通过低相干全息学对肠道类器官进行无标记、高分辨率 3D 成像和机器学习分析

Summary

我们提出了一种使用低相干全息断层扫描对类器官进行高分辨率、无标记和三维成像的分步协议。该协议详细介绍了类器官培养制备、成像采集和计算图像分析，从而能够实时可视化活类器官中的结构动力学和药物反应。

Abstract

肠道类器官的准确、无标记成像对于研究其形态、生长动力学和对环境刺激的反应至关重要。全溶分析 （HT） 无需荧光标记即可对活体类器官进行高分辨率、三维 （3D） 可视化，从而最大限度地减少光毒性并保持样品完整性。基于相位的实时成像允许连续、无标记地跟踪结构和功能变化。通过使用折射率作为固有成像对比度，该方法能够量化生物物理特性，例如体积、蛋白质密度和蛋白质含量。通过机器学习驱动的分割和特征提取进一步处理成像数据，以支持一致的高通量分析。该协议详细介绍了在类器官研究中使用低相干性HT的完整实验工作流程，涵盖类器官制备，成像采集和基于机器学习的数据分析。通过整合计算分割和定量评估，这种方法可以对关键类器官特性进行公正评估，包括活力、结构组织和药物反应。以亚细胞分辨率捕获实时形态变化的能力使该协议高度适用于再生医学、疾病建模和药物筛选中基于类器官的研究。此处概述的分步方法有助于跨不同类器官系统的可重复性和广泛适应。

Introduction

类器官是由干细胞生长的器官的三维 （3D） 小型化版本，能够在体外概括真实器官的关键结构和功能特征 ¹。研究人员已经开发了适用于多种组织（包括肠、脑、肺、肝脏和肾脏）的类器官系统，每种组织都表现出自组织结构和细胞类型多样性，让人联想到体内对应物。通过反映天然器官结构和多细胞复杂性，类器官可以作为研究人类发育、组织再生和疾病机制的强大模型系统¹。它们已成为疾病建模和药物发现的关键工具，使研究人员能够在实验室中探索疾病途径并在患者特异性 3D 组织上测试新疗法²。值得注意的是，类器官在再生医学中也具有前景³：类器官衍生组织可以在体内移植以修复损伤，正如肠道和肝脏类器官所证明的那样，强调了它们恢复器官功能的潜力⁴。这种多功能性使得类器官在现代生物医学研究和个性化医疗中不可或缺。

鉴于其多细胞组成和 3D 结构复杂性，捕获和分析类器官动力学至关重要。然而，传统的成像技术在解析类器官结构和动力学方面面临重大局限性，通常会产生无法代表其完整生理状态的 2D 快照⁵。

明场显微镜是一种广泛使用的非侵入性捕获类器官的方法。它可以方便地监测生长和形态，但在未染色的 3D 样品中提供有限的对比度。此外，它缺乏光学切片，导致内部结构分辨率差。类器官看起来基本上是透明的，阻碍了表面下精细特征的检测⁶。相差通过将相移转换为强度差来增强可见性，在不染色的情况下揭示一般结构（例如，中心腔）。尽管相差可用于实时观察，但存在光晕伪影、低分辨率和有限的穿透深度，使其对较^厚的类器官效果较差7。

连续切片后苏木精和伊红（H&E）染色以及基于抗体的免疫染色广泛用于分析类器官微观结构和^{细胞组成8}。改进的组织处理技术，如福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 和冷冻切片，可增强形态保存，FFPE 可提供卓越的结果⁹。将类器官包埋在琼脂糖等水凝胶中并离心可将多个样品对齐在单个切片中，从而提高分析效率。患者来源的肿瘤类器官的 H&E 染色切片反映了原始肿瘤组织学，而免疫荧光染色突出显示了用于细胞鉴定的 CK8 等标记物¹⁰。然而，这些技术无法监测活的类器官，并且可能会在切片过程中引入组织起皱或变形等伪影。

