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方法文章

转染Alu RNA的原代小鼠视网膜色素上皮细胞：一种具有病理相关性的年龄相关性黄斑变性体外模型

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DOI：

10.3791/68570

⸱

2025年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3National Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们描述了通过Alu RNA转染在原代小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞中建立与年龄相关性黄斑变性（AMD）病理相关的完整模型的过程。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD），尤其是非渗出性AMD，需要能够更好模拟人类病理特征的实验模型。目前的体内模型在技术上仍具有较高难度且耗时较长，而传统的体外系统则无法重现疾病特异性的病理触发因素。本文介绍一种利用转染Alu RNA的原代小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞建立RPE变性模型的方法，其中Alu RNA是一种与地图样萎缩病理直接相关的逆转座子。

本方案详细描述了从小鼠原代视网膜色素上皮（RPE）细胞中通过酶法分离，继而转染Alu RNA以诱导RPE变性的实验流程。验证过程结合了形态学（六边形结构）、功能学（极性丧失和小鼠ZO-1蛋白破坏）以及分子水平分析（定量PCR）。结果表明，Alu RNA转染引发了多因素变化：炎症细胞因子分泌（小鼠基因） Ifn-β, Il-6, Tnf-α；p < 0.05）和细胞衰老（小鼠基因 p21 和 p53 上调；p < 0.05）。与传统急性应激模型相比，该系统通过标准化技术重现了年龄相关性黄斑变性（AMD）的慢性炎症-变性级联反应，确保了实验的可重复性。通过整合简化模型的多个方面 体外 检测与复杂体系 体内 该方法可作为研究逆转座子驱动机制及筛选潜在治疗候选物的初步平台。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球视力障碍的主要原因。然而，目前针对非渗出性AMD的有效治疗手段仍然有限。因此，迫切需要建立可重复且高效的疾病研究模型，以揭示疾病机制并确定潜在的治疗靶点1,2。在这一研究中，视网膜色素上皮（RPE）处于核心地位。RPE是一层位于布鲁赫膜（脉络膜）与光感受器（视网膜）之间的单层细胞，在维持视网膜稳态中发挥关键作用，其功能包括支持光感受器活动、调控血-视网膜屏障以及促进代谢废物清除3,4。

RPE细胞的功能障碍或丢失是许多视网膜变性疾病的一个显著特征，尤其在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，RPE功能障碍是其疾病进展的早期且关键的步骤2,4,5。值得注意的是，在表现为地理性萎缩（GA）——AMD的晚期阶段——的患者中，microRNA加工酶Dicer 1核糖核酸酶III（DICER1）水平降低，导致Alu RNA（一种与RPE变性直接相关的逆转座子转录本）毒性积聚，这已被证实与人类病理过程相关6。

传统的体内模型，如碘酸钠（NaIO3）模型和淀粉样蛋白-β（Aβ）模型，虽保留了系统性疾病的复杂性，但存在关键局限性。NaIO3模型可快速诱导视网膜氧化应激和视网膜色素上皮（RPE）损伤，然而其急性毒性同时破坏RPE和光感受器，无法模拟年龄相关性黄斑变性（AMD）的慢性病理进展过程，且掩盖了对RPE轻微功能障碍的治疗效果评估7。类似地，Aβ模型虽引入了疾病特异性的应激因素，但相较于体外方法，其操作需要更高的技术要求和更长的实验周期8,9。传统的体外RPE模型，如H2O2和对苯二酚暴露模型，则缺乏病理相关性，无法重现疾病特异性的应激因素，例如毒性蛋白聚集体或炎症触发因子1。

本文提供了一种利用Alu RNA建立原代小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞RPE变性模型的详细方案。Alu RNA是一种源自逆转座子的非编码RNA，直接参与地图样萎缩（GA）的发病机制6。Alu RNA可激活炎症通路并破坏RPE屏障完整性10,11，从而模拟非渗出性年龄相关性黄斑变性（AMD）相关的病理特征。该方法包括RPE细胞的酶法分离与培养，随后使用Alu RNA诱导RPE变性。此外，我们还提供了一套全面的验证体系，结合形态学（六边形结构）、功能学（屏障完整性和极性丧失）以及分子水平（炎症和衰老标志物）的检测指标，用于评估该变性模型。

