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方法文章

人类肾动脉分支的多层级显微解剖与功能-结构分析

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DOI：

10.3791/68579

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2025年9月5日

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于分离和功能评估人肾动脉分支的逐步实验方案，可促进药物开发的临床前研究。

摘要

肾血管功能障碍在多种临床疾病的发病机制中起着关键作用，包括急性肾损伤、肾缺血和高血压，这给临床管理带来重大挑战，并对患者预后产生不利影响。分离并进行肾内动脉的功能表征，对于阐明肾血管功能障碍（特别是与肾脏损伤相关）的潜在机制以及指导靶向治疗策略的开发至关重要。尽管其具有重要的临床意义，但目前仍缺乏针对不同分支水平的人类肾内动脉进行标准化分离与功能评估的系统方法。本实验方案提供了一个全面的框架，用于系统性地分离肾内动脉分支，并在生理和病理条件下对其进行多模态的功能与结构评估。该方法包括三个关键组成部分：（1）从供体肾脏中精确解剖识别并显微分离肾内动脉，同时采用苏木精-伊红（H&E）染色进行结构验证；（2）在丝肌动描记法（wire myography）中实施严格的归一化操作流程，以提高测量的可重复性与可靠性；（3）利用高精度丝肌动描记技术对血管运动反应进行定量分析。归一化过程基于肌肉长度-张力关系，通过逐步拉伸动脉节段，确定最佳静息张力，以实现肌动蛋白与肌球蛋白的最大重叠，从而获得最强的收缩反应。在丝肌动描记实验中，将分离的血管节段悬挂于两根平行金属丝之间，以精确测量血管张力。通过实施严格的归一化流程，该技术能够在多种病理生理状态及药理干预条件下，实现对血管反应性的可重复且可靠的定量分析。

引言

肾脏是维持人体内环境稳态的重要器官，通过清除代谢废物、调节电解质平衡和体液平衡来实现其功能，这些功能需要极高的血流量支持。在生理状态下，肾脏每分钟接收的心输出量约占心脏泵血总量的25%，凸显了其在全身血流中的重要地位以及肾灌注在维持整体生理平衡中的关键作用1肾动脉系统精确调节这种大量的血液输送，以维持肾小球滤过率（GFR） 同时适应全身血流动力学变化。因此，肾灌注受损是一种关键的病理机制，可导致急性肾损伤和肾缺血等情况下肾小球滤过率（GFR）下降。此外，它常继发于影响肾血流的全身性疾病，包括休克、心脏功能障碍和脓毒症。2,3,4,5肾动脉在肾脏内依次分支，首先分为叶间动脉，穿过髓质锥体之间的肾柱走行。到达皮髓质交界处时，这些血管发出弓形动脉，沿皮质与髓质交界的边界呈弓状走行。从这些弯曲的血管发出小叶间动脉，呈放射状深入皮质实质，最终将血液输送至肾小球毛细血管。 通过 传入小动脉以灌注单个肾单位1,6,7肾内叶间动脉、弓状动脉和小叶间动脉构成肾脏的关键阻力血管系统，是肾内血流动力学和压力调控的主要调节者。1,8精确分离和表征这些血管对于阐明调控肾灌注稳态的基本机制至关重要9此外，它们在不同病理生理条件下的血管反应异质性为开发具有肾脏保护潜力的新型血管扩张剂提供了战略性框架。10,11.

目前，临床影像技术（如超声）已常规用于监测肾血流变化；然而，在基础研究中，用于直接评估肾血管张力（决定肾灌注的关键因素）的实验方法仍然有限12,13,14,15. 丝肌张力测定系统是一种成熟的实验平台，用于测量小块生物组织的张力变化 体外，包括血管、气管16,17,18，直径范围为50 µm至10 mm16,19,20尽管导线肌张力测定法已广泛应用于动物研究，但不同物种间血管结构和功能的差异限制了啮齿类动物血管对人类血管生理学的代表性21因此，精确识别和分离不同解剖层次（小叶间、弓状和小叶内）的人肾内动脉，对于实现全面研究至关重要 体外 研究其生理特性，以及与疾病相关的功能改变和病理损伤机制。当结合使用多种血管活性化合物进行药理学干预时，该系统可对离体动脉环的缩血管/舒血管反应进行动态评估和定量记录，为在可控实验条件下研究血管反应性提供了强有力的工具19,22,23.