共聚焦荧光显微镜广泛用于类器官成像，产生高分辨率（亚微米）光学切片，能够详细可视化类器官结构和细胞组成^11,12。然而，3D类器官的共聚焦成像通常仅限于表层（可达100μm深度），并且由于点扫描激光照明¹³，可能非常耗时且具有光毒性。光片荧光显微镜（LSFM）通过仅照亮成像平面克服了其中一些限制，以最小的光漂白和光毒性实现了整个类器官的快速体积成像^14,15;然而，这种技术通常需要清除组织才能对厚标本进行最佳成像。此外，LSFM成像深度受到光散射和折射率（RI）不匹配的限制，这可以通过自适应光学，多视图成像和优化的激发波长¹⁶来减轻。样品安装还会引入结构变形，而大型 3D 数据集在存储和分析方面带来了计算挑战。最近的进展，包括改进的遗传标记技术、新型透明试剂、自适应光学和人工智能驱动的图像分析，正在解决这些局限性，使LSFM在类^{器官研究中}越来越可行7。

尽管取得了这些进步，但 3D 荧光成像技术对活类器官的长期监测提出了一些挑战。首先，荧光标记的使用会引入光毒性作用并扰乱生物过程，给长时间的实时成像研究带来挑战¹⁷。其次，由于致密类器官结构内的扩散屏障，基于抗体的标记渗透有限，需要先进的透化和组织清除方法，使用一抗和二抗需要超过10天的孵育时间¹⁸。第三，类器官中的转染和稳定荧光蛋白表达仍然效率低下，因为传统的基因递送方法在3D环境中苦苦挣扎¹⁹。第四，光学透明技术对于深度成像至关重要，通常会导致荧光信号丢失和组织失真，因此需要优化的透明化方案来平衡荧光的透明度和保存²⁰。

为了解决这些限制，全息断层扫描 （HT） 已被引入，作为一种随着时间的推移以高分辨率对未标记的活类器官进行成像的技术。HT 也称为 3D 定量相位成像，是一种无标记的高分辨率模式，可实现类器官的实时、定量可视化，同时保留其天然生理状态。HT 的原理类似于 X 射线计算机断层扫描;通过在各种照明条件下捕获多个二维光场图像，通过逆波方程求解21,22,23重建未标记样品的三维RI分布。HT已广泛应用于各个生物学领域，包括血液学^24,25、细胞生物学中的相缩合²⁶、微生物学²⁷和组织病理学²⁸。最近，其高分辨率、无标记的3D成像能力已越来越多地用于类器官研究21,22,23,29，为研究其结构和功能动力学提供了一种非侵入性方法。

在这项研究中，我们提出了一个详细的方案，用于使用低相干性HT对小鼠小肠类器官（sIO）进行长期、无标记监测。该方法能够实时可视化 24 小时内的类器官生长和药物反应，同时提供类器官体积、蛋白质密度和蛋白质含量的定量测量，从而促进对类器官行为的严格、数据驱动的分析。为了研究类器官的形态改变，我们用顺铂处理样品，顺铂是一种铂基化疗剂，已知通过形成DNA交联和抑制细胞复制来诱导细胞凋亡³⁰。虽然 3D RI 成像可以捕获结构细节，但系统分析对于量化类器官动力学至关重要。为了实现这一目标，我们集成了ilastik，一个基于机器学习的分割工具包³¹ ，以区分类器官区域与背景。该协议概述了完整的工作流程，包括类器官培养制备、3D HT 采集、基于机器学习的分割以及 RI 断层扫描的定量分析。通过提供可扩展、可重复和无创的成像框架，该方法为类器官研究建立了新标准，在疾病建模、再生医学和药物筛选中具有广泛的应用。

