抑制肽的设计与应用以实现快速 体外 特定位点翻译后修饰水平的下调

摘要

本文介绍了一种实验方案，概述了TAT-PIP（一种翻译后修饰抑制肽）的设计规范、质量控制标准及其功能验证体系。

摘要

蛋白质是生命活动的主要执行者，其功能在转录、翻译以及翻译后修饰（PTM）水平上受到调控。其中，翻译后修饰对蛋白质活性的调控机制更为复杂，因为一种蛋白质通常具有多种类型的翻译后修饰，并且每种修饰可能发生在多个位点。在所有已鉴定的修饰位点中筛选功能重要的PTM位点时，可采用质粒转染、慢病毒或腺病毒等方法；然而，这些方法常面临细胞和组织转导效率低、耗时长、成本高以及潜在免疫反应等挑战。为解决这些问题，我们近期开发并成功应用了一类重组肽，称为TAT-PIP，即与TAT融合的翻译后修饰抑制肽（PTM inhibitory peptide）。TAT-PIP由两部分组成：TAT模块可促进其进入细胞和组织，PIP模块则通过竞争性结合特异性抑制目标位点的翻译后修饰。本文提供了一套完整的TAT-PIP设计规范、质量控制标准及功能验证体系的操作方案。在设计部分，我们阐述了TAT-PIP的一致性、可选长度、特异性和保守性等关键参数。随后，介绍了TAT-PIP的质量检测要求，以确保其有效性和安全性。在TAT-PIP的应用部分，我们说明了TAT-PIP的浓度梯度测试、待测细胞的孵育过程以及后续的表型检测方法。综上所述，我们描述了一种通过选择性敲低特定修饰位点并观察其引起的表型变化来推断该位点功能的有效筛选方法。由于该方法合成成本低、效率高，克服了质粒转染等现有技术的诸多局限性。

引言

蛋白质是生命活动的主要执行者，其生物学调控过程涉及基因表达调控的两个核心方面——基因转录和mRNA翻译。然而，在过去的几十年中，翻译后修饰（PTM）已成为调控细胞功能的另一不可或缺的机制¹。磷酸化是研究人员最熟知的PTM，在生理功能中具有特别重要的作用。例如，细胞外信号调节激酶（ERK）在Thr202和Tyr204位点被MEK激酶磷酸化后，其构象发生改变，暴露出活性位点，从而激活下游靶蛋白（如转录因子）²。相反，当GSK-3β的N端Ser9位点被Akt/PKB激酶磷酸化时，其底物结合口袋被阻断，导致激酶活性丧失³。泛素化是另一种重要的PTM，通过将泛素分子共价连接到底物蛋白上来调控多种细胞过程。泛素含有7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）和一个N端甲硫氨酸（M1）。在不同位点形成的泛素链赋予底物蛋白不同的命运。K48连接的泛素化主要功能是标记底物蛋白，使其被蛋白酶体降解⁴。相反，K63连接的泛素化主要参与非降解性信号转导，如DNA损伤修复、炎症反应和内吞作用⁵。近年来，随着蛋白质组学技术的快速发展，越来越多的新型PTM被发现。除了经典的乙酰化外，还鉴定出丙酰化、巴豆酰化和戊二酰化等新型酰化修饰⁶。在组蛋白修饰领域，组蛋白乳酸化可干扰RNA m⁶A修饰及免疫微环境的稳态⁷。在非组蛋白修饰领域，ATP5O巴豆酰化的减少是磷脂代谢下调的主要不利因素⁸。

进行翻译后修饰研究需要系统性地推进翻译后修饰蛋白质组的分析⁹该领域包含两个主要研究方向：在全蛋白质组水平上分析翻译后修饰（PTM）谱型，以及全面鉴定特定蛋白质的PTM位点。尽管现代质谱技术能够有效识别多种类型的PTM及其具体位点，但关键功能位点的筛选与验证仍是制约研究进展的核心科学难题。建立高效的位点筛选策略是解析关键调控位点功能的第一步。传统方法包括针对特定位点构建突变质粒（失活突变、激活突变），并通过转染将这些质粒导入靶细胞 体外 转染技术，并系统评估细胞增殖、凋亡和氧化应激等表型指标的变化。然而，该策略在转录沉默的细胞模型（如卵母细胞和原代组织培养系统）中面临显著的技术障碍。尽管慢病毒或腺病毒转导系统可在一定程度上克服转染效率低的问题，但其应用仍面临双重挑战：高昂的经济成本和病毒颗粒的转导效率低下 体外 组织模型。尽管构建突变敲入小鼠的策略具有极长的周期且成本高昂。总体而言，迫切需要开发经济高效的策略，用于功能重要PTM位点的初步筛选。