本方案详细阐述了一种用于精确定位和显微解剖人类肾内动脉分支（包括小叶间动脉、弓状动脉和入球小动脉）的系统性方法，并结合功能性表征分析，采用 体外 血管张力监测系统，以评估它们对血管活性药物的不同反应性，从而建立这些血管节段在结构和功能上的差异。通过将解剖定位与药理反应性分析及组织病理学分析相结合，我们建立了一种 离体 可实现对血管活性物质在特定区域血管反应进行全面评估的平台。

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方案

本方案及所述示例已通过北京大学第一医院泌尿外科伦理审查（批准号：2023yan500-002），并依照《赫尔辛基宣言》的规定执行。所有参与者在参与前均签署了书面知情同意书。

1. 溶液配制

  1. 配制含有 119.0 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4 和 11.0 mM D-葡萄糖、pH 为 7.4 的 Krebs-Ringer 溶液（Krebs）。
  2. 配制含有 64.0 mM NaCl、60 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4 和 11.0 mM D-葡萄糖、pH 为 7.4 的高钾盐溶液（60K+）。

2. 试剂准备

注意：收到药物后应立即根据材料安全数据表（MSDS）中提供的说明进行储存。

  1. 通过将167.21 mg的苯肾上腺素（Phe，储备液浓度为10-1 M）溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制储备液。将储备液储存于-80 °C，于使用当天稀释为10-6、10-5、10-4、10-3、10-2 M的工作浓度。
  2. 通过将18.166 mg的乙酰胆碱（ACh，储备液浓度为10-2 M）溶解于10 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制储备液。将储备液储存于-80 °C，于使用当天稀释为10-5、10-4、10-3、10-2 M的工作浓度。

3. 肾脏组织采集与肾内动脉分离

  1. 招募经术前粗针穿刺活检或术中冰冻切片组织学确诊为肾细胞癌的成年患者。
    注意：选择计划接受根治性肾切除术的患者，因为其手术标本可提供位于肿瘤边缘远端的完整肾内动脉节段。这些节段可被精确解剖和分离，从而可在不受恶性组织干扰的情况下深入研究人类肾脏血管生理学。组织学确认可准确识别癌变并清晰界定肿瘤边界，有助于选择无肿瘤的正常动脉节段用于实验研究。
    1. 排除患有显著合并症（如高血压、糖尿病或其他系统性疾病）的患者，以避免对血管功能产生混杂影响，从而提高生理评估的可靠性和相关性。
      注意：本实验所用样本来自北京大学第一医院计划接受根治性肾切除术的患者。
  2. 在根治性肾切除术期间，采集新鲜切除的人体肾脏标本，并立即浸入冰冻的Krebs溶液中以维持组织活性。仅保留肉眼观察下外观正常、位于肿瘤边缘远端的区域用于动脉解剖（图1A）。
    注意：为最佳分离肾内动脉，应在根治性肾切除术中取邻近健康组织的全层皮髓质楔形组织，从而完整保留从皮质到髓质的整个动脉树。
    1. 立即将切除的组织置于200 mL冷Krebs溶液中，将容器放在冰上，并在采集后2小时内用保温袋运送至实验室。确保运输过程中组织始终完全浸没，以维持其活性和结构完整性，便于后续解剖及功能分析。
      注意：为保持组织活性和生理功能，整个分离过程及随后在4 °C Krebs溶液中的储存应在6小时内完成24,25,26,27。操作过程中应定期更换溶液，以维持氧合状态和组织活性，同时促进血管腔内血液成分的清除。
  3. 通过定位肾门并使切口穿过肾盂和外侧凸缘，目视确定冠状面。使用无菌手术刀沿冠状面将肾脏切成两个对称的半片。该方法可暴露肾脏内部结构，包括肾锥体和肾柱，有助于准确识别并进一步解剖肾内动脉（图1A）。
    注意：为便于分离肾动脉，应首先去除横切面上部分肾盂、肾锥体及脂肪组织，以暴露更多血管（图1B）。操作时注意避免损伤血管。
  4. 在体视显微镜下，使用显微解剖剪和镊子在直径10 cm的黑色底面培养皿中仔细分离叶间动脉、弓状动脉和小叶间动脉（图1C）。
    注意：在人肾中，小叶间动脉穿过肾锥体，其血管壁厚度在三种动脉分支中最厚1,8，平均直径约为1–2 mm。在皮髓交界处，叶间动脉转变为弓状动脉，沿皮髓边界呈半圆形走行，平均直径约为500 µm。血管进一步分支进入肾皮质，即为小叶间动脉，其血管壁最薄、直径最小，约为200 µm（图1C）。此外，在区分这三种血管分支时，解剖定位提供的信息比绝对血管直径测量更为关键1,8。
    1. 轻柔去除动脉周围的组织和脂肪，确保在直径10 cm的黑色底面培养皿中彻底清洁（图1B）。
  5. 将分离得到的肾动脉（小叶间动脉、弓状动脉和叶间动脉）用于以下实验：
    1. 为组织学处理准备动脉节段，将分离的组织修剪至约3 mm的标准长度，适用于石蜡包埋和组织切片。每个样本在室温下用2 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定1小时，以保存组织形态。固定后，按照标准脱水、透明和石蜡包埋流程处理，并根据既定组织学方案进行苏木精-伊红（H&E）染色（图2）。
      注意：如需进一步组织学评估，可根据既定组织学方案对样本进行Masson三色染色以评估胶原沉积，或进行Verhoeff-Van Gieson（EVG）染色以观察弹性纤维28,29。
    2. 用于血管功能研究时，将肾内动脉环保存在冰冻Krebs溶液中直至检测。动脉环应完全浸没。
      注意：对于后续分子检测（如Western blot/qPCR），解剖后应立即将新鲜标本在液氮中速冻，然后按照已发表的方法储存在-80 °C，以保持RNA完整性并防止蛋白质降解30,31。

