方法文章

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

DOI：

10.3791/68568

⸱

2025年8月6日

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1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

电子显微镜（EM）尤其是三维（3D）EM技术，已成为结构病毒学中的成熟方法。研究病毒引起细胞超微结构的改变，例如寨卡病毒（ZIKV）诱导的复制工厂或冠状病毒的复制细胞器，需要进行三维成像。尽管透射电子显微镜（TEM）断层扫描是一种广泛应用的方法，但其仅限于厚度不超过200 nm的样品。聚焦离子束-扫描电子显微镜（SEM）断层扫描能够以各向同性的方式获取更大体积的三维数据，尽管其分辨率通常较低。其他技术，如块面-扫描电子显微镜（BF-SEM）、SEM阵列断层扫描或连续超薄切片的TEM成像，也可用于大体积样本的成像。然而，与前述技术相比，这些方法在样品Z轴方向上的分辨率显著降低。一种能够在样品厚度达1 µm的情况下提供各向同性、分辨率达数纳米的三维信息的技术是扫描透射电子显微镜（STEM）断层扫描。

本文介绍了一种用于制备高压冷冻、冷冻置换并树脂包埋的病毒学样品，并利用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对其进行分析的实验方案。该方法在室温下成像，兼具保留生物超微结构近天然状态的优势。我们展示了两个可通过STEM断层成像技术解答科学问题的代表性实例。首先，应用该方案研究重组水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）的病毒粒子形态发生过程。STEM断层图像提供了有关重组VSV出芽过程的信息，而这些信息无法通过传统的二维成像技术获得。其次，我们展示了结合荧光共振能量转移（Foerster resonance energy transfer, FRET）成像与STEM断层成像技术（FRET-3D-CLEM）的关联光镜与电镜（correlative light and electron microscopy, CLEM）分析，用于研究EF-C肽纳米纤维。这一近期发表的技术组合为感染增强型肽纳米纤维的细胞摄取与解聚过程提供了新的见解，尤其得益于STEM断层成像可获取较大体积的三维结构信息。

引言

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比较显微镜设置中分辨率、仪器和操作难度的冷冻STEM断层成像示意图。
图1：不同三维显微技术的比较，考虑了分辨率、仪器、采集时间和操作难度。 这些技术可实现的最大可行体积介于技术要求较高的冷冻透射电子显微断层成像（可达到分子分辨率）与光学显微成像（其分辨率受限于光的衍射极限）之间。缩写：TEM = 透射电子显微镜；STEM = 扫描透射电子显微镜；SEM = 扫描电子显微镜；FIB = 聚焦离子束。请点击此处查看该图的放大版本。

与病毒相关的结构和系统所涉及的尺度范围从亚埃级别（例如用于病毒治疗的小分子、分离的病毒蛋白）到数米级别（例如完整的感染生物体）。病毒颗粒的尺寸范围为20–1,000 nm，通常在其生物学背景下进行研究，例如宿主细胞和病毒生产细胞系，这些细胞的尺寸在微米（µm）量级。因此，对特定病毒相关结构的可视化依赖于选择能够提供足够视场和适当分辨率的技术。对病毒感染细胞和组织样本的研究主要依赖显微镜技术（图1）。虽然细胞和组织的概览图像可通过传统的光学显微镜获取，但参与病毒复制的细胞内结构通常采用电子显微镜（EM）进行研究。尽管目前电子显微镜主要用于基础病毒学研究，但它也应用于临床诊断1,2，并在生物制药领域得到了应用3。

通常，经典的透射电子显微镜（TEM）等二维电子显微镜（2D EM）方法无法充分回答特定的生物学问题。在病毒学研究中，当涉及病毒与宿主细胞相互作用的研究时尤其如此，例如病毒粒子的吸附与入侵、病毒工厂的形成或病毒粒子的形态发生4,5,6,7,8,9。因此，电子显微镜断层扫描技术（EM tomography）被用于分析生物样本的三维超微结构。原则上，获取某一特定样本断层图像的方法有两种：1）对连续切片进行逐步成像，随后将图像组合成三维图像序列；或 2）从样本的不同视角获取投影图像，再通过计算方法将这些信息重建为虚拟的三维图像序列。

第一类技术包括通过透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）对连续切片进行成像（SEM阵列断层成像）、连续块面SEM以及聚焦离子束（FIB）-SEM断层成像。连续切片的SEM和TEM成像在Z轴方向上的分辨率较低，受限于切片厚度，但其具有较大的视场，并依赖于大多数电镜实验室中普遍配备的设备4。FIB-SEM断层成像可实现各向同性的分辨率，但仪器及维护成本较高，且以各向同性分辨率对整个细胞进行成像耗时较长9,10。

第二种断层扫描技术完全依赖于电子束穿过样品的透射。该技术可通过两种不同的成像模式实现：透射电子显微镜（TEM）或扫描透射电子显微镜（STEM）。尽管TEM断层扫描应用更为广泛且易于实施，但其切片厚度受限于约200 nm。因此，对于线粒体、囊泡或病毒颗粒等尺寸超过切片厚度的结构，无法在一个单一的断层图像中完整成像。STEM断层扫描则能够对厚度达1 µm的样品进行成像11,12。然而，该技术需要配备高加速电压（≥200 kV）的STEM，以及支持高倾转角度和小半收敛角的装置13。尽管STEM成像在材料科学中是一种常用技术，但在生物电子显微镜实验室中仍属罕见。

本文介绍了一种以应用为导向的方法，利用扫描透射电子显微（STEM）断层成像技术对病毒学样品进行研究。由于电子显微断层成像技术具有高度复杂性和劳动密集型特点，高质量的样品制备至关重要。尽管低温透射电镜（冷冻电镜断层成像）无疑是分子水平研究的金标准，但在室温下对高压冷冻并经冷冻置换的细胞进行成像，仍能良好地保存并清晰显示细胞的超微结构7,14。简言之，将贴壁细胞培养于蓝宝石圆片上，并按实验需求进行感染或其他处理。随后通过高压快速冷冻使细胞固定，实现细胞内水分的玻璃化。接着在保持样品对比度的同时，将水分逐步替换为溶剂，并缓慢恢复至室温。最后将样品逐步包埋于树脂中。