Protocol

注意：材料 表中提供了与本协议中使用的所有材料、仪器和软件相关的详细信息。可以使用来自不同制造商的等效产品作为替代品。整个协议的过程示意图如 图1所示。

1. 样品制备

1. sIO培养基的制备
   1. 根据制造商的说明制备市售培养基。通过0.22μm过滤装置过滤培养基，对培养基进行灭菌。
      注意：如果培养基完全在细胞培养罩中的无菌条件下制备，并且所有组分都经过预灭菌（例如，在无菌瓶和小瓶中提供），则可能没有严格需要通过0.22μm过滤器进行过滤。
   2. 将 15 mL 制备的培养基等分到无菌储存管中。在类器官培养中使用之前，将等分培养基加热至室温（15-25°C）。
2. 解冻 sIO 库存
   1. 使用 37°C 水浴在 2 分钟内快速解冻冷冻类器官原液。将解冻的类器官悬浮液转移到微量离心管中，并以 150 x g 离心 3 分钟以沉淀类器官。
   2. 小心地除去上清液以洗掉 DMSO，最大限度地减少潜在的细胞毒性作用。
   3. 以 1：4 的比例加入培养基和新鲜的细胞外基质 （ECM），轻轻移液以确保沉淀的均匀重悬。在 48 孔板的每个孔中分配每个圆顶 15 μL。将 ECM 放在冰上以防止过早聚合。
   4. 将板倒置在37°C，5%CO₂ 培养箱中1小时，以允许ECM聚合。聚合后，小心地向每个孔中加入 200 μL 新鲜培养基。
      注意：该协议与各种商业成像培养皿和孔板兼容。根据孔类型调整介质体积，确保ECM穹顶完全浸没。
3. sIO的传代
   注意：类器官倾向于粘附在移液器吸头上。为了尽量减少粘附，请用培养基预润湿移液器吸头。
   1. 吸出用过的中等。向每个孔中加入200μL细胞回收溶液，并在4°C下孵育30分钟，以促进ECM降解和类器官修复。
   2. 通过轻柔移液收集类器官悬浮液并将其转移到微量离心管中。以 150 x g 离心 3 分钟，然后小心地除去上清液。
   3. （可选）要作为单个细胞传代，请执行以下解离方法之一：
      1. 酶法：向沉淀中加入100μL单细胞解离溶液，在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育1-2分钟。加入 150 μL 培养基进行中和。进行移液或轻轻敲击。以 150 x g 离心 3 分钟并除去上清液，仅留下沉淀。
         注意：避免过度孵育，因为长时间暴露可能对细胞非常有害。
      2. 机械解离：将沉淀重悬于 200 μL 培养基中。使用 P200 移液器，上下移液 20x-30x，以机械地将类器官解离成更小的片段或单个细胞。以 150 x g 离心 3 分钟，然后吸出上清液并保留沉淀。
   4. 以 1：4 的比例加入培养基和新鲜 ECM，轻轻移液以确保沉淀均匀重悬。在 48 孔板的每个孔中分配每个圆顶 15 μL。
   5. 将板倒置在37°C，5%CO₂ 培养箱中1小时，以使ECM聚合。
   6. 聚合后，向每个孔中加入200μL新鲜培养基，并用PBS填充空的外孔以防止蒸发。每2-3天更换一次培养基，每周传代一次类器官。根据所需的类器官大小调整传代间隔。
4. 药物治疗
   1. 通过将 3.00 mg 顺铂粉末（MW ≈ 300.05 g/mol）溶解在 1 mL DMSO 中，制备 10 mM 顺铂储备溶液。短暂涡旋并使用琥珀色管或用铝箔包裹溶液来保护溶液免受光照。
   2. 为了制备处理培养基，将10mM顺铂储备液在完全sIO培养基中以1：1,000稀释，以获得终浓度为10μM顺铂和0.1%DMSO。
   3. 对于载体对照，在培养基中制备0.1%DMSO以匹配最终DMSO浓度，不含顺铂。
   4. 从 sIO 培养物中取出用过的培养基，并轻轻地用 10 μM 含顺铂的培养基或仅含 DMSO 的对照培养基替换。
   5. 处理后，将样品转移到成像系统培养箱中。