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方案

本研究经上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院动物伦理委员会批准。本方案严格遵循国家科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》以及视觉与眼科研究协会（ARVO）制定的眼科和视觉研究中动物伦理使用指南。有关本方案所用材料的更多详情，请参见材料表。

1. 小鼠原代RPE细胞的分离

  1. 包被板的制备
    1. 将Matrigel按150 µL Matrigel与13 mL DMEM/F12的比例稀释（终浓度约为1.14%）。
    2. 用稀释后的Matrigel均匀涂布培养板底部（48孔板每孔约150 µL），37 °C孵育过夜以形成凝胶。
  2. 溶液配制
    1. 使用Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）配制完全RPE培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
    2. 将4.5 mL Earle's平衡盐溶液（EBSS）加入木瓜蛋白酶小瓶（100单位/瓶）中，配制木瓜蛋白酶混合液。
    3. 将500 µL EBSS加入DNase I小瓶（1,000单位/瓶）中，配制DNase I混合液。
    4. 将250 µL DNase I混合液加入4.5 mL木瓜蛋白酶混合液中，配制木瓜蛋白酶消化液（调整供应商提供的方案，使木瓜蛋白酶终浓度为22 IU/mL），终体积为4.75 mL。
  3. 安乐死与组织采集
    1. 对2-3周龄小鼠通过腹腔注射5%戊巴比妥钠（150-200 mg/kg体重）实施安乐死，通过确认心跳和呼吸停止来判断深度麻醉和死亡。
    2. 摘除眼球前，用70%乙醇彻底喷洒眼部区域以去除表面污染物12,13,14。轻压眼眶边缘使眼球突出，然后用镊子取出眼球，保留视神经以便后续解剖。
      注意：所有器械（如镊子、剪刀）均经高压灭菌，操作在超净工作台内进行以维持无菌环境。
    3. 立即将眼球浸入预热至37 °C的无菌完全RPE培养基中。
  4. 酶消化
    注意：所有步骤，包括酶消化及后续操作，均须在超净工作台内进行以维持无菌状态。
    1. 将眼球转移至培养皿中，在体视显微镜下用镊子去除附着的结缔组织和残留的眼外肌。
    2. 用预冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS；无Ca2+/Mg2+，4 °C）轻轻冲洗眼球2次。
      注意：残留的完全RPE培养基可能影响木瓜蛋白酶的酶活性。
    3. 将眼球完全浸入1 mL木瓜蛋白酶消化液中，37 °C孵育45分钟。
  5. RPE细胞的分离
    1. 消化完成后，用完全RPE培养基中和酶活性。
    2. 将眼球转移至培养皿中，在体视显微镜下切除角膜、虹膜和晶状体，保留后部眼杯。
      注意：RPE细胞在整个过程中以完整片层形式分离和维持（而非解离为单个细胞）。
    3. 将视网膜-RPE复合体从脉络膜上分离，然后在完全RPE培养基中将RPE层以连续片层形式从视网膜上剥离。将分离的RPE层均匀收集至新鲜的完全RPE培养基中混合，随后接种于Matrigel包被的表面进行培养。
  6. 细胞培养
    1. 将细胞混合物接种于Matrigel包被的24孔板（每孔盖玻片接种8-10个眼球，用于免疫染色）、Matrigel包被的48孔板（每孔6-8个眼球，用于qPCR）或Matrigel包被的96孔板（每孔5-6个眼球）。
    2. 37 °C、5% CO2条件下孵育。首次换液在48小时后进行，使用完全RPE培养基，之后每48小时更换一次培养基。
      注意：为尽可能维持RPE细胞的极性，应尽量避免传代，因为反复传代可能导致细胞分化状态和功能完整性的丧失。
  7. 细胞形态观察
    1. 让细胞形成具有典型六边形形态的单层，使用倒置细胞培养显微镜观察细胞形态。