高压冷冻和冷冻置换的实验方案有多种，这些方案在设备、载体系统以及样品组成上有所不同。已有多个关于高压冷冻的详细实验方案发表，其中包括Walther等人15发表的方案，以及Steyer等人16发布的视频方案，后者重点介绍利用微波辅助增强对比度进行FIB-SEM组织制备的方法。在病毒学研究方面，Read等人17和Romero-Brey18发表了利用蓝宝石盘进行病毒感染细胞高压冷冻制备，并随后通过电子断层扫描技术进行分析的详细实验方案。超薄切片技术也已有先前文献描述15,17。有关这些方法的更多细节，请参考所引用的文献。

本文介绍的工作流程是在先前发表的方案15,17基础上进行改进和更新的版本，并首次配以详细的视频指南。该方案提供了利用高压冷冻、冷冻置换以及环氧树脂包埋进行样品制备的工作流程。使用超薄切片机切割厚度为800 nm–1,000 nm的切片。利用200 kV扫描透射电子显微镜（STEM），结合EM tools软件采集倾转系列图像。本方案针对贴壁细胞进行了优化，提供了完整的工作流程，同时允许针对其他类型的样品（如组织或悬浮细胞）进行适当调整。如需进行低温条件下的STEM断层成像，请参考Michael Elbaum研究团队的工作19,20。

方案

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1. 细胞培养

  1. 蓝宝石圆盘的制备
    1. 用100%乙醇清洗蓝宝石圆盘3次，每次20分钟，以清洁圆盘。将圆盘在干燥滤纸上轻轻拖过，去除残留乙醇。将圆盘置于37 °C干燥箱中至少30分钟，或直至完全干燥。
      注意：本方案中使用的蓝宝石圆盘直径为3 mm，厚度为0.16 mm。对于其他系统（如组织或悬浮细胞）的优化流程，请参见Walther等人的研究15。McDonald等人21还提供了针对培养细胞及其他系统的若干“技巧与提示”。
    2. 将约50个蓝宝石圆盘平放在洁净的表面皿上，使用碳镀膜仪在其表面镀上一层10–15 nm厚的碳膜，完成碳镀。随后在120 °C下烘烤过夜，以稳定碳层。
      注意：对于相关显微镜（correlative EM）方法，建议引入坐标系统：在碳镀前将定位网格置于蓝宝石圆盘上方，使该网格在圆盘上呈现为负像21。
    3. 为便于后续识别蓝宝石圆盘的碳镀面，可用尖锐工具（例如镊子尖端）在碳层上划出标记，该标记仅从一侧可正确读取。
      注意：我们建议使用数字“2”或类似符号（图2A、B）。若蓝宝石圆盘已带有镀膜坐标系统，则可跳过此步骤。
    4. 将蓝宝石圆盘储存于37 °C干燥箱中，待后续使用。
      注意：不建议重复使用蓝宝石圆盘，因其在高压冷冻过程中更易破裂。
  2. 细胞培养
    1. 在将圆盘放入细胞培养前不久，使用辉光放电仪对圆盘的碳镀面进行辉光放电处理，使其具有亲水性（例如，在0.26 mbar条件下，20 mA电流处理40秒）。随后通过紫外线照射15分钟对圆盘进行灭菌。
      注意：紫外线照射超过30分钟可能损伤碳镀层。
    2. 使用无菌镊子将圆盘放置于含培养基的培养皿底部，确保圆盘不会漂浮。小心地将细胞接种于圆盘表面。若蓝宝石圆盘在细胞培养基中发生漂浮，可在重复实验时延长辉光放电时间。
      注意：必须确保标记“2”方向正确，即碳镀面朝上。期望在圆盘上形成最终汇合度约为80%的单层细胞。细胞在蓝宝石圆盘上的生长情况可能与培养皿其他区域不同。在继续实验流程前，应使用倒置光学显微镜检查圆盘上细胞的分布与质量。接种细胞时可轻轻摇动培养板，以改善细胞分布。
      对于悬浮细胞，可使用聚-L-赖氨酸包被碳镀蓝宝石圆盘，或使用毛细管，具体方法见文献15。切勿将已包被聚-L-赖氨酸的圆盘暴露于紫外光下，以免破坏聚-L-赖氨酸涂层。
    3. 在保持蓝宝石圆盘位置不变的前提下，对细胞进行所需处理（例如感染、药物处理）。操作时需小心，避免细胞脱落或碳层被刮伤。根据实验要求孵育细胞。在将样品转移至高压冷冻仪前，根据当地规定进行化学预固定处理，例如使用2.5%戊二醛、1%蔗糖溶于0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.3），或4%多聚甲醛1,7,22。
      注意：感染性样品离开生物安全等级实验室前，必须遵守适用于该模型系统的全部本地生物安全规定。

纳米材料制备装置；显微镜、沉积过程、实验室分析设备。
图 2：高压冷冻。（A）显示碳涂层标有“2”（左）或用于相关光镜与电镜的坐标系统（右）的蓝宝石盘。（B）用于高压冷冻的SD-金垫片-SD三明治结构示意图。细胞生长在蓝宝石盘上，面对面放置，在密闭腔内受到保护。（C）用于高压冷冻的样品夹持器，内含一个SD三明治结构。（D）装载高压冷冻夹持器所需的材料与设备：（1）加热板，（2）体视显微镜，（3）滤纸，（4）含有1-十六碳烯的反应管，（5）镊子，（6）未镀膜的SD，（7）装有金垫片的培养皿，（8）高压冷冻夹持器。（E）高压冷冻系统的设置：（1）用于转移冷冻样品的液氮盒（另见F），（2）吹风机，用于加快冷冻后夹持器的升温，（3）液氮杜瓦瓶，用于补充液氮盒中的液氮。（F）高压冷冻后用于存放冷冻样品的液氮盒，中央设有凹槽（虚线轮廓），可在其中打开高压冷冻夹持器，并安全操作SD。高压冷冻后直接需要的材料：（1）可容纳最多六个样品容器的支架，（2）隔热镊子，（3）带盖的样品容器。容器上设有小孔和小重物（例如螺丝），以便其浸入液氮中。缩写：SD = 蓝宝石盘；HPF = 高压冷冻仪；LN = 液氮。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 透射电子显微镜样品制备

