本文介绍了一种实验方案,概述了TAT-PIP(一种翻译后修饰抑制肽)的设计规范、质量控制标准及其功能验证体系。
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本文介绍了一种实验方案,概述了TAT-PIP(一种翻译后修饰抑制肽)的设计规范、质量控制标准及其功能验证体系。
蛋白质是生命活动的主要执行者,其功能在转录、翻译以及翻译后修饰(PTM)水平上受到调控。其中,翻译后修饰对蛋白质活性的调控机制更为复杂,因为一种蛋白质通常具有多种类型的翻译后修饰,并且每种修饰可能发生在多个位点。在所有已鉴定的修饰位点中筛选功能重要的PTM位点时,可采用质粒转染、慢病毒或腺病毒等方法;然而,这些方法常面临细胞和组织转导效率低、耗时长、成本高以及潜在免疫反应等挑战。为解决这些问题,我们近期开发并成功应用了一类重组肽,称为TAT-PIP,即与TAT融合的翻译后修饰抑制肽(PTM inhibitory peptide)。TAT-PIP由两部分组成:TAT模块可促进其进入细胞和组织,PIP模块则通过竞争性结合特异性抑制目标位点的翻译后修饰。本文提供了一套完整的TAT-PIP设计规范、质量控制标准及功能验证体系的操作方案。在设计部分,我们阐述了TAT-PIP的一致性、可选长度、特异性和保守性等关键参数。随后,介绍了TAT-PIP的质量检测要求,以确保其有效性和安全性。在TAT-PIP的应用部分,我们说明了TAT-PIP的浓度梯度测试、待测细胞的孵育过程以及后续的表型检测方法。综上所述,我们描述了一种通过选择性敲低特定修饰位点并观察其引起的表型变化来推断该位点功能的有效筛选方法。由于该方法合成成本低、效率高,克服了质粒转染等现有技术的诸多局限性。
蛋白质是生命活动的主要执行者,其生物学调控过程涉及基因表达调控的两个核心方面——基因转录和mRNA翻译。然而,在过去的几十年中,翻译后修饰(PTM)已成为调控细胞功能的另一不可或缺的机制1。磷酸化是研究人员最熟知的PTM,在生理功能中具有特别重要的作用。例如,细胞外信号调节激酶(ERK)在Thr202和Tyr204位点被MEK激酶磷酸化后,其构象发生改变,暴露出活性位点,从而激活下游靶蛋白(如转录因子)2。相反,当GSK-3β的N端Ser9位点被Akt/PKB激酶磷酸化时,其底物结合口袋被阻断,导致激酶活性丧失3。泛素化是另一种重要的PTM,通过将泛素分子共价连接到底物蛋白上来调控多种细胞过程。泛素含有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)和一个N端甲硫氨酸(M1)。在不同位点形成的泛素链赋予底物蛋白不同的命运。K48连接的泛素化主要功能是标记底物蛋白,使其被蛋白酶体降解4。相反,K63连接的泛素化主要参与非降解性信号转导,如DNA损伤修复、炎症反应和内吞作用5。近年来,随着蛋白质组学技术的快速发展,越来越多的新型PTM被发现。除了经典的乙酰化外,还鉴定出丙酰化、巴豆酰化和戊二酰化等新型酰化修饰6。在组蛋白修饰领域,组蛋白乳酸化可干扰RNA m6A修饰及免疫微环境的稳态7。在非组蛋白修饰领域,ATP5O巴豆酰化的减少是磷脂代谢下调的主要不利因素8。
进行翻译后修饰研究需要系统性地推进翻译后修饰蛋白质组的分析9该领域包含两个主要研究方向:在全蛋白质组水平上分析翻译后修饰(PTM)谱型,以及全面鉴定特定蛋白质的PTM位点。尽管现代质谱技术能够有效识别多种类型的PTM及其具体位点,但关键功能位点的筛选与验证仍是制约研究进展的核心科学难题。建立高效的位点筛选策略是解析关键调控位点功能的第一步。传统方法包括针对特定位点构建突变质粒(失活突变、激活突变),并通过转染将这些质粒导入靶细胞 体外 转染技术,并系统评估细胞增殖、凋亡和氧化应激等表型指标的变化。然而,该策略在转录沉默的细胞模型(如卵母细胞和原代组织培养系统)中面临显著的技术障碍。尽管慢病毒或腺病毒转导系统可在一定程度上克服转染效率低的问题,但其应用仍面临双重挑战:高昂的经济成本和病毒颗粒的转导效率低下 体外 组织模型。尽管构建突变敲入小鼠的策略具有极长的周期且成本高昂。总体而言,迫切需要开发经济高效的策略,用于功能重要PTM位点的初步筛选。
近年来,我们的团队成功开发并应用了一种基于多肽竞争性抑制的快速翻译后修饰下调技术——TAT-PIP(TAT偶联的翻译后修饰抑制性多肽)。该技术的核心优势在于其通用性和高效性,可用于功能重要翻译后修饰位点的初步筛选,为深入解析关键翻译后修饰位点的分子机制提供了重要基础。本研究系统阐述了TAT-PIP的基本框架与实施流程,并通过代表性实验数据展示了其在调控特定位点翻译后修饰水平方面的有效性。
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1. 设计 TAT-PIP 序列
注意:TAT-PIP 由两种肽段组成(图1):N端部分为TAT,CYGRKKRRQRRR,该序列在所有TAT-PIP中保持不变,有助于高效进入 体外 培养的细胞或 体内 组织;C端部分是围绕特定PTM位点的多肽序列(图1,通常为符号表示的赖氨酸 "K",红色高亮)的靶蛋白。PIP 的长度约为 10–15 个氨基酸残基(若过长,则成本增加;若过短,则特异性显著降低)。
2. TAT-PIP 的合成与质量验证
3. TAT-PIP 的应用
4. 蛋白质印迹
5. TAT-PIP 功能验证 体外 培养细胞
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本研究描述了一种基于竞争性抑制的策略,利用TAT-PIP在特定位点下调目标蛋白的PTM水平。在一个典型示例中,此处的TAT-PIP被特异性地重命名为THCIP。它包含两个功能模块:(1)位于N端的细胞穿透肽TAT(CYGRKKRRQRRR),使THCIP能够穿透细胞;(2)组蛋白H3在K116位点周围的C端序列AIHAKRVTIMPKD,可特异性地与内源性H3竞争在K116位点发生巴豆酰化修饰(图2A)。针对该位点的特异性抗体命名为H3crHS(组蛋白H3第116位赖氨酸巴豆酰化抗体)。
THCIP 的设计过程如下:从目标 PTM 位点的侧翼序列中选取 15–20 个氨基酸作为功能结构域,并根据以下生物信息学标准进行优化:(1)通过在小鼠蛋白质数据库中进行 BLAST 搜索,确认目标序列具有显著特异性(图 2B),以避免脱靶效应;(2)验证该区域在人和小鼠同源蛋白之间的序列保守性(图 2C),以确保其在人...