近年来，我们的团队成功开发并应用了一种基于多肽竞争性抑制的快速翻译后修饰下调技术——TAT-PIP（TAT偶联的翻译后修饰抑制性多肽）。该技术的核心优势在于其通用性和高效性，可用于功能重要翻译后修饰位点的初步筛选，为深入解析关键翻译后修饰位点的分子机制提供了重要基础。本研究系统阐述了TAT-PIP的基本框架与实施流程，并通过代表性实验数据展示了其在调控特定位点翻译后修饰水平方面的有效性。

方案

1. 设计 TAT-PIP 序列

注意：TAT-PIP 由两种肽段组成（图1）：N端部分为TAT，CYGRKKRRQRRR，该序列在所有TAT-PIP中保持不变，有助于高效进入 体外 培养的细胞或 体内 组织；C端部分是围绕特定PTM位点的多肽序列（图1，通常为符号表示的赖氨酸 "K"，红色高亮）的靶蛋白。PIP 的长度约为 10–15 个氨基酸残基（若过长，则成本增加；若过短，则特异性显著降低）。

1. 通过 Blast 分析优化 PIP 序列（图 2）。
   1. 登录 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，点击蛋白质序列的 blastp 搜索。
   2. 将目标蛋白序列复制到 输入查询序列 窗口中。
   3. 在 选择搜索 中，选择 标准数据库 选项。在程序选择中，选择 blastp（蛋白质-蛋白质 BLAST）选项。最后，点击 BLAST 按钮（图 2B）。
   4. 选择特异性最高的肽段作为候选 PIP。
2. 对最终选定的 PIP 进行人和小鼠之间的同源性比对。
   1. 登录 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，点击蛋白质序列的 blastp 搜索。
   2. 复制人和小鼠来源的蛋白序列，并粘贴至输入序列框中。
   3. 点击提交按钮以获取结果。
   4. 选择在人和小鼠之间具有 100% 同源性的 PIP（图 2C）。
3. 确定 TAT-PIP 的组成，其由 N 端的 TAT 和 C 端的 PIP 构成。

2. TAT-PIP 的合成与质量验证

1. 选择一家具有丰富项目经验的公司，以确保多肽纯度不低于98%（经质谱验证），避免可能影响后续实验的杂质。
   注意：多肽的内毒素水平应≤10，且应无病原体。

3. TAT-PIP 的应用

1. 使用无病原体的超纯水溶解 TAT-PIP，配制浓度为 10 mg/mL 的储存液。将储存液分装至小管中，避免反复冻融，以免引起部分变性。
   注意：添加 1% 二甲基亚砜（DMSO）有助于保护 TAT-PIP 的结构。
2. 用 TAT-PIP 处理细胞。
   1. 在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基中，于标准培养条件下（37 °C，5% CO₂）培养人胚肾 293T 细胞。
      注意：接种后细胞培养约 12 小时，当细胞融合度达到约 70% 时进行 TAT-PIP 处理。
   2. 用 PBS 将溶解的 TAT 稀释至 1 mg/mL，然后按适当剂量直接加入细胞培养基中处理 24 小时（推荐培养基终浓度：0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL）。
   3. 用原始培养基洗涤细胞 3 次。
   4. 进行蛋白质印迹分析，以验证 PTM 下调的程度。
      注意：根据经验及后续实验结果，TAT-PIP 的最佳终浓度为 0.1 mg/mL。

