数据分析。通过整合计算分割与定量评估，该方法可实现对类器官关键特性（包括活力、结构组织性和药物反应性）的无偏倚评价。该技术能够在亚细胞分辨率下捕捉实时形态变化，因此在再生医学、疾病建模和药物筛选等基于类器官的研究中具有广泛的应用价值。本文所述的分步操作方法有助于在不同类器官系统中实现可重复性和广泛适用性。
引言
类器官是由干细胞培养而成的三维（3D）微型器官，能够重现真实器官的关键结构和功能特征 体外1研究人员已为多种组织开发了类器官系统——包括肠道、脑、肺、肝和肾——每种系统均展现出类似其来源组织的自我组织结构和细胞类型多样性 体内 对应物。通过模拟天然器官的结构和多细胞复杂性，类器官成为研究人类发育、组织再生和疾病机制的强大模型系统1它们已成为疾病建模和药物发现的关键工具，使研究人员能够在实验室中利用患者特异性的三维组织探索疾病通路并测试新的治疗方法。2值得注意的是，类器官在再生医学中也具有广阔的应用前景3：类器官来源的组织可被移植 体内 修复损伤，这一点已在肠道和肝脏类器官中得到证实，凸显了它们在恢复器官功能方面的潜力4这种多功能性使类器官在现代生物医学研究和个性化医疗中不可或缺。
由于类器官具有多细胞组成和三维结构复杂性，捕获并分析其动态变化至关重要。然而，传统成像技术在解析类器官结构和动态过程方面存在显著局限性，通常只能提供二维图像，无法充分反映其完整的生理状态5。
明场显微镜是一种....
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方案
注意：本方案中使用的所有材料、仪器和软件的相关详细信息均在材料表中提供。不同制造商的等效产品可作为替代品使用。整个方案的示意图见图1。
1. 样品制备
- 制备 sIO 培养基
- 根据生产商说明书配制市售培养基。使用 0.22 µm 滤器对培养基进行过滤除菌。
注意：如果培养基在细胞培养操作台内无菌条件下配制，且所有组分均已预先灭菌（例如以无菌瓶或小瓶提供），则可能无需通过 0.22 µm 滤器进行过滤。 - 将 15 mL 配制好的培养基分装至无菌储存管中。在类器官培养使用前，将分装的培养基恢复至室温（15 - 25 °C）。
- 根据生产商说明书配制市售培养基。使用 0.22 µm 滤器对培养基进行过滤除菌。
- 解冻 sIO 储存液
- 将冷冻保存的类器官在 37 °C 水浴中快速解冻（2 分钟内完成）。将解冻后的类器官悬液转移至微量离心管中，在 150 × g 条件下离心 3 分钟，使类器官沉淀。
- 小心吸除上清液，以去除 DMSO，尽量减少潜在的细胞毒性作用。
- 按 1:4 比例加入培养基和新鲜细胞外基质（ECM），轻柔吹打，确保沉淀均匀重悬。每孔在 48 孔板中接种 15 µL 形成液滴。将 ECM 置于冰上，防止提前聚合。
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结果
图1 展示了sIOs的4D成像与定量分析的示意图。本方案通过四个步骤实现sIOs的连续活体成像和全面评估：培养、4D成像、图像处理和定量分析（图1D）。
经过5天的培养后，成熟的sIOs被转移至带有盖玻片底部的成像培养皿中，用于低相干全息层析成像（HT）观察（图1A）。该成像技术通过反卷积算法重建折射率（RI）断层图像（图1B），可实现对活体类器官的高分辨率、无标记成像。
随后使用基于机器学习辅助的分割方法进行图像处理，以实现精确的结构勾画（图1C）。首先，将原始折射率（RI）断层图像转换为HDF5格式，以兼容ilastik——一种基于交互式机器学习的分割工具。在ilastik中，通过训练体素级分类器生成类器官掩膜，以特异性识别类器.......
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讨论
全息层析成像为类器官的无标记、高分辨率活体成像提供了一种强大的方法，克服了传统成像技术相关的诸多挑战。在本方案中，我们描述了一种将低相干全息层析成像（HT）应用于小肠类器官（sIO）研究的综合方法，可实现对类器官形态、生长动态以及药物处理响应的实时、定量可视化。结合基于机器学习的分割与定量分析，进一步增强了该成像方法的分析能力，为类器官行为提供了无偏倚、可重复的评估手段。
全息层析成像（HT）的一个主要优势在于能够以无标记的方式对处于天然状态的类器官进行活体成像。传统的基于荧光的成像方法（如共聚焦显微镜和光片显微镜）需要染色或基因标记，这可能引入光毒性，影响类器官的生理状态，并限制活体成像的持续时间。此外，基于抗体的标记在致密的类器官结构内部会受到扩散障碍的影响，因而需要较长的孵育时间6,7。HT 利用折射率（RI）作为内在的对比机制，克服了这些挑战，从而实现了对类器官生长与分化过程的无创、长期监测，并达到亚细胞分辨率。
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披露
M.J.L.、J.H.L.、S.M.L. 和 Y.K.P. 在 Tomocube 公司拥有财务利益，该公司致力于全息层析成像和定量相位成像仪器的商业化。
致谢
本工作由韩国国家研究基金会资助，该基金会由韩国政府（MSIT）提供资金支持（RS-2024-00442348、RS-2024-00440577、2022M3H4A1A02074314），以及韩国先进技术研究院（KIAT）通过国际协作研发项目&D 计划（P0028463）以及由韩国政府（科学技术信息通信部和保健福祉部）资助的韩国再生医学基金（KFRM）项目 & 福利）（21A0101L1-12）。数据采集由 M.J.L. 和 J.H.L. 完成，其中 J.H.L. 负责数据处理，J.M.C. 负责数据分析。所有作者均对论文撰写作出了贡献。我们感谢 ChulMin Oh 和 Chungha Lee 在技术讨论及图表准备方面提供的宝贵帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48孔板 | Corning | 3548 | 培养皿 |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | Matrigel降解 |
| 顺铂 | supelco | PHR1624 | N/A |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | 溶剂 |
| Eppendorf管 | Corning | MCT-175-C-S | N/A |
| HTX处理服务器 | Tomocube Inc., Korea | N/A | 数据处理服务器 |
| HT-X1 | Tomocube Inc., Korea | N/A | 操作软件 |
| Ilastik | N/A | N/A | 基于机器学习的图像分割工具包 |
| 成像培养皿支架 | Tomocube Inc., Korea | N/A | 成像培养皿固定装置 |
| IntestiCult类器官生长培养基（小鼠） | STEMCELL Technologies | #06005 | 商业化预制培养基 |
| Matlab | MathWorks | Matlab 2024a | 图像处理软件 |
| Matrigel | Corning | 356231 | 用于三维类器官的细胞外基质（ECM） |
| Millipore Steritop 真空瓶顶过滤器 | Merck | S2GPT05RE | 用于培养基灭菌的0.22 μm滤器单元 |
| 小鼠肠道类器官 | STEMCELL Technologies | #70931 | N/A |
| 折射仪 | ATAGO | R-5000 | 折射率计算器 |
| TomoDish | Tomocube Inc., Korea | 901002-02 | #1.5盖玻片底成像培养皿 |
| TomoStudio X | Tomocube Inc., Korea | N/A | 成像软件 |
| TrypLE | Gibco | 12604 | 单细胞解离 |
参考文献
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem ce....
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重印与许可