4. 动脉环安装

  1. 根据明显的解剖位置（图1C）和直径范围（图2）识别出叶间动脉、弓状动脉和小叶间动脉，然后使用显微解剖剪将它们小心地切成约2 mm长的环状结构，用于血管功能研究（图3A）。
    注意：每段分离出的动脉环应立即单独保存在5 mL冰冷的Krebs溶液中，直至进行功能检测。进行功能检测时，应选择长度在1.5–2.0 mm之间、无分支且切口垂直整齐的血管环。排除长度超过2.0 mm的血管环，以避免安装困难；排除长度小于1.5 mm的血管环，以防止张力记录不稳定。
  2. 按照步骤4.1所述方法分别制备所有动脉环（来自叶间动脉、弓状动脉和小叶间动脉），并将Krebs溶液和60K+溶液恢复至室温。随后打开连接的计算机，再启动丝肌动描记系统，确保所有组件均已正确初始化后，再继续实验操作。
  3. 在将动脉环安装至丝肌动描记仪腔室之前，用5 mL Krebs溶液将每个腔室冲洗两次，以确保清洁并去除残留物质，然后向每个腔室中加入5 mL Krebs溶液。
    1. 利用肌动描记仪内置的温度控制系统将溶液加热至37 °C。同时，通过连接的气体管路持续向溶液中通入气体（95% O2 和5% CO2 的混合气体），以在实验过程中维持适当的氧合状态和pH平衡。
  4. 为每个动脉环准备两根直径为40 µm、长度为3 cm的引导丝，并小心地将分离出的动脉环转移至另一个盛有Krebs溶液的10 cm黑色底面培养皿中。 
    注意：应根据血管直径选择不同直径的引导丝。对于直径约为100 µm或更小的动脉环，需使用15 µm的引导丝；若直径在100 µm至200 µm之间，则使用25 µm的引导丝；若直径大于200 µm，可使用40 µm的引导丝。为保证实验一致性，建议在同一实验中对同类型血管使用相同直径的引导丝。19。
  5. 在培养皿内，小心地将第一根引导丝插入动脉环中，将引导丝一端弯折90°，然后将其转移至腔室内，并使用仪器配备的专用螺丝顺时针拧紧，固定在夹持式样品架上（图3B）。
    注意：插入引导丝是为了在将动脉环安装到样品架上的转移过程中提供结构支撑，最大限度减少因操作引起的损伤或变形。
  6. 在将动脉环固定于样品架之前，记录血管的长度和宽度。将动脉环置于两个样品架之间（图3C），读取千分尺刻度，其中1个刻度代表10 µm。减去样品架刚刚接触时测得的刻度值（图3D），以确定动脉环的实际长度和宽度。
  7. 将另一根引导丝穿入血管，并最终固定在另一侧。将引导丝顺时针方向缠绕在两侧的固定螺丝上，确保其紧密贴附于样品架表面。
    注意：在整个固定过程中，必须避免牵拉血管或用引导丝刮伤血管内壁，以防损伤血管内皮。引导丝应在固定螺丝上单层缠绕，不得重叠。两根引导丝应处于同一水平面，相互平行，不得交叉。此外，在固定引导丝后，应调节两侧样品架靠近，但彼此接近而不实际接触，以避免施加外力，如图3E和图3F所示。
  8. 将腔室重新安装回丝肌动描记系统中。然后盖上盖子并通入气体。连接传感器，并打开数据采集软件，开始进行血管张力检测。

