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濒危药用兰科植物的非共生萌发及叶片外植体再生 Hemipilia cucullata 从成熟种子中

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DOI：

10.3791/68541

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2025年9月19日

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1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

本文内容

摘要

本文介绍了一种优化盔唇兰（Hemipilia cucullata）无菌播种、幼苗发育及茎伸长的实验方案。该方案还可诱导无菌叶片外植体形成原球茎样结构，从而促进这种濒危药用兰科植物的高效离体繁殖，为其保护与可持续利用提供技术支持。

摘要

Hemipilia cucullata（兰科）是一种陆生兰，因其药用价值和观赏价值而广受重视，但由于生境退化、种子活力低以及授粉成功率有限，其野生种群已处于濒危状态。为支持该物种的保护与可持续利用，本研究建立了一套优化的无菌培养体系，用于成熟种子的非共生萌发、原球茎发育、茎伸长以及无菌叶片外植体诱导原球茎样体 (PLB)。在添加0.5 mg/L NAA的1/2 MS液体培养基中培养种子，萌发率达到72 ± 6%，显著高于对照组（46%）和固体培养基（31%），且液体培养中萌发起始时间比固体培养提前约21天。将原球茎转接至含有0.5 mg/L BA、0.2 mg/L NAA和100 mL/L椰子水的B5培养基中，可实现高效增殖。经过5至6周后，将小植株转移至茎伸长培养基（B5添加0.5 mg/L BA和1 mg/L NAA），在此条件下植株表现出显著的茎伸长和健康的叶片形成。在PLB诱导中，MS培养基中添加BA（3 mg/L）和NAA（0.2 mg/L）时诱导率最高，达到44.3 ± 5.1%。该系统化且可重复的培养方案可作为大规模繁殖和迁地保护H. cucullata的有效平台，为这一濒危兰科植物的恢复工作提供重要支持。

引言

Hemipilia cucullata（L.）Y.Tang、H.Peng & T.Yukawa，俗称兜状鸟舌兰，是一种原产于温带欧亚大陆的野生陆生兰科植物，广泛分布于从波兰到日本的地区1。该物种最初归入鸟舌兰属（Neottianthe），但根据分子证据，最近被重新归入红门兰属（Hemipilia）的鸟舌兰组（section Neottianthe）2。该植物从地下块茎生长，株高可达30 cm，开粉红色或紫红色的花朵，排列成单侧总状花序。由于其花朵形态优雅、色彩美观，具有较高的观赏价值。此外，该植物整体在多个国家被认定为药用植物，广泛用于多种治疗目的，包括治疗心脏疾病、促进血液循环、缓解瘀伤以及促进骨折愈合3,4。近年来的植物化学研究表明，该物种含有多种花青素，如矢车菊素-3-草酰基葡萄糖苷、菊花素（chrysanthemin）和蓝靛果苷（cyanin），这些成分具有抗氧化和血管保护作用，可能与其药用功效相关5,6。

目前，H. cucullata 的野生种群正面临生境丧失和环境干扰的威胁，导致种群数量严重下降，在某些地区甚至濒临灭绝3,7,8。然而，由于该物种自然繁殖困难，其保护工作尤为具有挑战性。在自然条件下，H. cucullata 可通过无性繁殖和有性繁殖两种方式进行繁殖，但两种方式效率均较低。自然无性繁殖速度缓慢且发生频率低，而有性繁殖则受限于授粉成功率低和种子活力差9,10。此外，野外调查发现其年龄结构显著失衡，幼年个体稀少，自然更新能力有限，尤其是在人为干扰或火灾等胁迫条件下更为明显7,8,11。H. cucullata 的种子与其他许多兰科植物类似，微小且无胚乳，萌发依赖特定的真菌共生体，这进一步增加了自然再生的难度。因此，尽管该物种地理分布广泛，其野生种群的规模和年龄结构仍在持续衰退，局部灭绝的风险日益增加7。因此，建立高效的离体快速繁殖技术，对于该兰科物种种质资源的保护及其可持续利用均具有重要意义。

在现有的繁殖技术中，共生萌发——依赖于与兰科菌根真菌的共生关系——能够较好地模拟自然过程，但由于其依赖物种特异性的真菌伙伴，往往难以标准化12,13,14。相比之下，非共生萌发操作更简便且可重复性更高，因而在兰科植物组织培养体系中被广泛应用15。尽管已针对多种药用兰科植物（如Bletilla、Dendrobium和Cypripedium）建立了非共生萌发及快速繁殖方案16,17,18,19，但对于H. cucullata，仍需对其培养基及组织培养条件进行物种特异性的优化。