  1. 高压冷冻
    注意：本方案描述了使用指定高压冷冻仪（HPF，材料表）进行高压冷冻的操作。其他型号的设备虽然可能略有差异，但其基本功能相同，因此操作步骤应大致一致。
    1. 按照制造商的说明设置高压冷冻仪。确保有充足的液氮供应（图2E），开启设备，并进行一次测试运行。
    2. 准备一个用于将圆盘装入HPF样品夹的工作台（图2D）。准备好以下物品：加热板（1）、体视显微镜（2）、滤纸片（3）、装有十六碳烯作为填充剂的反应管（4）、镊子（5）、未镀膜的空白蓝宝石圆盘（用于冷冻奇数个带细胞的SDs，6）、金制垫片（7）以及HPF样品夹（8，细节见图2C）。
    3. 准备一个处理冷冻样品的工作区（图2E、F）。在开始高压冷冻前，准备以下设备：
      1. 准备好LN-box并注入液氮（图2E、F），以便将冷冻后的蓝宝石圆盘从HPF样品夹转移至储存胶囊中。
      2. 准备一个小杜瓦瓶（图2E中的3），并注入液氮：在冷冻过程中需多次补充LN-box中的液氮，应提前做好准备。
      3. 准备好隔热镊子（图2F中的2）。
      4. 准备用于存放高压冷冻后蓝宝石圆盘的样品容器（储存胶囊，图2F中的3）。确保容器带有盖子，并有多个孔洞以便液氮流入，同时配备小重物（如小螺丝或其他类似物）以防止其漂浮。使用前对容器进行标记，并在LN-box中预冷。
        注意：我们使用BEEM胶囊作为储存胶囊。
    4. 若细胞未经过预固定，或无法维持培养条件，则应将样品置于靠近高压冷冻仪的培养箱中，或置于加热板上（图2D中的1），以尽可能长时间地维持生理条件（37°C，5% CO2）。
    5. 在开始高压冷冻前，检查蓝宝石圆盘上的细胞数量是否充足，细胞状态是否良好。可通过倒置光学显微镜观察圆盘来完成此项检查。
    6. 执行高压冷冻操作。
      1. 用镊子从培养皿中取出一个蓝宝石圆盘，将其放入HPF样品夹中（图2C），碳涂层面向上（“2”字样可读）。在此之前，通过将圆盘快速轻触滤纸去除多余培养基，但注意不要让细胞干燥。
      2. 将一个金制垫片浸入十六碳烯中，小心地将其放置在蓝宝石圆盘上方。取第二个蓝宝石圆盘，碳涂层面向下，放置在金制垫片之上，形成“蓝宝石圆盘—金制垫片—蓝宝石圆盘”的三明治结构，使两组细胞相对。确保三明治结构内部无气泡残留。
      3. 关闭HPF样品夹。此步骤应迅速但谨慎完成，以尽量减少对样品的应力影响，特别是对于未预固定的活细胞。
        注意：对于含有致癌性、致突变性或生殖毒性（CMR）物质（如化学固定剂）的样品，应在通风橱内装载HPF样品夹，以减少暴露风险。
      4. 启动冷冻程序。迅速将HPF样品夹插入高压冷冻仪中，按照制造商说明锁定，并启动冷冻过程。
    7. 从HPF样品夹中取出玻璃化样品。迅速将携带已冷冻蓝宝石圆盘的HPF样品夹尖端转移至预冷的LN-box中。小心地将圆盘从样品夹中取出，放入LN-box中央的槽内（图2F中的虚线区域）。之后，加热HPF样品夹，并清除任何残留的乙醇或十六碳烯，以便开始组装下一个三明治结构。
      注意：此后所有接触圆盘的工具均需预先在液氮中冷却。所有转移操作应在氮气环境中快速完成，并将圆盘保存在液氮中，以防样品解冻。建议提前练习将样品夹从HPF转移至LN-box的过程，以确保操作流畅迅速。冷冻完成后，可使用吹风机（图2E中的2）加速样品夹的升温过程。
    8. 从样品夹中取出蓝宝石圆盘后，将其放入已标记的容器中，用于后续转移至冷冻置换装置，或在液氮中保存以待进一步处理。若高压冷冻后蓝宝石圆盘紧密粘连，应在冷冻置换前使用手术刀将其分离。
      注意：操作时注意避免圆盘破裂，避免施加剪切力。为该步骤预留充足时间。
  2. 冷冻置换
    1. 按照制造商说明设置冷冻置换装置。填充液氮杜瓦瓶，并启动程序将样品室预冷至-90 °C。确保在整个置换过程中有足够的液氮供应。
      注意：所涉及化学品具有危险性。所有操作均应在通风橱内进行，并遵守当地的环境、健康与安全（EHS）规定。
    2. 配制含0.1%（w/v）醋酸铀酰、0.2%（w/v）四氧化锇（OsO4）和5%（v/v）水的丙酮冷冻置换溶液。为配制6 mL体积（足以填充24个冻存管，即本实验所用置换装置的最大容量），请按以下步骤操作：