5. 用于确定最佳初始张力的血管特异性标准化

注意：建立稳定的基线条件（定义为实现最大收缩反应性的最佳静息张力）对于获得可重复的功能性测量结果至关重要。然而，由于个体间固有的生理差异，人体血管的基线力学特性相较于动物血管具有更大的变异性32,33,34,35,36。这些因素，加上血管固有的异质性（例如，管径、管壁厚度和收缩特性在结构和功能上的差异），共同导致基线张力存在显著变异。因此，为确保实验的可重复性，建议对每条血管进行个体化归一化处理。导丝肌张力测定系统包含一个专用的归一化模块，可精确确定每条血管的基线张力。

  1. 按照步骤 4.1 至 4.8 所述方法将动脉环安装至浴槽中。开始记录图表，将通道归零（图 4A），稳定至少 30 分钟后，再次将通道归零，然后进行标准化操作。
  2. 从 DMT 菜单中选择“标准化设置”（Normalization Settings）（图 4B），并按以下参数进行设置（图 4C）：
    1. 目镜校准（mm/div）：1；目标压力（kPa）：13.3；IC1/IC100：0.9；在线平均时间（秒）：3；延迟时间（秒）：60。
      注：IC1 表示血管在最大主动收缩力产生时的内周长，而 IC100 表示对应于 100 mmHg 跨壁压的周长。人类肾动脉在不同样本间存在显著差异，因此需要进行个体化标准化，这与具有稳定血管特性的动物模型不同，后者可重复使用实验测定的 IC1/IC100 比值。由于不同人源样本在血管直径、管壁厚度及力学特性方面存在显著差异，每个血管必须独立进行标准化，以建立其特有的基线特征。因此，此处设定的 0.9 比值仅为方案初始化的占位符，在本方案中并不实际使用。
  3. 选择对应目标动脉的通道，从 DMT 菜单中打开标准化界面（图 4C），并输入相应数据：
    1. 组织端点：a1 应设为 0，a2 应为血管长度（单位：mm）；钢丝直径：40 µm（输入所用钢丝的实际直径）；千分尺读数：从千分尺刻度上读取数值，点击 添加点 记录该点。
  4. 准备就绪后，点击 添加点 记录第一个数据点，并启动标准化程序。
  5. 施加被动牵张，等待 3 分钟，记录此时的千分尺读数作为下一个点，然后加入 5 mL 的 60K+ 溶液以诱导钾离子介导的血管收缩（图 5）。
  6. 等待收缩达到平台期后，用 5 mL Krebs 溶液冲洗 3 次以去除 60K+ 溶液，并通过从每次牵张下的钾激活力中减去相应的被动力，从曲线中计算主动收缩力数据（图 5）。
  7. 重复步骤 5.5 至 5.6（"牵张-60K+ 刺激-冲洗" 步骤），直至主动收缩力达到最大值，随后确定血管主动收缩力最大时的最佳基础张力（图 5）。
  8. 在进入实验的下一步之前，让动脉环在浴槽中平衡 10 分钟。

6. 肾动脉环反应性的检测

  1. 实验开始前，确保每个腔室中克雷布斯液（Krebs）的体积为 5 mL。
  2. 为评估苯肾上腺素（phenylephrine）诱导的浓度依赖性收缩，以半对数递增方式累积加入 Phe（10-9 至 10-4 M）37。
  3. 从最低浓度的 Phe（10-9 M）开始。向含有 5 mL 克雷布斯缓冲液的腔室中加入 5 µL 的 Phe 储备液（10-6 M），持续监测并等待收缩稳定（张力持续 2–3 分钟无变化），标记该点，然后加入下一个半对数递增浓度。重复此过程直至达到最终浓度（10-4 M），全程保持一致监测（图 6）。
  4. 如需进行其他药物测试，使用 5 mL 温热的克雷布斯溶液至少冲洗腔室 5 次，直至张力恢复至基线水平并稳定至少 10 分钟。
  5. 为评估乙酰胆碱（acetylcholine）诱导的浓度依赖性血管舒张，以半对数递增方式累积加入 ACh（10-8 至 10-5.5 M）。
    注意：在正常血管系统中，乙酰胆碱（ACh）的反应可作为内皮完整性的功能指标37,38。在健康血管中，ACh 引发的血管舒张反应通过一氧化氮（NO）介导的松弛作用反映内皮功能。然而，在病理状态下，由于一氧化氮（NO）生物利用度降低和/或受体信号通路改变，该反应可能减弱或消失。
  6. 用 10-4 M 的 Phe 预收缩血管，向含有 5 mL 克雷布斯缓冲液的腔室中加入 5 µL 的 Phe 储备液（10-1 M），孵育 15 分钟。从最低浓度的 ACh 开始，向腔室中加入 5 µL 的 ACh 储备液（10-5 M），持续监测并等待血管舒张反应（通过持续的轨迹变化确认），标记该点，然后进行下一浓度。重复此过程直至完成所有浓度测试（图 7）。
  7. 实验结束后保存文件并取出动脉环。彻底清洁腔室：先加入 10 mL 8% 醋酸溶液孵育 3 分钟，再用 10 mL 水冲洗 3 次；接着用 10 mL 95% 乙醇孵育 3 分钟，再次用 10 mL 水冲洗 3 次。最后关闭加热器和气体供应，在关闭气体前确保所有液体已排尽。