2. 使用作软件进行低相干全息断层扫描成像

1. 用于成像的样品制备
   1. 按照步骤 1.3.1-1.3.4 中描述的程序，将 15 μL 类器官 ECM 圆顶分配到 #1.5 盖玻片底部成像培养皿上。将每个圆顶放置在培养皿中，尽可能靠近中心，以获得最佳成像效果。
   2. 聚合前，在室温下孵育1分钟，使类器官沉降到底部。
   3. 将板倒置在37°C，5%CO₂ 培养箱中1小时以聚合ECM。然后，轻轻加入足够的培养基以完全浸没类器官。
      注意：根据盖玻片底部成像皿的大小调整培养基体积以确保类器官完全浸没。
   4. 在传代后 5 天，在成像前立即用 PBS 洗涤样品 2x-3x，以去除碎片并减少光学伪影。
2. 成像设置
   1. 打开环境控制器以保持样品活力。腔室控制器单元自动调节温度至 37 °C，CO₂ 浓度调节至 5%。
   2. 按仪器正面的 门按钮打开门。加水在腔内孔内形成一层薄层，以防止培养基变干。
   3. 将成像盘放入适当的容器支架中，将其插入成像室，并使用销钉固定以防止移动。确保盘子牢固地固定在容器支架上，不要倾斜。
   4. 使用 门 按钮关闭仪器的门以阻挡外部光线干扰。
   5. 启动 TomoStudio X 软件并登录。单击 “开始” 以打开主窗口。
   6. 单击左上角的添加 项目 并分配实验参数（例如，项目名称、培养基类型、样品类型等）。试样面板将自动创建。确保为在实验中使用适当的 RI 分配了正确的培养基类型。
   7. 单击面板中的 “所需孔 ”，然后单击顶部的“ 创建 ”以将孔注册为标本。
   8. 单击右上角的 ROI 设置 以定义培养皿中的感兴趣区域 （ROI）。设置完所有参数后，单击右下角的 运行实验 以打开图像采集窗口。
   9. 单击右上角的 装载容器 。将出现明场图像。使用 +Z 和 -Z 按钮调整 Z 位置进行对焦。
   10. 在“单次映像”选项卡中，调整 ROI 大小。在 160 μm x 160 μm 视场内捕获类器官，并获取深度达 140 μm 的轴向堆栈。对于较大的类器官，通过选中底部的 “平铺成像 ”复选框来获取多个 RI 断层扫描和拼接图像。
   11. 导航到延时成像选项卡以配置长期成像。根据需要设置持续时间和间隔时间。在该实验中，在 24 小时内以 10 分钟的间隔进行延时成像，并在相同的持续时间内以 2 小时的间隔进行分析。
   12. 单击 “扫描” 图标以捕获当前的 ROI 位置。使用明场成像手动将 ECM 圆顶居中。单击 BF 按钮调整明场成像的强度和曝光值。
   13. 通过移动“预览”面板中显示的 ROI 框来选择 ROI 。找到所需的 ROI 后，单击底部的 添加点 。将出现成像点列表。
   14. 单击 获取 开始成像。将采集原始图像数据。
3. 图像采集
   注意：此过程从原始图像数据生成 Tomocube 通用文件 （TCF）。原始图像数据必须处理成 TCF 文件，其中包含多种类型的图像，例如 RI 断层扫描和最大强度投影。RI断层扫描表示样品的3D RI分布，最大强度投影显示XY平面中每个横向位置的最高RI值。
   1. 将原始图像文件拖放到 HTX 处理服务器。单击 “处理 ”以从原始图像文件生成 TCF 文件。
   2. 要查看 TCF 文件中生成的 RI 断层图，请使用 TomoAnalysis Viewer、MATLAB 或 Python。要在 MATLAB 中查看 TCF 文件，请使用 h5info 和 h5read 等函数。同样，在 Python 中，使用 h5py 包来读取 H5 文件。

3. 图像分析

1. 基于机器学习的图像分割
   1. 将 TCF 图像文件导出为 HDF5 格式（补充编码文件 1），以确保数据采用与 ilastik 兼容的多维格式。
   2. 打开 ilastik 并导航到 文件>新项目。选择 像素分类 在 分段工作流程 部分下。将项目文件保存在指定的目录中。
   3. 通过导航到 1 加载 HDF5 文件。输入数据选项卡。单击“ 添加新文件”，选择适当的 H5 数据集，并确保分配了正确的图像通道。
   4. 导航到 2。特征选择选项卡可选择相关特征（颜色/强度、边缘、纹理）以优化分割。
      注意：特征选择可能因数据集和图像特征而异。对于当前分析，所选特征包括：颜色/强度 （σ = 1.60）、边缘 （σ = 3.50） 和纹理 （σ = 1.60）。根据图像复杂性，可能需要基于启发式方法进行优化。或者，ilastik 中的 建议特征>运行特征选择 功能可用于识别一组最佳参数。
   5. 在 3.训练选项卡，通过应用不同颜色的笔触来标记类器官和非类器官区域。要提高分割保真度，请仔细注释边界周围的区域。
   6. 单击 实时更新 预览分割结果并根据需要进行优化。
   7. 导航到 4。预测导出。在“源选择”中，选择 “简单分段” 以导出标记的预测。单击 全部导出，确保输出格式设置为 .h5 或 .tiff，具体取决于下游分析要求。
2. 定量特征分析
   注意：此协议步骤在 MATLAB 中执行，每个过程在 补充编码文件 2 中详细说明。
   1. 通过将 RI 断层扫描与掩模图像相结合，创建仅包含类器官区域的掩蔽 RI 图像。
   2. 使用掩蔽的 RI 图像，计算定量参数，例如类器官体积、蛋白质密度和蛋白质含量。
      1. 体积：通过将分割掩模中的像素数乘以 X、Y 和 Z 的像素分辨率来计算类器官的总体积。使用内置的 MATLAB 函数 Sum 通过计算类器官标记掩模数组中的所有体素值来计算像素数。
         注意：像素分辨率由成像系统决定，可以在 HDF5 结构内的数据 > 3D 属性 组下找到。
      2. 蛋白质密度：通过从平均类器官 RI 中减去培养基 RI 值并将其除以蛋白质折射率增量来计算蛋白质密度。
         1. 介质 RI：在分析前使用折光仪测量周围介质的 RI。
         2. 平均 RI 值：通过平均位于类器官掩膜内的体素的 RI 值来确定类器官的平均 RI。
         3. 蛋白质折射率增量 （α）：使用先前报告的从折射率增量研究中得出的经验常数。
      3. 蛋白质含量：通过将步骤 3.2.2.1 中确定的体积乘以步骤 3.2.2.2 中获得的蛋白质密度来计算总蛋白质含量。