2. 视网膜色素上皮变性模型的诱导

  1. Alu RNA 的合成与验证
    1. 使用以下方法合成 Alu RNA 体外 转录系统
      注意：本研究中使用的 Alu RNA 的合成基于 Ambati 实验室所述的方案6.
    2. 使用微量分光光度计纯化RNA并确认其质量。
  2. Alu RNA 转染
    注意：我们将原代RPE细胞接种的当天定为第0天。第5天时，贴壁的原代RPE细胞呈现均一的形态，并达到超过50%的细胞汇合度，此时根据制造商说明书，使用基于阳离子脂质的转染试剂进行Alu RNA转染。
    设置了两个对照组以验证实验结果：i）阴性对照组（NC），不添加Alu RNA和转染试剂，以低血清培养基作为替代；ii）脂质体对照组（LC），不添加Alu RNA，但将等量的转染试剂与低血清培养基混合后加入细胞，以排除脂质体转染相关效应的影响。以下步骤概述了Alu RNA的转染流程。
    1. 在转染操作前，每孔（48孔板）加入300 µL完全RPE培养基，替换原有培养基。
    2. 在低血清培养基中，使用 Alu RNA 和基于阳离子脂质的转染试剂制备转染复合物。
      1. 将1.2 µL阳离子脂质类试剂与18.8 µL低血清培养基混合制备混合液1。轻轻混匀（勿涡旋振荡），室温孵育5分钟。
      2. 用6 µL Alu RNA（100 µg/mL）和14 µL低血清培养基配制混合液2。
      3. 将20 µL的Mix 2逐滴加入20 µL的Mix 1中，制备转染复合物。
        注意：使用阳离子脂质转染试剂，每孔加入1.2 µL（试剂与RNA质量比为1.2 µL : 0.6 µg），使Alu RNA的终浓度为每孔0.6 µg。
      4. 轻轻振荡混匀，然后在室温下静置 20 分钟。
    3. 向24孔板的每孔中加入40 µL转染复合物。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 培养箱中孵育 48 h。
    4. 转染后48 h进行qPCR、免疫染色及其他实验操作。

