本文介绍了一种用于分离和功能评估人肾动脉分支的逐步实验方案，可促进药物开发的临床前研究。
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本文内容
摘要
摘要
肾血管功能障碍在多种临床疾病的发病机制中起着关键作用，包括急性肾损伤、肾缺血和高血压，这给临床管理带来重大挑战，并对患者预后产生不利影响。分离并进行肾内动脉的功能表征，对于阐明肾血管功能障碍（特别是与肾脏损伤相关）的潜在机制以及指导靶向治疗策略的开发至关重要。尽管其具有重要的临床意义，但目前仍缺乏针对不同分支水平的人类肾内动脉进行标准化分离与功能评估的系统方法。本实验方案提供了一个全面的框架，用于系统性地分离肾内动脉分支，并在生理和病理条件下对其进行多模态的功能与结构评估。该方法包括三个关键组成部分：（1）从供体肾脏中精确解剖识别并显微分离肾内动脉，同时采用苏木精-伊红（H&E）染色进行结构验证；（2）在丝肌动描记法（wire myography）中实施严格的归一化操作流程，以提高测量的可重复性与可靠性；（3）利用高精度丝肌动描记技术对血管运动反应进行定量分析。归一化过程基于肌肉长度-张力关系，通过逐步拉伸动脉节段，确定最佳静息张力，以实现肌动蛋白与肌球蛋白的最大重叠，从而获得最强的收缩反应。在丝肌动描记实验中，将分离的血管节段悬挂于两根平行金属丝之间，以精确测量血管张力。通过实施严格的归一化流程，该技术能够在多种病理生理状态及药理干预条件下，实现对血管反应性的可重复且可靠的定量分析。
引言
肾脏是维持人体内环境稳态的重要器官，通过清除代谢废物、调节电解质平衡和体液平衡来实现其功能，这些功能需要极高的血流量支持。在生理状态下，肾脏每分钟接收的心输出量约占心脏泵血总量的25%，凸显了其在全身血流中的重要地位以及肾灌注在维持整体生理平衡中的关键作用1肾动脉系统精确调节这种大量的血液输送，以维持肾小球滤过率（GFR） 同时适应全身血流动力学变化。因此，肾灌注受损是一种关键的病理机制，可导致急性肾损伤和肾缺血等情况下肾小球滤过率（GFR）下降。此外，它常继发于影响肾血流的全身性疾病，包括休克、心脏功能障碍和脓毒症。2,3,4,5肾动脉在肾脏内依次分支，首先分为叶间动脉，穿过髓质锥体之间的肾柱走行。到达皮髓质交界处时，这些血管发出弓形动脉，沿皮质与髓质交界的边界呈弓状走行。从这些弯曲的血管发出小叶间动脉，呈放射状深入皮质实质，最终将血液输送至肾小球毛细血管。 通过 传入小动脉以灌注单个肾单位1,6,7肾内叶间动脉、弓....
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方案
本方案及所述示例已通过北京大学第一医院泌尿外科伦理审查（批准号：2023yan500-002），并依照《赫尔辛基宣言》的规定执行。所有参与者在参与前均签署了书面知情同意书。
1. 溶液配制
- 配制含有 119.0 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4 和 11.0 mM D-葡萄糖、pH 为 7.4 的 Krebs-Ringer 溶液（Krebs）。
- 配制含有 64.0 mM NaCl、60 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.0 mM MgCl2、25.0 mM NaHCO3、1.2 mM KH2PO4 和 11.0 mM D-葡萄糖、pH 为 7.4 的高钾盐溶液（60K+）。
2. 试剂准备
注意：收到药物后应立即根据材料安全数据表（MSDS）中提供的说明进行储存。
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结果
在人体肾脏中，叶间动脉沿肾锥体之间走行，并与其相应的静脉伴行。该动脉具有相对较厚的血管壁和大量脂肪组织包绕，因此需要特别仔细地进行分离。在分离过程中，应细致地去除周围的脂肪组织，以避免施加过大的力量（图1C）。
弓形动脉在解剖学上位于皮质髓质交界处，沿肾锥体外缘形成特征性的半圆形弓状结构。与叶间动脉相比，其血管壁较薄。在分离过程中，由于该动脉具有弯曲的形态，去除周围实质组织时需格外小心。解剖操作应系统地沿整个弓形长度逐步清除外层膜结构及周边实质组织。必须特别注意同时彻底清除动脉两侧的实质组织，因为若清除不完全，游离后的动脉可能向未清除侧弯曲，从而影响后续实验操作（图1C）。
小叶间动脉以线性路径穿过肾皮质，其血管壁相对较薄。由于该动脉与周围皮质组织紧密相连，在解剖过程中需特别小心，避免过度修剪而损害血管完整性。保留外层膜结构至关重要，因为其损伤可能显著影响后续实验操作。解剖时应采用轻柔的技术，在仔细分离动脉与.......