本研究采用中国东部天目山（北纬30°20′，东经119°22′）野生个体经人工异花授粉获得的H. cucullata成熟种子（图1A），建立并优化了一套高效的无菌种子萌发、幼苗发育及茎伸长培养方案。此外，我们还通过原球茎（PLBs）诱导，建立了以叶片外植体为基础的植株再生体系，从而为这一濒危药用兰科植物的保育与栽培提供技术支持。

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方案

注意：实验开始前，应穿戴个人防护装备，包括手套、实验服和护目镜。所有操作均须在超净工作台内进行，以保证无菌环境。使用乙醇和次氯酸钠时需谨慎操作，并根据实验室安全规定妥善处理废弃物。

1. 荚果灭菌与种子提取

  1. 将胶囊放入烧杯中，加入1-2滴去污剂，用自来水彻底冲洗，以去除表面污染物。
  2. 在流动水下清洗胶囊5分钟，用无菌吸水纸吸干表面水分。
  3. 将胶囊转移至无菌操作台进行进一步消毒。
  4. 将胶囊浸入75%（v/v）乙醇中30秒。
  5. 将胶囊浸入50 mL 20%（v/v）次氯酸钠溶液（由市售含约5%有效氯的漂白剂稀释而成）中，并加入2滴未稀释的家用洗洁精，消毒10-12分钟。
  6. 用无菌蒸馏水冲洗胶囊5次，以去除残留的消毒剂。
  7. 使用无菌解剖刀，从胶囊的顶端和底部（柄端）各切除约1 mm。
  8. 在胶囊上端做一小切口以暴露种子，将胶囊置于无菌培养皿中进行种子提取。

2. 培养基制备

  1. 配制1/2 MS液体培养基：使用标准MS培养基中大量元素浓度的一半，其余成分与MS培养基相同，添加20 g/L蔗糖和α-萘乙酸（NAA，0.5 mg/L），调节pH至5.8。
  2. 煮沸后，立即将培养基分装至500 mL的培养瓶中（培养瓶数量可根据所需繁殖规模进行调整）。
  3. 将分装好的培养基放入高压灭菌锅中，在121 °C下灭菌15 min。灭菌完成后，从高压灭菌锅中取出培养基，冷却至室温后即可使用。

3. 种子萌发

  1. 使用无菌镊子将约500–600粒种子均匀分散至每瓶培养基中（步骤2.3中制备）。让种子吸水并沉降至液体培养基底部。
  2. 将培养物置于25 °C条件下，保持12小时光照/12小时黑暗的光周期，光照强度为36 µmol·m-2·s-1。
  3. 每周观察种子萌发情况，记录形态变化，并拍照存档。
  4. 约12周后，当大部分种子已萌发时，统计萌发种子数量并计算萌发率。使用无菌接种环随机取一环含有种子的液体培养基，将所取样品转移至培养皿或载玻片上，在体视显微镜下进行观察。
  5. 将已形成原球茎的种子计为已萌发种子。使用以下公式计算萌发率：
    萌发率 (%) = (萌发种子数/样品中种子总数) × 100。

4. 原球茎继代培养与增殖

  1. 通过在B5培养基（3.21 g/L）中添加椰子水（100 mL/L）、6-苄氨基嘌呤（BA，0.5 mg/L）和萘乙酸（NAA，0.2 mg/L）配制增殖培养基。加入20 g/L蔗糖和7.3 g/L琼脂，并将pH值调节至5.8。
  2. 煮沸后，立即将培养基分装至150 mL的培养瓶中（培养瓶数量可根据所需繁殖规模进行调整）。
  3. 将分装好的培养基放入高压灭菌锅中，在121 °C下灭菌15 分钟。待培养基冷却至室温后方可使用。
  4. 每瓶无菌接种10–15个已萌发的原球茎（大小为0.3–1 cm），接种于步骤4.3中制备的培养基上。
  5. 经过5周的培养后，评估增殖情况，并记录每瓶中新形成的原球茎数量。
  6. 继续培养增殖后的原球茎4–6周，使其发育成具有明显茎尖和根状结构的小植株，之后转移至促茎伸长培养阶段。
    注意：培养条件保持在25 °C，光照周期为12小时光照/12小时黑暗，光照强度为36 µmol·m-2·s-1。

5. 茎伸长

  1. 通过在B5培养基（3.21 g/L）中添加BA（0.5 mg/L）和NAA（1 mg/L）来配制茎伸长培养基。加入20 g/L蔗糖和7.3 g/L琼脂，并将pH值调节至5.8。
  2. 煮沸后，将培养基分装至150 mL的培养瓶中（培养瓶的数量可根据所需繁殖规模进行调整）。
  3. 选择健康、大小为1–2 cm、无明显褐化或完全黄化的幼苗用于茎伸长培养。使用已灭菌并冷却的镊子，将8–12株幼苗无菌转移至每个含有步骤5.1所配制新鲜培养基的150 mL培养瓶中。确保每瓶中的幼苗分布均匀。
  4. 经过5周的茎伸长培养后，选取具有充分发育茎段和健康叶片的幼苗用于叶片外植体取样。
    注意：将培养物置于25 °C条件下，保持12小时光照/12小时黑暗的光周期，光照强度为36 µmol·m-2·s-1。