Results

图 1 说明了 sIO 的 4D 成像和定量分析的示意性工作流程。该协议通过四步过程实现连续实时成像和 sIO 综合评估：培养、4D 成像、图像处理和定量分析（图 1D）。

经过5天的孵育期后，将成熟的sIO转移到盖玻片底部的成像培养皿中，以使用低相干全息断层扫描（HT）进行可视化（图1A）。该成像技术通过反卷积算法重建RI断层扫描（图1B），从而能够对活类器官进行高分辨率、无标记的成像。

随后使用机器学习辅助分割方法进行图像处理，促进精确的结构描绘（图1C）。首先，将原始RI断层扫描转换为HDF5格式，以与基于交互式机器学习的分割工具ilastik兼容。在ilastik中，体素级分类被训练以生成选择性识别类器官结构的类器官掩模。将...

Discussion

全溶学为活类器官的无标记、高分辨率成像提供了一种强大的方法，克服了与传统成像技术相关的许多挑战。在该协议中，我们描述了一种将低相干性HT应用于sIO研究的综合方法，从而能够实时、定量地可视化类器官形态，生长动力学和对药物治疗的反应。基于机器学习的分割和定量分析的集成进一步增强了这种成像方法的分析能力，提供了对类器官行为的公正、可重复的评估。

HT 的一个主要优点是它能够在不需要荧光标记的情况下可视化天然状态的活类器官。传统的基于荧光的成像方法，如共聚焦和LSFM，需要染色或基因标记，这会引入光毒性，影响类器官生理学，并限制实时成像的持续时间。此外，基于抗体的标记在致密类器官结构内存在扩散屏障，需要延长孵育时间 ^6,7。HT 通过利用 RI 作为内在对比机制来规避这些挑战，允许在亚细胞分辨率下对类器官生长和分化进行非侵入性、纵向监测。

我们的结果...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48孔板	康宁	3548	培养菜
细胞回收液	康宁	354253	基质胶降解
顺铂	苏佩尔科	PHR1624	不适用
二甲基亚砜 （DMSO）	西格玛-奥尔德里奇	D2650型	车辆
Eppendorf 管	康宁	MCT-175-CS	不适用
火币HTX处理服务器	Tomocube Inc.，韩国	不适用	数据处理服务器
HT-X1型	Tomocube Inc.，韩国	不适用	作软件
伊拉斯蒂克	不适用	不适用	基于机器学习的细分工具包
成像碟容器支架	Tomocube Inc.，韩国	不适用	成像碟支架
IntestiCult类器官生长培养基（小鼠）	干细胞技术	#06005	市售预制培养基
马特实验室	MathWorks	Matlab 2024a	图像处理软件
基质胶	康宁	356231	用于 3D 类器官的 ECM
毫孔 Steritop 真空瓶顶过滤器	默 克	S2GPT05RE	0.22 & 亩;用于介质灭菌的 M 过滤装置
Mouse Intestinal Organoids	干细胞技术	#70931	不适用
折射计	爱宕	R-5000型	折射率计算器
托莫迪什	Tomocube Inc.，韩国	901002-02	#1.5 盖玻片底成像盘
TomoStudio X	Tomocube Inc.，韩国	不适用	成像软件
TrypLE	吉布科	12604	单细胞解离