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讨论
肾灌注稳定性既是关键的治疗靶点，也是了解血流动力学病理生理学的重要窗口39,40。本文介绍一种从新鲜肾切除标本中分层分离并进行人肾动脉功能评估的实验方案，填补了当前方法学上的重要空白。与仅限于尸体标本或动物模型的现有方法不同，本技术能够可靠地分离出具有活性的肾内动脉（从叶间动脉到小叶间动脉），同时保持其形态完整性和生理功能。这一进展建立了一个高保真的实验平台，可用于研究人类肾血管生物学机制以及潜在治疗药物的筛选。
该方案的有效性取决于若干关键步骤。首先，将根治性肾切除术获取的肾组织立即浸入冰冻的克雷布斯液中，并在6小时内完成血管分离，可最佳地保持血管反应性。其次，我们采用的特殊显微解剖技术在确保完全去除血管周围脂肪组织的同时，最大限度地减少内皮损伤；考虑到脂肪组织在调节血管收缩与舒张功能中的作用，这一操作尤为关键41,42,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢志愿者参与本研究，同时感谢北京大学第一医院泌尿外科手术团队提供肾组织。本研究获得北京市自然科学基金（F251013 资助 Y. Z.，7232096 资助 Y. L.）；国家自然科学基金（82325004、92168114 资助 Y. Z.，82170422 资助 Y. L.）；国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2021YFF0501401，2018YFA0800501 至 Y. Z.，2021YFF0501404 至 Y. L.，2023YFC2415500 至 L. Y.）；北京大学第三医院血管稳态与重构国家重点实验室研究项目（北京大学；2024-VHR-SY-07 至 Y. Z.）；2023 年北京市卫生健康委员会首都医学科技与创新成果转化优秀推广项目（YC202301QX0162 至 L. Y.）；国家高水平医院临床研究资助（北京大学第一医院科技成果转化孵化引导基金项目，2024CX24 至 L. Y.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化乙酰胆碱 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | A6625 | |
| 黑色底部培养皿 | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 300412 | |
| CaCl2 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A501330 | |
| D-葡萄糖 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A610219 | |
| 杜蒙特镊子 | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 300413 | |
| 盖德解剖剪 | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 400431 | |
| 导丝 | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 400447 | 直径 40 µm |
| KCl | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A100395 | |
| KH2PO4 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A100781 | |
| LabChart Professional 版本 8.3 | ADInstruments, Australia | - | |
| MgCl2·6H2O | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A100288 | |
| 多通道肌张力测量系统 | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 620M | |
| NaCl | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A100241 | |
| NaHCO3 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | A100865 | |
| 去氧肾上腺素 | Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany | P6126 |
参考文献
- Molema, G., Aird, W. C. Vascular heterogeneity in the kidney. Semin Nephrol. 32 (2), 145-155 (2012).
- Jentzer, J. C., et al. Contemporary management of severe acute kidney injury and refractory cardiorenal syndrome: Jacc council perspectives.
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重印与许可