6. 由叶片外植体诱导原球茎

  1. 通过在MS基本培养基（4.43 g/L）中添加BA（3 mg/L）和NAA（0.2 mg/L）配制原球茎（PLB）诱导培养基。加入20 g/L蔗糖和7.3 g/L琼脂，并将pH值调节至5.8。
  2. 煮沸后，将培养基分装至150 mL的培养瓶中（培养瓶数量可根据所需繁殖规模进行调整）。
  3. 在茎伸长培养5周后（步骤5.4），选取健康无菌苗，切取完全展开的无菌叶片，去除顶端区域和叶缘，并在无菌条件下用无菌解剖刀将每片叶片切成约0.5 cm × 0.5 cm的小片。
  4. 将10片叶段接种于PLB诱导培养基上，使近轴面朝上，确保与培养基表面紧密接触。
  5. 培养5周后，统计成功诱导出的原球茎（PLB）数量，并计算诱导率（%）。同时记录平均芽高（cm）及每个外植体形成的芽数量。
    注意：培养条件为25 °C，光照周期为12 h光照/12 h黑暗，光照强度为36 µmol·m-2·s-1。

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结果

本研究中呈现的实验方案步骤代表了通过一系列比较实验优化后建立的方法，旨在提高H. cucullata的非共生种子萌发、原球茎增殖、茎伸长以及原球茎样体（PLB）诱导效果。例如，在选择植物生长调节剂（PGRs）以促进种子萌发时，萘乙酸（NAA）可促进胚胎发育和水分吸收，而6-苄氨基嘌呤（BA）则促进芽的分化和细胞分裂。研究表明，二者具有协同作用，可提高兰科植物种子培养中的萌发率和幼苗早期生长表现17。本方案的每个阶段均基于重复实验所得的性能指标、统计分析结果以及形态学观察进行了优化。

种子萌发条件的优化
为了优化 H. cucullata 的种子萌发条件，开展了一项双因素完全随机试验，比较了两种培养基类型（液体与固体 ½ MS 培养基）和四种植物生长调节剂（PGR）处理方式——对照组（无 PGR）、NAA（0.5 mg/L）、BA（0.5 mg/L）以及 BA（0.5 mg/L）+ NAA（1.0 mg/L）组合处理。该因子设计可同时评估培养基类型和植物生长调...

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讨论

兰科植物的蒴果通常含有大量种子，常超过一万个，但由于缺乏胚乳，且高度依赖共生真菌关系和特定环境信号，其自然萌发极为有限20。因此，无菌萌发技术被广泛采用，以克服这些限制，并在受控条件下实现高效的幼苗繁殖。例如，Chen 等人15报道，在使用MS培养基并进行初始14天暗处理的条件下，Bletilla的萌发率可达93%。此外，已有研究提出一种通用培养基（1/2 MS添加5%椰子水），可用于多种陆生兰科植物的无菌萌发21,22。然而，萌发成功率仍具有物种特异性，并显著受培养基成分影响，尤其是植物生长调节剂（PGRs）的种类和浓度。Gogoi 等人23证明，在MS培养基中添加15 µM BA（约3.38 mg/L）和NAA（约2.79 mg/L）可显著增加Cymbidium eburneum的芽数量和伸长；而 Robinson 等人报道，在KC培养基中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含维生素的1/2 MS基础盐CoolaberPM1061
6-苄氨基嘌呤上海麦克林生化科技有限公司1214-39-7
琼脂粉北京百灵威科技有限公司1400
超净工作台苏州净化设备有限公司SW-CJ-2G
椰子水GOOD FARMERhttps://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
洗涤剂立白科技6920174756784
Gamborg B5 培养基PhytoTechnology LaboratoriesG398
玻璃瓶默百特生物科技有限公司MBT-BL-240
Murashige & Skoog 基础盐PhytoTechnology LaboratoriesM519
移液器Eppendorf3123000268
精密天平METTLER TOLEDO30834109
SPSS国际商业机器公司用于统计显著性检验的软件
蔗糖国药集团化学试剂有限公司20210802
噻二唑脲上海麦克林生化科技有限公司51707-55-2
α-萘乙酸上海麦克林生化科技有限公司86-87-3

参考文献

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