      1. 将6 mg醋酸铀酰称量至带紧密盖子的玻璃容器中。
      2. 加入300 µL 4%（w/v）水溶液的四氧化锇。
      3. 盖紧容器，超声处理5分钟以溶解醋酸铀酰。
      4. 加入5.7 mL丙酮，混匀后将溶液均匀分装至适用于冷冻置换装置的冻存管中。
    3. 将装有冷冻置换溶液的密封冻存管放入预冷至-90 °C的冷冻置换装置中，等待溶液温度也降至-90 °C（约20分钟）。
    4. 向LN-box中注入液氮。为将蓝宝石圆盘转移至冷冻置换装置，需将镊子、手术刀和钳子（或大号镊子）在液氮中预冷。
    5. 使用预冷的大号镊子将装有高压冷冻样品的储存胶囊从储存罐转移至LN-box中。
      注意：操作应迅速，防止样品解冻。若在高压冷冻后立即处理样品，此步骤可省略。
    6. 将高压冷冻样品转移至冷冻置换装置中。在保持液氮环境的同时，逐个分离蓝宝石圆盘，并迅速将每个圆盘单独转移至含有冷冻置换溶液的冻存管中，确保圆盘完全浸没。立即盖上冻存管并放回冷冻置换装置中。
      注意：转移过程中，应将冻存管保持在液氮气氛中，以防止置换溶液升温，但不可浸入液氮中以免溶液冻结。持握冻存管时应靠近管盖，避免热量传导导致置换溶液升温。操作时需格外小心，因溶液中含有有毒物质。
    7. 当所有圆盘均转移至置换装置后，启动冷冻置换程序。设定装置在16小时内从-90 °C逐步升温至0 °C，在0 °C孵育1小时，随后在1小时内逐步升温至20 °C。
    8. 一旦样品温度达到20 °C，立即用100%丙酮清洗样品，每次30分钟，共清洗3次。
      注意：切勿让圆盘上的细胞干燥。所有后续操作均应在通风橱内进行。所有废液应收集于适当容器中，并根据当地EHS法规妥善处置。
  3. 包埋
    1. 根据制造商说明新鲜配制环氧树脂。
      注意：所有涉及环氧树脂的操作均应在通风橱内进行。建议每次包埋操作均使用新配制的树脂，因其黏度较低，更有利于样品渗透。
    2. 为预包埋样品，先将样品在含1/3环氧树脂和2/3丙酮的溶液中孵育1小时。更换为含2/3环氧树脂和1/3丙酮的溶液，继续孵育3小时。再更换为100%环氧树脂，敞口孵育过夜，使残留丙酮充分挥发。
    3. 次日，将蓝宝石圆盘转移至新标记的、装有新鲜配制环氧树脂的反应管中。将圆盘水平放置，依靠管壁支撑，确保细胞面朝上（在体视显微镜下“2”字样可读）。将反应管敞口置于60 °C烘箱中，使环氧树脂聚合至少48小时。
      注意：若需包埋蓝宝石圆盘碎片，可借助先前实验中已聚合的树脂块尖端辅助包埋：将树脂尖端放入反应管中，加入新鲜树脂，再将破碎的圆盘置于聚合的尖端之上。
      所有一次性耗材若被环氧树脂污染，应在60 °C烘箱中加热使树脂完全聚合后方可丢弃。镊子等可重复使用工具可先用乙醇擦拭清洁。
    4. 将密封反应管的管尖浸入液氮中约10秒。随后通过轻敲桌面使树脂块从反应管中脱出。蓝宝石圆盘将与留在包埋细胞上方的碳涂层轻松分离。
      注意：请确保所用包埋介质能够耐受液氮处理引起的温度变化。
  4. STEM断层扫描切片的制备
    1. 制备比透射电镜（TEM）成像用超薄切片更厚的切片，通常厚度在800 nm至1 µm之间。
      注意：STEM断层扫描切片的制备方法与常规超薄切片略有不同。有关STEM断层扫描切片制备的详细方案，请参阅Walther等15和Villinger等10的研究。
      在继续STEM断层扫描切片制备前，应确认细胞质量良好。为此，可先进行超薄切片（约70 nm）并进行TEM分析（图3D、E）。
    2. 将切片收集于平行条纹铜网上，确保在样品倾斜至高角度时无网格条纹遮挡电子束。为增强切片附着性，可用0.01%聚-L-赖氨酸处理铜网：从0.1%储备液中取少量配制0.01%聚-L-赖氨酸溶液，将铜网浸入其中，再通过将铜网边缘在滤纸上轻轻拖动的方式小心干燥。随后进行辉光放电处理，并用于收集切片。
    3. 使用胶体金作为标记物处理切片，用于倾斜系列图像的对齐（见第3节）。
    4. 对切片进行碳镀膜处理，以增强其稳定性并提高导电性。