3. 退化模型的验证

注意：全面的模型验证实验于第 7 天进行。

  1. 用于极性和屏障完整性评估的免疫荧光染色
    1. 用不含甲醇的4%甲醛在室温下固定培养的RPE细胞20分钟，随后用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。
    2. 用含5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭非特异性结合位点，孵育1小时。
    3. 在4 °C避光条件下，用一抗anti-ZO1（1:1,000稀释于3% BSA中）和Phalloidin 488（1:1,000稀释于3% BSA中）孵育过夜。
    4. 用 PBS 轻柔洗涤细胞，每次 10 分钟，共洗 3 次。
    5. 室温下用二抗（以3% BSA按1:1,000稀释）孵育1小时。
    6. 用1×PBS洗涤样本，每次10分钟，共洗涤3次。
    7. 用 DAPI（PBS 中 1:1,000 稀释）复染 10 分钟。
    8. 用1×PBS清洗样品，每次10分钟，共清洗3次。
    9. 小心地将盖玻片从24孔板中取出，放置在预先滴有封片剂的载玻片上。使用40x/0.95物镜采集共聚焦图像。
  2. 衰老与炎症标志物的定量 PCR（qPCR）检测
    注意：3-磷酸甘油醛脱氢酶（小鼠基因 Gapdh) 作为内参基因，用于对扩增循环阈值（Ct）进行标准化。所有定量PCR（qPCR）反应中，每个实验组均包含三个生物学重复。引物序列见于 补充表 S1.
    1. RNA提取
      1. 向培养板中加入裂解缓冲液（Total RNA Kit）（每10 cm²表面积加入1 mL），室温孵育5分钟。
      2. 在 13,400 × g 4 °C 下离心 5 分钟。将上清液转移至新的无 RNase 管中。
        注意：如果样本无碎片（例如，澄清的细胞裂解液），可跳过此步骤。
      3. 向 supernatant 中加入 200 µL 氯仿，涡旋振荡 15 秒，室温孵育 3 分钟。
      4. 在13,400 × g下离心 g 4 °C下离心10分钟。将上层水相（约500 µL）转移至新管中。
      5. 向水相中加入0.5倍体积的乙醇。用移液枪轻轻混匀。
      6. 将混合物上样至硅胶膜离心柱（包含在总RNA提取试剂盒中）。在13,400 × g 30秒后弃去滤液。
      7. 加入500 µL蛋白质去除缓冲液（Total RNA Kit）至柱中。在13,400 × g 30秒后弃去滤液。
      8. 加入500 µL洗涤缓冲液（Total RNA Kit）至柱中。在13,400 × g 30秒后弃去滤液。
      9. 重复之前的步骤 3.2。
      10. 将空柱在13,400 × g 干燥膜2分钟。
      11. 通过向膜上加入30–100 µL无RNase的水来洗脱RNA。室温孵育2分钟。在13,400 × g离心2分钟。
    2. 互补DNA（cDNA）合成
      1. 使用分光光度计在 260 nm 和 280 nm 处测定 RNA 浓度。
        注意：一个A260/A280 1.8 至 2.0 之间的比值被认为与可接受的 RNA 纯度相关。
      2. 在无RNase的离心管中配制反应体系：RNA模板（500–1,000 ng）：X µL（根据其浓度确定），5×反转录缓冲液：4 µL，无RNase水：加至20 µL。
      3. 将反应混合物放入热循环仪中，按照以下程序孵育：37 °C 反应 15 分钟，85 °C 反应 5 秒，然后在 4 °C 无限期保存。
    3. qPCR
      1. 每个反应配制qPCR预混液（总体积10 µL）：TB Green（含于Premix Taq中）：5 µL，ROX染料（含于Premix Taq中）：0.2 µL，上游引物（1 µM）：0.2 µL，下游引物（1 µM）：0.2 µL，无RNase水：3.4 µL，cDNA模板：1 µL。
      2. 向96孔板的每个孔中加入10 µL的预混液。
      3. 用粘性光学封板膜密封板。在300 × g 1 分钟。
      4. 在实时荧光定量PCR系统上运行以下程序：第一阶段：95 °C 预变性30 s；第二阶段：40个循环，每个循环包括95 °C 变性5 s，60 °C 退火延伸30 s；第三阶段：熔解曲线分析。
      5. 使用2−ΔΔCt法计算目标mRNA的相对表达水平−ΔΔCt 方法15.

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结果

转染Alu RNA前的小鼠原代RPE细胞
第0天（图1），分离出的小鼠原代RPE细胞呈现出典型的健康RPE细胞特征性六边形形态，并维持了结构良好的单层排列。细胞培养过程中实现了初步的结构组织化以及紧密连接的形成，表现为清晰的六边形轮廓和明确的细胞边界。该形态特征作为后续诱导RPE变性的基础。在此阶段，RPE屏障的完整性亦得以保持，确保细胞在第5天进行Alu RNA转染前处于正常功能状态（图1这些观察结果证实了视网膜色素上皮（RPE）细胞的成功分离与初始培养，为研究Alu RNA转染对细胞形态和功能的影响提供了可靠的基础。

Alu RNA 转染后 RPE 的形态学变化、极性丧失及屏障完整性评估
Alu RNA 转染后，原代小鼠 RPE 细胞表现出显著的形态学改变。在第 7 天，与 NC 和 LC 组相比，Alu 组细胞明显失去了典型的六边形细胞形态，细胞变得更为破碎且分散（