4. 蛋白质印迹

1. 制备细胞蛋白样品。
   1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次，向细胞沉淀中加入200 µL强放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（含苯甲基磺酰氟[PMSF]蛋白酶抑制剂），冰上孵育5分钟进行初步裂解，用细胞刮刀刮下细胞。
   2. 使用超声破碎仪在12%能量强度下超声处理5秒。
   3. 将细胞裂解液在冰上冷却30分钟，然后在4 °C下以13400 g离心10分钟。
   4. 将含有蛋白的上清液转移至预冷的1.5 mL离心管中。向上清液中加入1/4体积的5x 上样缓冲液（终浓度为1x）。
   5. 涡旋混匀，于干式恒温仪中95 °C加热5分钟，再在冰上冷却2分钟。
   6. 使用Bradford法在Nanodrop上测定总蛋白浓度。
2. 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
   1. SDS-PAGE使用12%分离胶和4%浓缩胶。
   2. 根据指定体积将蛋白样品加入加样孔中。
   3. 开启电泳仪，先以80 V、300 mA恒压电泳30分钟，使条带迁移至浓缩胶与分离胶界面处；随后以120 V、300 mA恒压电泳45分钟，以分离蛋白。
   4. 使用快速转膜装置将凝胶中的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
3. 进行封闭、抗体孵育及显影。
   1. 用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）配制的5%脱脂奶粉溶液封闭PVDF膜，在室温下孵育1小时。
   2. 将一抗按1:1000比例用5%脱脂奶粉/PBST稀释后，于4 °C旋转孵育过夜。
   3. 用TBST洗涤膜3次，每次10分钟。
   4. 将二抗按1:1000比例用5%脱脂奶粉/TBST稀释后，在室温下孵育1小时。
   5. 用TBST洗涤膜3次，每次10分钟。
   6. 将膜置于电化学发光（ECL）成像仪中进行时间梯度曝光（5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、120秒），以获得最佳成像结果。

5. TAT-PIP 功能验证 体外 培养细胞

1. 检测细胞内活性氧（ROS）水平。
   1. 将293T细胞以每孔1× 10⁵个细胞的适宜密度接种于24孔培养板中。
   2. 用TAT偶联的组蛋白H3赖氨酸116巴豆酰化抑制肽（THCIP）（0.1 mg/mL）处理细胞24小时，然后用PBS洗涤细胞。
   3. 在无血清DMEM中加入10 µM二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），于37 °C避光孵育20分钟。
   4. 使用倒置荧光显微镜拍摄图像，并利用ImageJ软件中的Measure功能测定荧光强度。
      注：使用FITC滤光片组，发射滤光片为465–495 nm，二向色镜为505A，第二发射滤光片为512–550 nm。
2. 细胞增殖检测
   1. 将293T细胞以每孔1× 10⁵个细胞的适宜密度接种于24孔培养板中。
   2. 向每孔加入10 µL CCK-8试剂。
   3. 于37 °C孵育2小时。
   4. 使用酶标仪在450 nm处记录吸光度，并从空白孔（培养基 + CCK-8）中扣除背景信号。
   5. 对数据进行归一化处理以计算细胞活力。
3. 细胞内ATP水平检测
   1. 使用裂解缓冲液裂解细胞，于4 °C以12,000 × g离心5分钟，收集上清液用于后续分析。
   2. 用裂解缓冲液稀释ATP标准品溶液，配制浓度梯度为0.5 µM、1 µM、2 µM、3 µM、4 µM和5 µM的标准溶液。
   3. 向含有细胞上清液或ATP标准品的各孔中加入20 µL ATP检测溶液。
   4. 立即使用酶标仪检测发光信号。
      1. 点击Plate Layout，在Change Plate Template中选择相应的板模板以设置样品（标准品和待测样品）。
      2. 然后点击左侧的Protocol，选择Chemiluminescence按钮，再点击Start开始检测。
   5. 根据ATP标准品的发光信号绘制标准曲线，并利用该曲线定量细胞上清液中的ATP浓度。

结果

本研究描述了一种基于竞争性抑制的策略，利用TAT-PIP在特定位点下调目标蛋白的PTM水平。在一个典型示例中，此处的TAT-PIP被特异性地重命名为THCIP。它包含两个功能模块：（1）位于N端的细胞穿透肽TAT（CYGRKKRRQRRR），使THCIP能够穿透细胞；（2）组蛋白H3在K116位点周围的C端序列AIHAKRVTIMPKD，可特异性地与内源性H3竞争在K116位点发生巴豆酰化修饰（图2A）。针对该位点的特异性抗体命名为H3crHS（组蛋白H3第116位赖氨酸巴豆酰化抗体）。