石墨烯制备步骤的显微图像；样品放置、检查和结构分析。
图3：通过透射电子显微镜进行质量控制——包埋、修块和超薄切片后细胞的不同形态。(A) 去除SD后的环氧树脂包埋细胞。带有划痕“2”的碳层仍保留在树脂包埋的细胞上，清晰可见。几乎透明的细胞均匀分布在包埋块表面。(B) 切片前的修块表面。树脂块表面仍可见部分划痕“2”。(C) 负载于透射电镜载网上的70 nm超薄切片。(D) 单张完整超薄切片的透射电镜概览图。注意切片中的孔洞（白色箭头），这是由于树脂渗透不完全所致，属于常见的人工假象。(E) 图(D)中白色矩形标记区域的放大视图。与(D)类似，在细胞质膜处可见包埋不完全（白色箭头）；但细胞其余部分显示良好的保存和包埋状态。比例尺 = 100 µm (D)，10 µm (E)。缩写：SD = 蓝宝石圆盘；TEM = 透射电子显微镜。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 成像

  1. STEM 倾转系列图像采集
    1. 根据制造商的指南设置透射电子显微镜。确保电子束正确对中。
    2. 小心地为显微镜的液氮杜瓦瓶补充液氮。
    3. 在显微镜操作软件中选择正确的断层成像样品杆。
    4. 将载网插入样品杆。注意使载网的支撑条方向垂直于倾转轴，以防止在高倾角时支撑条遮挡电子束。
    5. 将样品杆插入显微镜。
    6. 通过执行以下步骤对电子束进行对中：
      1. 加载制造商提供的对中文件。打开束阀，暂时在TEM 模式下工作。设置放大倍数约为20,000倍，并按下STD Focus设置标准焦距。
      2. 在样品中寻找一个孔洞。在低倍模式下（按下LowMag）更容易完成此操作。
      3. 确保未插入任何光阑。将束斑尺寸设为1，Alpha设为3。通过逆时针旋转亮度按钮将电子束在观察屏上缩小，并使用束偏移按钮将其居中。
      4. 校正电子枪对中：在显微镜操作软件的对中面板中，选择Gun和anode wobbler。使用DEF/STIG按钮调节电子束的对称性。确认荧光屏上电子束的移动是均匀的。使用SHIFT按钮将最亮的点移至屏幕中央；完成后取消所有选择。
      5. 校正聚光镜消像散器：在同一对中面板中，选择CLA和HT wobbler。使用DEF/STIG按钮调节，以实现均匀移动。
      6. 设置聚光镜光阑：顺时针旋转亮度按钮，使荧光屏上的电子束最大化。插入最小的聚光镜光阑，并通过交替调节亮度确保其在电子束中正确对中。如果电子束在观察屏上的移动不对称，请使用手动光阑驱动器手动调节光阑。如果光阑在荧光屏上显示变形，请再次使用DEF/STIG调节聚光镜消像散器CLA（见前一步 3.1.6.5）。
      7. 切换至STEM 模式（选择ASID）。
        注：可在镜头松弛对话框出现 5–10 秒后中断。
      8. 将样品台移动至样品中较薄且对比度丰富的区域。按下STD Focus并移除所有光阑。切换至25,000倍放大倍数，束斑尺寸 1.5 nm，将相机长度设置在80至120 cm之间，并选择斑点模式。
      9. 调节测角台的z 值，直到在观察屏上可见罗奇图样。如果罗奇图样较弱，可调节相机长度。如果图样不呈圆形，使用COND Stig按钮进行调节。
      10. 插入最小的聚光镜光阑。使用手动光阑驱动器将光阑围绕罗奇图样居中。
    7. 插入适当的探测器。根据研究问题，使用明场探测器和/或暗场探测器。激活扫描模式，并采集样品的第一张测试图像。
    8. 选择比期望断层图像更高的放大倍数（高于800,000倍）。校正焦距和像散：此操作应靠近但不直接在感兴趣区域（ROI）上进行，以避免对关键样品区域造成电子束损伤。
      注：金标标记物可使此步骤更简便。
    9. 设置等心高度，以确保在整个倾转范围（即-72°至72°）内 ROI 始终保持居中。选择 ROI 附近的一个特征点，将其移至中心，调焦并校正像散，然后逐步将样品台倾转至-72°。调节样品杆的 z 位置以保持该特征点居中，并在必要时调节对比度和亮度。如有必要，可逐步倾转至+72°重复此过程。
    10. 通过返回 ROI 区域，调焦并采集一张概览图像来选择视野（图 4）。设置倾转系列图像采集所需的放大倍数。
    11. 设置从-72°到+72°的自动倾转系列图像采集，每1.5°采集一幅图像。
    12. 为抵消样品台倾转方向切换时产生的机械效应，应以比起始成像角度更大的角度开始倾转系列。若从 -72° 倾转至 72°，可先将样品台从 0° 倾转至 -74°，然后在返回 +72° 的过程中开始图像采集，并在 -72° 处采集第一幅图像。
    13. 启动自动倾转系列图像采集。确保在采集软件中启用动态聚焦功能。
      注：若倾转系列采集提前终止，需重新校正等心高度。特别是在高倍率下，ROI 可能移出视野，从而导致自动倾转系列采集出现问题。
      常用于 STEM 和 TEM 断层成像的软件是 SerialEM。Kirchweger 等人20已发表使用 SerialEM 进行冷冻 STEM 断层成像的视频方案，该方案可轻松适配于室温 STEM 断层成像。

透射电子显微镜、细胞成像、TEM设置、显微图像分析、结构研究。
图4：倾斜系列图像采集。（A）200 kV 扫描透射电子显微镜（STEM）。（B）高压冷冻、冷冻置换后包埋于环氧树脂中的细胞的STEM概览图。图（C-E）所示的倾斜系列图像采集于白色矩形标记的位置。（C-E）从-72°至+72°采集的倾斜系列图像中的部分代表性图像。切片两侧的金标记物用于计算重建断层图像。如白色椭圆标记所示的成簇标记物无法用于断层图像重建，但在大倾角下易于识别。位于感兴趣区域外的此类或类似结构可用于设定共轴高度。比例尺 = 1 µm（B）。缩写：STEM = scanning transmission electron microscopy（扫描透射电子显微镜）。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 断层图像重建与分割

  1. 进行断层重建（例如，使用 IMOD 软件包中的 Etomo 软件23）。
    1. 对倾斜系列图像进行首次对齐，并采用加权反投影法重建断层图像。
      注意：详细的操作流程可在 IMOD 官方网站找到：IMOD 断层成像指南（https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html）。对于使用暗场探测器采集的图像处理，请参考已发表的文献11,13。
  2. 分割细胞结构（例如，使用 IMOD 软件包中的 3DMOD 软件或基于人工智能的解决方案）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM断层扫描技术能够对较厚的切片进行成像，其分辨率在纳米范围内具有各向同性，且与TEM断层扫描相比，可成像更厚的样品；与FIB-SEM断层扫描相比，该技术还提供了相对高效的时间成像流程。在病毒学研究中，这一优势尤为突出，因为它能够在三维空间中对大量超微结构特征进行成像，从而用于统计分析，或用于搜寻罕见事件。本文展示了两个代表性结果，用以说明STEM断层扫描技术在这两个方面的应用方式。