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讨论

我们的目标是建立一种可重复且易于操作的视网膜色素上皮（RPE）损伤模型，能够在资源限制最小的情况下实现高分辨率成像和机制分析。该方法通过共聚焦Z轴层扫成像（0.5 µm步长），清晰地展示了Alu RNA诱导的结构破坏，与对照组相比，包括顶端紧密连接断裂和基底细胞骨架紊乱。两个关键步骤确保了系统的可靠性：酶消化和Alu RNA转染。采用木瓜蛋白酶法分离（22 IU/mL，37 °C，45 min），我们观察到与细胞极性一致的结构特征，并通过典型的六边形形态部分证明了紧密连接的完整性（图1A、B），相较于会破坏屏障功能的传统机械分离方法有明显改进。值得注意的是，适当修改可能提高方案的适应性。对于RPE细胞得率不理想的情况，我们建议根据出生后年龄在±10分钟范围内调整酶消化时间。在标准化转染0.6 µg/孔Alu RNA并培养48小时后，RPE细胞表现出明显的极性丧失、紧密连接断裂（图2）以及炎症和衰老标志物的上调（图3），表明该剂...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了科学技术创新行动计划医学创新研究专项项目（23Y11901300）、国家自然科学基金（82171076）和上海市教育委员会（2023ZKZD18）的支持。我们感谢L.Z教授惠赠Alu RNA。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1300 系列 II 级 A2 型生物安全柜Thermo Scientific
37 °C/5% CO2 培养箱Thermo Scientific
4% 多聚甲醛（PFA）ServicebioG1101-500ML
人 Alu RNA由 L.Z. 惠赠
抗兔二抗，Alexa Fluor 568（山羊）Invitrogen Thermo ScientificA11011
Applied Biosystems MicroAmp 黏性光学封膜Thermo Fisher Scientific
Applied Biosystems MicroAmp 光学 96 孔反应板Thermo Fisher Scientific
Applied Biosystems ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific用于基因表达定量分析的实时 PCR 系统
牛血清白蛋白（BSA，第五组分）BeyotineST023-50g
Carl Zeiss Primovert 倒置细胞培养显微镜Zeiss用于细胞形态监测
Centrifuge 5424 R 离心机eppendorf
氯仿SigmaRNA 提取中的相分离
共聚焦激光扫描显微镜（LSM900+Cell discover 7）Zeiss用于免疫荧光标记物（如 ZO-1 和 F-肌动蛋白）的高分辨率成像
Costar 24/48/96 孔板Corning
盖玻片Thermo Fisher Scientific用于 24 孔板上的免疫荧光成像
DAPIThermo62248
数字干浴器Mulab
DMEM/F12gibco用于培养 RPE 细胞的培养基 
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）ShareBioSB-CR017
Earle’s 平衡盐溶液（EBSS）gibco用于 RPE 分离过程中木瓜蛋白酶和 DNase I 的稀释
乙醇（无水）Sigma用于 RNA 沉淀和柱洗涤
胎牛血清（FBS）Sigma用于配制完全 RPE 细胞培养基
镊子用于解剖
Lipofectamine 3000（基于阳离子脂质的转染试剂）Thermo FisherL300015用于将 Alu RNA 转染至 RPE 细胞
MatrigelCorning356234用于包被培养板以支持 RPE 细胞黏附和极化的基质（稀释至 1.14%）
无甲醇甲醛Thermo Scientific用于免疫荧光中表位保存的替代固定剂（4%）
微量移液器eppendorf
Nanodrop 2000 分光光度计Thermo Scientific测定 RNA 浓度和纯度
Nikon ECLIPSE Ti-S 荧光倒置显微镜Nikon用于染色样品的荧光成像
Olympus SZX16 体视显微镜Olympus用于小鼠眼球解剖和 RPE 分离
Opti-MEMgibco用于转染复合物制备的低血清培养基
木瓜蛋白酶解离系统WorthingtonLK003150作为工作酶使用
青霉素-链霉素 gibco用于配制完全 RPE 细胞培养基
戊巴比妥钠盐Sigma安乐死试剂
鬼笔环肽 488 Abcam176753用于极性评估
PrimeScript RT 试剂盒TaKaRaRR037A用于 cDNA 合成的逆转录试剂盒（qPCR 模板制备）
RNAsimple 总 RNA 提取试剂盒TIANGENDP419用于 RNA 提取
TB Green Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）TaKaRaRR420A用于 qPCR
ZO-1 兔多克隆抗体Proteintech21773用于形态学评估

参考文献

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