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在本实验方案中,以下步骤至关重要。首先,TAT-PIP 的设计需解决该肽的特异性问题。其次,需优化其应用方式和终浓度;必须仔细测试优化后的浓度,以实现高效且快速的基因敲低效果。第三,为验证 TAT-PIP 的作用,建议进行多次实验,而非仅依靠单次实验来确认其额外效应。
与现有方法相比,该方法主要体现出三个优势:首先,与质粒转染及慢病毒或腺病毒感染相比,TAT-PIP 在进入各类细胞时均表现出持续高效的转导效率 & 组织;第二,TAT-PIP 在功能重要性翻译后修饰位点的初步筛选中优于其他策略;第三,与抑制剂相比,TAT-PIP 在抑制激酶活性方面具有更高的特异性。
本研究开发了THP,一种TAT-PIP,可选择性抑制HDAC2-S424磷酸化(不影响HDAC1-S421),从而提高ATP5O-K51的巴豆酰化水平,缓解慢性应激诱导的磷脂代谢紊乱。因此,THP有望应用于慢性应激(CS)女性体内异常代谢的临床治疗8。在另一项研究中,我们构建了iBPP,一种靶向p-BI...
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作者声明无任何利益冲突。
我们感谢实验室所有成员的热心帮助。本研究由国家重点项目研发计划&中国国家重点研发计划资助项目,项目负责人:Dong Zhang(项目编号:2022YFC2702202)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全自动多功能成像系统 | Tanon | 4600 | 曝光仪通过检测显影处理后膜上的荧光或化学发光信号,识别并可视化目标蛋白条带。 |
| 细胞计数试剂盒-8 | GLPBIO | GK10001 | 该方法基于细胞代谢活性与细胞数量之间的相关性,通过测定细胞对CCK-8试剂的还原能力来评估细胞的增殖能力。 |
| Dulbecco’s 改良Eagle’s 培养基 (DMEM) | Gibco | 11995065 | Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)是一种广泛使用的基础培养基,用于支持多种哺乳动物细胞的生长。 |
| ECL化学发光底物 | Biosharp | BL520B | ECL底物通过化学发光反应产生光信号,从而实现对特定蛋白质或核酸的检测。 |
| 电泳装置 | Tanon | EPS600 | 电泳装置的主要作用是分离和分析生物大分子 |
| 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 | 该试剂盒可有效检测样品中的ATP水平 |
| 胎牛血清 (FBS) | Gibco | 16000-044 | 胎牛血清(FBS)为细胞的维持和生长提供必需的营养物质和生长因子。 |
| GenScript eBlotL1 | GenScript | L00686 | 该设备效率高,可在15分钟内快速实现蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶向PVDF膜的转移 |
| 倒置荧光显微镜 | Olympus Corporation | IX73 | 荧光显微镜以紫外光为光源照射被检物体,使其发出荧光,然后在显微镜下观察物体的形态和位置。 |
| NanoDrop2000微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Scientific | 2000 | NanoDrop用于测定DNA或RNA的浓度 |
| PVDF膜 | BioRAD | 1620177 | 此类PVDF膜具有优异的化学耐受性和高蛋白结合能力 |
| 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S | 该试剂盒可准确检测细胞内活性氧的水平 |
| TAT偶联H3K16巴豆酰化抑制肽 | Nanjing Taopu Biotechnology Co. LTD | CN218107533U | 它可特异性地与内源性H3在K16位点的巴豆酰化竞争 |
| TBST缓冲液 | Biosharp | BL602A | TBST可清除膜上的非特异性物质,减少实验误差,确保实验结果的准确性 |
| 超声破碎仪 | LICHEN | LC-AUD-150P | 该仪器的主要功能包括细胞破碎、颗粒分散和乳化 |
| Varioskan LUX多功能微孔板读数仪 | Thermo Fisher | VL0000D0 | 微孔板读数仪通过检测微孔板中样品的光学信号(如吸光度、荧光或发光),实现对生物样品的高通量定量分析 |
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