出芽重组水疱性口炎病毒病毒颗粒的可视化

病毒种类繁多，形成的病毒颗粒在形状和大小上各不相同。要分析病毒悬液中病毒颗粒的形态，通常采用负染透射电镜（TEM）等简单方法即可。然而，在细胞环境中表征病毒颗粒的形态则更具挑战性，这一点对于形成各向异性形态颗粒的病毒（如弹状病毒科 rhabdoviridae）尤为突出。VSV 是一种弹状病毒，可形成长度约为 180 nm 的子弹状病毒颗粒。在悬浮细胞中，这些病毒颗粒呈随机取向，因此在二维图像中难以始终辨识其子弹状形态（图 5A-C）。为了准确界定样品中所有重组 VSV 病毒颗粒的子弹状形态，需要一种具有各向同性分辨率的三维成像方法，同时能够对足够大的样品区域提供体积信息。扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像可在单个数据集中包含大量完整的病毒颗粒（图 5D、E），从而即使每细胞仅获取一个断层图像，也能对大量病毒颗粒进行成像，用于统计分析。相比之下，对 200 nm 厚切片进行 TEM 断层成像仅能捕获少数几个完整的重组 VSV 病毒颗粒（如 图 5E 中所标注）。

蛋白质结构的冷冻电镜显微照片，纳米尺度的结构分析，标注区域 A-E。
图 5：重组水疱性口炎病毒（VSV）出芽位点的扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像。 （A-C）来自厚度为 800 nm 切片的 STEM 断层图像虚拟切片的细节显示，由于（A,B）病毒颗粒取向不同，子弹状形态并不总是可见。（C）只有与观察平面平行取向的病毒颗粒才呈现为轮廓清晰的子弹状。（D）重组 VSV 的出芽位点表现为大量无特定取向的病毒颗粒簇。（E）断层图像的侧面视图展示了利用 STEM 断层成像技术在一个切片中捕获多个完整重组 VSV 病毒颗粒的能力。该虚拟图像堆栈在此位置的厚度约为 600 nm。虚线表示透射电子显微镜（TEM）断层成像典型切片的近似厚度（200 nm），在此厚度下仅能包含少数几个完整的子弹状病毒颗粒。比例尺 = 500 nm（D）。缩写：STEM = 扫描透射电子显微镜；VSV = 水疱性口炎病毒。请点击此处查看该图的放大版本。

EF-C 肽纳米原纤维的降解

在基因治疗的背景下，转导增强型肽纳米纤维已成为研究热点。在最近发表的一项研究24中，研究人员采用基于荧光共振能量转移（FRET）成像与扫描透射电子显微镜断层扫描（STEM tomography）的关联成像技术（FRET-3D-CLEM），研究了EF-C肽纳米纤维的细胞摄取与解组装过程。高FRET效率对应于彼此靠近的FRET荧光对，发出红色荧光，代表组装态的纤维；低FRET效率对应于彼此远离的FRET荧光对，发出绿色荧光，代表解组装态的纤维。当细胞处于摄取和降解EF-C肽纳米纤维的过程中时，两种信号均会出现。高FRET效率与低FRET效率共存的区域呈现黄色（图6A）。

细胞超微结构分析、电子显微镜图像及分割结果，突出显示核仁。
图6：通过相关FRET成像与扫描透射电子显微断层成像（FRET-3D-CLEM）分析EF-C肽纳米原纤维的降解。（A）用标记了FRET对的EF-C纳米原纤维孵育的细胞的共聚焦显微图像。绿色信号对应于可能已解聚的原纤维，红色信号对应于可能仍完整的原纤维，黄色信号对应于同时检测到红色和绿色信号的区域。Nu表示细胞核。（B）同一细胞800 nm厚切片的STEM概览图。（C）断层成像位置的指示图。该图像由在不同切片上获取的两张图像组合而成，因为细胞在其中一个切片中部分被栅格条遮挡。细胞核在A、B和C中均以Nu标注。（C）来自断层成像的虚拟切片。红色箭头标记与红色荧光信号重叠的区域。STEM断层成像证实了完整原纤维的存在。绿色箭头指向含有解聚原纤维的区域。（D）断层成像的分割结果。一个被内吞的伪足正在从囊泡膜上脱离（白色箭头）。STEM断层成像可检测较大的体积（此处约为：7 µm × 7 µm × 550 nm），使得观察此类稀有事件更为容易。（E）断层成像的第19、24和29号虚拟切片。在像素尺寸为6.8 nm的情况下，各切片之间相隔27.2 nm。本图改编自Rauch-Wirth等24发表的数据。比例尺 = 5 µm（A），1 µm（C）。缩写：STEM = 扫描透射电子显微镜；FRET = 傅里叶共振能量转移。请点击此处查看此图的放大版本。

通过这种相关联的方法进行可视化，以确认 EF-C 原纤维被细胞摄取并随后降解。光学显微镜使我们能够选择那些呈现红色和绿色信号的细胞，用于电子显微镜观察，从而比较与不同荧光信号相关的超微结构特征。来自同一细胞的扫描透射电子显微镜（STEM）断层图像显示，红色信号可能来源于仍位于细胞外的原纤维，或看似通过巨胞饮作用刚刚被内化的原纤维（图6C）。此外，CLEM 进一步证实绿色信号确实来源于已降解的原纤维（图6B、C），这些降解产物可存在于溶酶体中（图6C，最大囊泡）。由于 STEM 断层成像可获取较大的体积信息，并能对结构进行三维可视化，因此更容易将光学显微镜的信号与超微结构特征相对应并加以解释。此外，利用该方法还可检测到一些罕见事件，例如溶酶体内出现正在脱落的丝状伪足（图6D、E，白色箭头）。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