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结果

在人体肾脏中，叶间动脉沿肾锥体之间走行，并与其相应的静脉伴行。该动脉具有相对较厚的血管壁和大量脂肪组织包绕，因此需要特别仔细地进行分离。在分离过程中，应细致地去除周围的脂肪组织，以避免施加过大的力量（图1C）。

弓形动脉在解剖学上位于皮质髓质交界处，沿肾锥体外缘形成特征性的半圆形弓状结构。与叶间动脉相比，其血管壁较薄。在分离过程中，由于该动脉具有弯曲的形态，去除周围实质组织时需格外小心。解剖操作应系统地沿整个弓形长度逐步清除外层膜结构及周边实质组织。必须特别注意同时彻底清除动脉两侧的实质组织，因为若清除不完全，游离后的动脉可能向未清除侧弯曲，从而影响后续实验操作（图1C）。

小叶间动脉以线性路径穿过肾皮质，其血管壁相对较薄。由于该动脉与周围皮质组织紧密相连，在解剖过程中需特别小心，避免过度修剪而损害血管完整性。保留外层膜结构至关重要，因为其损伤可能显著影响后续实验操作。解剖时应采用轻柔的技术，在仔细分离动脉与...

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讨论

肾灌注稳定性既是关键的治疗靶点，也是了解血流动力学病理生理学的重要窗口39,40。本文介绍一种从新鲜肾切除标本中分层分离并进行人肾动脉功能评估的实验方案，填补了当前方法学上的重要空白。与仅限于尸体标本或动物模型的现有方法不同，本技术能够可靠地分离出具有活性的肾内动脉（从叶间动脉到小叶间动脉），同时保持其形态完整性和生理功能。这一进展建立了一个高保真的实验平台，可用于研究人类肾血管生物学机制以及潜在治疗药物的筛选。

该方案的有效性取决于若干关键步骤。首先，将根治性肾切除术获取的肾组织立即浸入冰冻的克雷布斯液中，并在6小时内完成血管分离，可最佳地保持血管反应性。其次，我们采用的特殊显微解剖技术在确保完全去除血管周围脂肪组织的同时，最大限度地减少内皮损伤；考虑到脂肪组织在调节血管收缩与舒张功能中的作用，这一操作尤为关键41,42,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢志愿者参与本研究，同时感谢北京大学第一医院泌尿外科手术团队提供肾组织。本研究获得北京市自然科学基金（F251013 资助 Y. Z.，7232096 资助 Y. L.）；国家自然科学基金（82325004、92168114 资助 Y. Z.，82170422 资助 Y. L.）；国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2021YFF0501401，2018YFA0800501 至 Y. Z.，2021YFF0501404 至 Y. L.，2023YFC2415500 至 L. Y.）；北京大学第三医院血管稳态与重构国家重点实验室研究项目（北京大学；2024-VHR-SY-07 至 Y. Z.）；2023 年北京市卫生健康委员会首都医学科技与创新成果转化优秀推广项目（YC202301QX0162 至 L. Y.）；国家高水平医院临床研究资助（北京大学第一医院科技成果转化孵化引导基金项目，2024CX24 至 L. Y.）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化乙酰胆碱Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyA6625
黑色底部培养皿Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark300412
CaCl2生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A501330
D-葡萄糖生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A610219
杜蒙特镊子Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark300413
盖德解剖剪Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark400431
导丝Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark400447直径 40 µm
KCl生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A100395
KH2PO4生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A100781
LabChart Professional 版本 8.3 ADInstruments, Australia-
MgCl2·6H2O生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A100288
多通道肌张力测量系统 Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark620M
NaCl生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A100241
NaHCO3生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海A100865
去氧肾上腺素Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP6126

参考文献

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