THCIP 的设计过程如下：从目标 PTM 位点的侧翼序列中选取 15–20 个氨基酸作为功能结构域，并根据以下生物信息学标准进行优化：（1）通过在小鼠蛋白质数据库中进行 BLAST 搜索，确认目标序列具有显著特异性（图 2B），以避免脱靶效应；（2）验证该区域在人和小鼠同源蛋白之间的序列保守性（图 2C），以确保其在人...

讨论

在本实验方案中，以下步骤至关重要。首先，TAT-PIP 的设计需解决该肽的特异性问题。其次，需优化其应用方式和终浓度；必须仔细测试优化后的浓度，以实现高效且快速的基因敲低效果。第三，为验证 TAT-PIP 的作用，建议进行多次实验，而非仅依靠单次实验来确认其额外效应。

与现有方法相比，该方法主要体现出三个优势：首先，与质粒转染及慢病毒或腺病毒感染相比，TAT-PIP 在进入各类细胞时均表现出持续高效的转导效率 & 组织；第二，TAT-PIP 在功能重要性翻译后修饰位点的初步筛选中优于其他策略；第三，与抑制剂相比，TAT-PIP 在抑制激酶活性方面具有更高的特异性。

本研究开发了THP，一种TAT-PIP，可选择性抑制HDAC2-S424磷酸化（不影响HDAC1-S421），从而提高ATP5O-K51的巴豆酰化水平，缓解慢性应激诱导的磷脂代谢紊乱。因此，THP有望应用于慢性应激（CS）女性体内异常代谢的临床治疗⁸。在另一项研究中，我们构建了iBPP，一种靶向p-BI...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
全自动多功能成像系统	Tanon	4600	曝光仪通过检测显影处理后膜上的荧光或化学发光信号，识别并可视化目标蛋白条带。
细胞计数试剂盒-8	GLPBIO	GK10001	该方法基于细胞代谢活性与细胞数量之间的相关性，通过测定细胞对CCK-8试剂的还原能力来评估细胞的增殖能力。
Dulbecco’s 改良Eagle’s 培养基 (DMEM)	Gibco	11995065	Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）是一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种哺乳动物细胞的生长。
ECL化学发光底物	Biosharp	BL520B	ECL底物通过化学发光反应产生光信号，从而实现对特定蛋白质或核酸的检测。
电泳装置	Tanon	EPS600	电泳装置的主要作用是分离和分析生物大分子‌
增强型ATP检测试剂盒	Beyotime	S0027	该试剂盒可有效检测样品中的ATP水平
胎牛血清 (FBS)	Gibco	16000-044	胎牛血清（FBS）为细胞的维持和生长提供必需的营养物质和生长因子。
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	该设备效率高，可在15分钟内快速实现蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶向PVDF膜的转移
倒置荧光显微镜	Olympus Corporation	IX73	荧光显微镜以紫外光为光源照射被检物体，使其发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形态和位置。
NanoDrop2000微量紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	2000	NanoDrop用于测定DNA或RNA的浓度
PVDF膜	BioRAD	1620177	此类PVDF膜具有优异的化学耐受性和高蛋白结合能力
活性氧检测试剂盒	Beyotime	S0033S	该试剂盒可准确检测细胞内活性氧的水平
TAT偶联H3K16巴豆酰化抑制肽	Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD	CN218107533U	它可特异性地与内源性H3在K16位点的巴豆酰化竞争
TBST缓冲液	Biosharp	BL602A	TBST可清除膜上的非特异性物质，减少实验误差，确保实验结果的准确性‌
超声破碎仪	LICHEN	LC-AUD-150P	该仪器的主要功能包括细胞破碎、颗粒分散和乳化
Varioskan LUX多功能微孔板读数仪	Thermo Fisher	VL0000D0	微孔板读数仪通过检测微孔板中样品的光学信号（如吸光度、荧光或发光），实现对生物样品的高通量定量分析