扫描透射电子显微镜断层扫描（STEM断层扫描）的分辨率可与透射电子显微镜断层扫描（TEM断层扫描）相媲美，同时能够检测厚度达1 µm的样品体积。因此，我们认为该技术非常适合用于成像病毒诱导的细胞内结构变化，例如膜重塑4,6,25、病毒粒子出芽7或内吞作用5。根据具体的研究问题，也可考虑其他体积电子显微技术（VolumeEM）。若需要在相近分辨率下获得更大的视场，我们推荐使用聚焦离子束-扫描电子显微镜断层扫描（FIB-SEM断层扫描）。当对相似体积和分辨率的样品进行成像时，FIB-SEM断层扫描的速度通常慢于STEM断层扫描，因为随着分辨率的提高，成像时间会相应增加。通常情况下，这一问题通过减小成像视场来补偿。此外，使用离子束铣削实现6.8 nm的z轴分辨率（图6）在技术上具有挑战性。因此，FIB-SEM更适合对整个细胞和组织等较大结构进行成像9,10,26,27，尽管其（各向同性）像素尺寸通常为几十纳米。此外，FIB-SEM断层图像不存在典型的由倾斜系列图像重建所产生的“缺失楔形”（"missing wedge"）效应。而且，随着等离子体FIB设备的发展，目前已有更快且仍能实现精确铣削的新技术被引入该领域。

如果z轴方向的高分辨率并非关键，透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）对连续切片进行成像可作为一种替代方法，能够在短时间内实现对极大视野的观察28,29，但通常具有各向异性的分辨率。在TEM断层成像中，可将来自连续厚切片的不同断层图组合起来30,31。STEM断层成像同样可以实现这一操作；然而，鉴于可检测切片的厚度，通常无需合并多个断层图。在病毒学领域，TEM断层成像常用于表征病毒诱导的膜结构重塑32,33,34,35。尽管TEM断层成像本身已能为病毒复制周期提供重要信息，但大多数应用场景将更受益于STEM断层成像对更厚样本体积的成像能力。这一点对于具有各向异性形态的病毒颗粒尤为明显，例如弹状病毒科（rhabdoviridae），在单个TEM断层图中往往只能捕获少数完整的病毒颗粒35 ，或在大小相当于人巨细胞病毒（HCMV）胞质病毒组装复合体（cVAC）的复制区室内对多个包膜病毒颗粒进行成像4。

在低温条件下进行扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像可提供进一步的功能信息19，且已有视频方案可供参考20。我们的方案在样品制备流程上有所不同，该流程并非保持样品的天然状态，而是实现接近天然的超微结构保存。尽管对高压冷冻后冷冻置换样品进行的STEM断层成像无法达到低温电镜所实现的超微结构保存水平和原子级分辨率，但其具有设备更简单、样品更稳定以及通量更高的优势。

以下步骤对于该方法的成功至关重要： 

首先，应明确成像实验的目标。由于该技术劳动密集，需要事先制定周密的实验计划，并明确成像目的。应在开展本实验前，通过其他较易操作的方法，获得有关模型系统（包括细胞系和病毒）的详细知识。因此，我们建议在基于光学显微镜的预实验中优化感染效率，并根据具体生物系统调整实验条件。优化参数包括细胞数量、感染复数（MOI）以及依据病毒种类和待观察事件确定的观察时间点。这将确保样本中含有较高比例的可评估细胞。

第二，高质量的样品制备。我们强调样品制备质量的重要性。目前，我们认为对于细胞等厚样品而言，高压冷冻实现的玻璃化是金标准。冷冻置换、包埋以及随后在室温下成像，当与扫描透射电子显微断层成像（STEM tomography）结合时，是一种获得高质量结果的可靠方法。因此，建立稳定的样品制备常规流程至关重要。为此，我们希望重点推荐有关高压冷冻的文献14,21。若需使用毒性较低的冷冻置换溶液，我们建议采用高锰酸钾替代四氧化锇，具体方法如 Schauflinger 等人所述36。

最后，应根据扫描透射电子显微镜（STEM）的用户说明书，建立一个运行顺畅的倾斜系列图像采集工作流程，该流程需基于良好对准的显微镜，并且会因不同显微镜而有所差异。建立顺畅的工作流程还取决于扫描发生器和图像采集软件。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW、RH、EP、JSR 和 MD 是勃林格殷格翰制药有限公司（Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG）的员工，该公司是一家致力于开发和生产病毒类产品的制药企业。上述情况未影响本文的设计，因此我们声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本出版物属于全球发展技术战略的一部分，并得到勃林格殷格翰开发CMC生物部门全球技术管理的支持。感谢Renate Kunz和Jana Apolloni在样品制备方面提供的出色技术支持和有益讨论。感谢Reinhard Weih在技术问题和设备维护方面提供的出色协助。感谢Torsten Friedrich在显微镜搭建过程中提供的有益讨论和帮助。Clarissa Read、Julia LaRoche和Jan Münch的工作获得了德国研究基金会（SFB1279）合作研究中心项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-十六碳烯默克股份公司8220640500
200 目带平行条纹的铜网Plano GmbHG2014C
37 °C 干燥室Binder GmbH9010-0323
丙酮VWR国际有限公司20066330
DDSA电子显微镜科学公司13710
金刚石刀Diatome Ltdhttps://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30电子显微镜科学公司13600
Embed-812树脂电子显微镜科学公司14900
电子显微镜工具TVIPS GmbHTVIPS 软件：EM-Tools；https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
乙醇 100%默克股份公司1.00983.2511
滤纸VWR international GmbH516-0812
11 mL 带旋盖玻璃瓶VWR国际有限公司548-0625
Formvar电子显微镜科学公司15830-25
Leica EM AFS2 冻干置换仪Leica Microsystems GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
Glod Sol 25 nmAURION 免疫金试剂 &和配件425.011
金针孔 ø 2000 μmScience Services GmbHGA2000-Au
铜质字母网格板Plano GmbHNH6C
加热板MEDAX GmbH & Co. KG12501
高真空蒸发系统 BAF 300BAL-TEC AG
高压冷冻仪 Wohlwend HPF Compact 01工程办公室 M. Wohlwend GmbHhttps://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
液氮罐H.Erben GmbH94500
氮气（液体）VWR国际有限公司-
NMA电子显微镜科学公司19000
四氧化锇ChemPur 高纯化学品与科研用品有限公司006051
120 烤箱 °CBinder GmbH9010-0194
PELCO easi-GlowTed Pella, Inc.91000
0.1% w/v 聚-L-赖氨酸水溶液泰德·佩拉公司18026
Safe-Lock 离心管 0.5 mLEppendorf SE0030 121.023
样品容器（Beem胶囊）Plano GmbHG360-1
蓝宝石圆盘，直径 3 x 0.16 mm工程办公室 M. Wohlwend GmbH500
超薄切片机 Leica EM UC7徕卡显微系统有限公司https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/
醋酸铀酰Riedel de Haën AG31697
紫外光室DiniesELG100S

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).">Laue, M. Chapter 1 electron microscopy of viruses. Methods Cell Biol. 96, 1-20 (2010).
  2. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).">Goldsmith, C. S., et al. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause. Emerg Infect Dis. 19 (6), 864-869 (2013).
  3. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).">Guo, F. Application of electron microscopy in virus diagnosis and advanced therapeutic approaches. J Histotechnol. 47 (1), 1-4 (2024).
  4. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).">Schauflinger, M., Villinger, C., Mertens, T., Walther, P., von Einem, J. Analysis of human cytomegalovirus secondary envelopment by advanced electron microscopy. Cell Microbiol. 15 (2), 305-314 (2013).
  5. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).">Abdellatif, M. E. A., Sinzger, C., Walther, P. Investigating HCMV entry into host cells by STEM tomography. J Struct Biol. 204 (3), 406-419 (2018).
  6. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).">Wieland, J., Frey, S., Rupp, U., Essbauer, S., Groß, R. Zika virus replication in glioblastoma cells: electron microscopic tomography shows 3D arrangement of endoplasmic reticulum, replication organelles, and viral ribonucleoproteins. Histochem Cell Biol. 156 (6), 527-538 (2021).
  7. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).">Bergner, T., Zech, F., Hirschenberger, M., Stenger, S., Sparrer, K. M. J. Near-native visualization of SARS-CoV-2 induced membrane remodeling and virion morphogenesis. Viruses. 14 (12), 2786(2022).
  8. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).">Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral infection at high magnification: 3D electron microscopy methods to analyze the architecture of infected cells. Viruses. 7 (12), 6316-6345 (2015).
  9. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).">Baena, V., Conrad, R., Friday, P., Fitzgerald, E., Kim, T. FIB-SEM as a volume electron microscopy approach to study cellular architectures in SARS-CoV-2 and other viral infections: a practical primer for a virologist. Viruses. 13 (4), 611(2021).
  10. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).">Villinger, C., Schauflinger, M., Gregorius, H., Kranz, C., Höhn, K. Electron microscopy, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1117, 617-638 (2013).
  11. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).">Hohmann-Marriott, M. F., Sousa, A. A., Azari, A., Glushakova, S., Zhang, G. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat Methods. 6 (10), 729-731 (2009).
  12. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).">Walther, P., Bauer, A., Wenske, N., Catanese, A., Garrido, D. STEM tomography of high-pressure frozen and freeze-substituted cells: a comparison of image stacks obtained at 200 kV or 300 kV. Histochem Cell Biol. 150 (5), 545-556 (2018).
  13. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).">Rachel, R., Walther, P., Maaßen, C., Daberkow, I., Matsuoka, M. Dual-axis STEM tomography at 200 kV: setup, performance, limitations. J Struct Biol. 211 (3), 107551(2020).
  14. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).">Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for transmission electron microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  15. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).">Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. Cell imaging techniques, methods and protocols. Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).
  16. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).">Steyer, A. M., Ruhwedel, T., Möbius, W. Biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging. J Vis Exp. (145), e59156(2019).
  17. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).">Read, C., Walther, P., von Einem, J. Human cytomegaloviruses, methods and protocols. Methods Mol Biol. 2244, 265-289 (2021).
  18. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).">Romero-Brey, I. Influenza virus, methods and protocols. Methods Mol Biol. 1836, 213-236 (2018).
  19. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).">Elbaum, M., Seifer, S., Houben, L., Wolf, S. G., Rez, P. Toward compositional contrast by cryo-STEM. Acc Chem Res. 54 (19), 3621-3631 (2021).
  20. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).">Kirchweger, P., Mullick, D., Wolf, S. G., Elbaum, M. Visualization of organelles in situ by cryo-STEM tomography. J Vis Exp. (196), (2023).
  21. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).">McDonald, K., et al. Chapter 28 "tips and tricks" for high-pressure freezing of model systems. Methods Cell Biol. 96, 671-693 (2010).
  22. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).">Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).
  23. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).">Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  24. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).">Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded. Biomaterials. , 317(2025).
  25. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).">Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers. Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).
  26. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).">Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells. Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).
  27. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).">Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex. Viruses. 13 (9), 1798(2021).
  28. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).">Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).
  29. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).">Lewczuk, B., Szyryńska, N. Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies. Animals. 11 (12), 3390(2021).
  30. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).">Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
  31. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).">Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. 3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography. J Vis Exp. (130), e56567(2017).
  32. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).">Snijder, E. J., Limpens, R. W. A. L., de Wilde, A. H., de Jong, A. W. M., Zevenhoven-Dobbe, J. C. A unifying structural and functional model of the coronavirus replication organelle: tracking down RNA synthesis. PloS Biol. 18 (6), e3000715(2020).
  33. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).">Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  34. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).">Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories. Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).
  35. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).">Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus. Viruses. 14 (12), 2828(2022).
  36. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).">Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution. Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).

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